Name: Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes Parhyale hawaiensis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a técnica de ablação de blastômeros em embriões de Parhyale hawaiensis para estudos de embriologia de crustáceos e biologia evolutiva. Este método permite investigar células precursoras da linhagem germinativa.

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Agradecemos Rayhan Arif e Hassaan Shahawy para trabalho de câmera, Tripti Gupta e Frederike Alwes de assistência refinar a técnica de ablação de células, e os membros do laboratório Extavour para feedback sobre os dados, vídeo e manuscrito. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Instituto de Células-Tronco de Harvard (Seed número Grant SG-0057-10-00) da Fundação Ellison Medical (New Scholar Award número AG-NS-07010-10) a CGE, e prêmios do Programa Escola de Pesquisa de Harvard para ARN.

Comentários que podem ser úteis na execução de certas etapas são indicados em itálico. 1. Dia 1: Preparação de Materiais <ol><li> Prepare os seguintes materiais (ver Tabela de Materiais e Equipamentos): <ul><li> 15 cm e 22 cm de pipetas de Pasteur </li><li> Escriba Diamante </li><li> Filtrou água do mar artificial (salinidade entre 0,0018-0,0020) contendo 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de uma solução de estoque de 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina (1:50 de uma solução de estoque contendo 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 mg / ml de estreptomicina) </li><li> filtrada água do mar artificial (salinidade entre ,0018-0,0020) sem aditivos </li><li> um recipiente de plástico grande para casais de habitação (pelo menos 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> pequeno (3 cm ou 5 cm), placas de Petri forradas com Sylgard </li><li> pequena (3 cm ou 5 cm), os pratos de Petri </li><li> um vidro de relógio ou de vidro multi-bem placa </li><li> fórceps (usamos uma pinça sem corte derivado from de idade Dumont # 5 fórceps que foram danificados acidentalmente em outros procedimentos laboratoriais, os quais têm reaproveitado utilizando uma pinça de pedra de afiar para garantir que as extremidades das pinças são lisas, que ambos os dentes são do mesmo comprimento, e que eles não têm pontas afiadas. Fórceps extremamente fina, como novas Dumont # 5 fórceps, são indesejáveis, pois podem ferir os embriões e / ou fêmeas). </li><li> uma pipeta Pasteur com o fim arregalou (veja o passo 1.2 abaixo) </li><li> uma ferramenta de recuperação de embrião constituído por um fio de tungsténio curvado fino incorporado na extremidade mais fina de uma pipeta de Pasteur (poderia ser substituída por uma alternativa implementar; ver 1.3 abaixo) </li><li> uma pipeta de boca, com uma pequena abertura (veja o passo 1.4) </li><li> uma agulha de vidro feito de um capilar de vidro puxado (veja o passo 1.5) </li></ul> Não há materiais tóxicos para os seres humanos são utilizados neste protocolo. No entanto, os pesquisadores devem garantir que eles usam luvas ou outras vestimentas de proteção, conforme exigido pelo guidel gestão de riscoines da sua instituição. </li><li> Para fazer com que a pipeta Pasteur alargado, primeiro pontuação em torno de uma pipeta de Pasteur 15 centímetros no ponto em que a pipeta começa a diminuir com um estilete de diamante, embrulhar a região marcado da pipeta numa toalha de papel Kimwipe ou para proteger os dedos, e, em seguida, cuidadosamente romper a ponta na linha de pontuação. Segure a extremidade quebrada da pipeta sobre a chama do queimador de Bunsen por alguns segundos para suavizar as bordas. A abertura deve ser ligeiramente mais estreito do que a largura máxima da pipeta. </li><li> Para fazer com que a ferramenta de dissecação de arame de tungsténio, inserir um fio de tungsténio para dentro da extremidade de 15 centímetros uma pipeta de Pasteur de vidro, e mantenha rapidamente ao longo de um queimador de chama de Bunsen para fundir o vidro, a fixação do fio no lugar. Use uma pinça de curva suavemente a extremidade do fio para uma forma de gancho. Ver Figura 3 para um exemplo de uma forma adequada para esta ferramenta. </li><li> Para fazer uma pequena abertura para a pipeta de boca, puxe a ponta fina de uma pipeta Pasteur 22 centímetros em duas peças over uma chama, e quebrar a ponta da ponta pequena. Inserir a extremidade do suporte da pipeta a boca. </li><li> Fazer a agulha de vidro que vai ser utilizado para perfurar os blastómeros de interesse durante o processo de ablação com um extractor de agulha. Uma agulha em forma adequada é mostrado na Figura 4. Esta agulha foi retirado em um extrator de agulhas Sutter P97 usando um programa com os parâmetros 2x (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 20, tempo = 250) + 1X (calor = 566, puxar = 100, velocidade = 100, time = 250). O programa e instrumento específico usado para fazer a agulha pode variar, mas a agulha deve ter uma ponta fina, mas também ser resistente o suficiente para não quebrar quando empurrado contra o córion do embrião. </li></ol> 2. Dia 1: Casais Gathering Parhyale Acasalamento <ol><li> Use a pipeta Pasteur ampliou (passo 1.2 acima) para coletar acasalamento P. casais hawaiensis do grande recipiente de cultura, e transferi-los para um recipiente contendo separado cinclinar-se a água do mar artificial. Não é necessário que esta água do mar ser filtrada. É melhor recolher pares conjugadas no fim da tarde e deixar os casais à temperatura ambiente (20-23 ° C) durante a noite, de modo que, na manhã seguinte, a maioria dos embriões foram recentemente fertilizados e depositado, e, assim, a clivagem inicial fases apropriado para ablação. Reúna pelo menos 20 pares de acasalamento para assegurar que algumas fêmeas estará carregando embriões em estágio inicial de clivagem pela manhã seguinte. </li></ol> 3. Dia 2: Encontro Parhyale Embriões <ul><li> Na manhã seguinte, filtrou-infundir água do mar artificial (FASW) com CO 2. Algumas das mulheres terá nadado livre de seus homens durante a noite, recolhendo estas fêmeas separados e anestesiar-los em FASW / CO 2. Os restantes machos desemparelhados podem ser removidos do recipiente par de acoplamento e devolvido para a grande cultura. Pares de acasalamento restante pode ser guardado para coleta de embriões mais tardedurante o dia ou no dia seguinte. </li><li> Transferir uma única fêmea anestesiado transportar embriões para um vidro de relógio em FASW / CO 2. Todas as fêmeas separados, provavelmente, tenham depositado os ovos, que será visível a olho nu, como rosa pálido ou esferóides roxo através das placas coxal transparentes das mulheres (Figura 1A). Para determinar se os embriões estão em estágios iniciais de clivagem e, portanto, apropriado para a ablação de blastômeros, o pesquisador terá que remover os embriões da bolsa ninhada e examiná-las sob um microscópio. </li><li> Visualizando o procedimento sob um microscópio de dissecação, segure as placas da coxa ao longo de um lado do corpo com uma pinça. Os embriões serão visíveis na bolsa ninhada entre essas placas ventral da coxa (Figura 1B). </li><li> Insira a ferramenta de arame fino e curvo (Figura 3; passo 1.3 acima) na extremidade posterior da bolsa ninhada, e levante cuidadosamente o fio no final anterior da bolsa incubadora para separar a ninhadarevestimentos bolsa (estes são modificados apêndices ventrais chamados oostegites 30), abrindo a bolsa e soltando os embriões. Os embriões que estão dentro da primeira hora ou assim de ser colocado estão todos fechados dentro de uma membrana muito fina e transparente, que será facilmente perturbada pela ferramenta de arame, esta membrana desaparece por cerca de 2-3 horas após a postura de ovos, e os embriões não se limite uns com os outros ou para a fêmea de qualquer forma a partir deste ponto em diante todo embriogênese. Se os investigadores achar inconveniente ou difícil de manobrar a ferramenta de arame curvo para remover os embriões a partir da bolsa de ninhada, uma alternativa pode ser usado implementar, enquanto os movimentos são suaves e sem pressão dura é aplicado ao embrião ou ao marsúpios. Outras ferramentas apropriadas para a remoção de embriões da bolsa ninhada incluem pinças embotados ou um capilar de vidro com uma extremidade selada e suavizada. </li><li> Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para liberar água através da bolsa incubadora abriu, empurrando para fora tele embriões, o qual deve assentar no fundo do vidro de relógio. Transfira a fêmea para limpar FASW (sem CO 2) para permitir a recuperação antes de reintroduzir-la para a cultura principal. Várias fêmeas podem ser colocados no mesmo prato de recuperação, mas permitir que as fêmeas para se recuperar totalmente antes de devolvê-los à cultura principal, como eles podem ser comidos por outros animais, se eles ainda estão parcialmente anestesiado. </li><li> Use um inalterado pipeta Pasteur 15 centímetros para transferir os embriões para uma placa de Petri com FASW limpo e visualizar ao microscópio para determinar o seu estágio embrionário. Embriões separados que estão na terceira clivagem (fase 4 5), que são adequados para este procedimento. Deve também ser possível aplicar este protocolo para qualquer fase clivagem antes da formação do disco germe (encena 07-08 maio). </li></ul> 4. Dia 2: ablação de células individuais <ol><li> Preencha Sylgard-alinhado placa de Petri com uma camada superficial de FASW. Use um inalterado 15 centímetros Pasteur piPette para transferir um único embrião para a placa. </li><li> Usando fórceps rombas, rolar suavemente o embrião para identificar a célula a ser cauterizado (Figuras 2A e 2B). A linha germinal precursora g pode ser identificada como sendo a menor micrômetros, que fica no topo da menor Mav macromere. Além disso, g não contactar directamente a célula en, que é o micrômetros em frente, como os micrômeros mesoderme precursoras ml e share mr uma borda de célula no meio do embrião. Mr é a blastomere à direita de g, e mL é o micrômetros à esquerda de g. Os macromeres irmã de mr, ml, e en são os precursores ectoderma Er, EL, e Ep respectivamente. </li><li> Com uma pinça na ABLt lado, se o pesquisador é destro (ou na mão direita se o pesquisador é canhoto), orientar o embrião com a célula de interesse para a direita (ou à esquerda se o pesquisador é canhoto) e agarrar suavemente o embrião entre a pinça para estabilizá-la. </li><li> Usando uma agulha puxada vidro (passo 1.5 acima, a Figura 4), ​​punção suavemente a célula de interesse. Não inserir a agulha demasiado longe, de modo a não empurrar a agulha para dentro das células vizinhas ou abaixo da célula de interesse. A agulha tem apenas para perfurar o cório e membrana celular subjacente, e não precisa de estender profundamente para dentro da célula a ser cauterizado. </li><li> Troque a agulha usada para perfurar o embrião para o final de vidro de uma pipeta de boca com um bom puxado ponta da pipeta Pasteur (passo 1.4 acima). Segurar a ponta da pipeta para fechar o orifício criado na célula de interesse, e aplicar o vácuo muito suave. </li><li> Muito aperte delicadamente o embrião com a pinça. À medida que o conteúdo do blastomero é empurrado para fora do córion através do orifício criado na etapa 4.4, sugá-lo para a pipeta boca para permitir uma visão desobstruída do embrião. Se o orifício for suficientemente grande, o núcleo da célula perfurado pode ser visto a emergir também. Esta é uma boa verificação para certificar-se o conteúdo da célula inteiros foram removidos e não pode ser regenerada. </li><li> Observar atentamente o embrião como blastômeros de interesse é removido. A borda da célula perfurado vai recuar em direção ao buraco no córion, tornando as intersecções das células subjacentes visíveis. Continuar a aplicar pressão até que todo o blastómero de interesse tenha sido removido. Use uma pinça para a implantação do embrião de lado a lado e confirmar visualmente que todo o blastômeros de interesse é ido. </li><li> Usando um inalterado 15 centímetros pipetas de Pasteur, transferir o embrião para limpar FASW + (FASW + 1 mg / mL de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Levante embriões ablated-blastômeros em poços individuaisde um ambiente limpo placa 48 poços em FASW +, mudando 50% da FASW suplementados com antibiótico + diária. Em nossas mãos embriões sobreviver e se desenvolver bem, mesmo após a ablação, em um intervalo de temperaturas 18-28 º C. Os investigadores devem elevar seus embriões a uma temperatura para a qual eles têm uma superfície limpa (mas não necessariamente estéril) em que para levantar os embriões com o mínimo de perturbação. Para ser capaz de comparar o tempo dos eventos de desenvolvimento em embriões ablated-blastômeros com controles, nos referimos ao leitor a informação encenação de desenvolvimento detalhado, que está disponível para os embriões criados a 18 º C 4, 25 º C 4, e 26 º C 5,6. </li></ol>

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<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós descrevemos um protocolo para a ablação manual e remoção física completa de blastômeros individuais de estágios iniciais de clivagem da anfípode P. hawaiensis. Demonstramos uso deste protocolo, removendo a única linha germinal célula precursora g de uma fase de embrião de oito células, e mostrar que a ablação tem sido bem sucedida, confirmando a ausência de células-filhas g &#39;s na embriogênese mais tarde. Este protocolo pode ser usada para remover qualquer dos micrômeros...

O Parhyale hawaiensis anfípode crustáceo emergiu na última década como um organismo modelo promissor e com grande potencial para uso em pesquisa evolucionária biologia do desenvolvimento 1. Entre os artrópodes, a maioria dos sistemas modelo são insetos, e os mais extensivamente estudado delas é a mosca da fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster é um membro da ordem de insectos Diptera, e, como tal, apresenta muitas características da embriologia que são derivadas em relação aos dos insectos basalmente ramificação 2. Além disso, os insetos são aninhados dentro do subfilo Pancrustacea 3, o que significa que os insetos têm seus parentes mais próximos dentro do grupo &quot;natural&quot; de longa data chamado pancrustaceans, e que este grupo é parafilético. Isto sugere que, além de basally ramificação modelos de insetos, estudos de outros crustáceos são obrigados a ter uma visão mais ampla da história evolutiva das características do desenvolvimento de ummecanismos moleculares nd que foram muito bem estudados em D. melanogaster. No entanto, muito poucos crustáceos têm sido bem estabelecido para a análise de laboratório experimental de desenvolvimento. O anfípode P. hawaiensis é um sistema de modelo de laboratório altamente tratável, passíveis de uma variedade de técnicas experimentais. Amphipods exibir muitas características únicas dentro de sua superordem pai Peracarida (funis de praia, Scuds, e camarões bem), e, portanto, são pensados ​​para ser relativamente derivado dentro deste grupo de crustáceos. No entanto, a relativa facilidade de manipulação genética embrionária e funcional oferecido pelo Parhyale fazer este anfípode uma adição valiosa para o estoque atual de organismos modelo. Como um animal de laboratório, P. hawaiensis oferece muitas vantagens. Os animais são tolerantes a uma ampla gama de temperaturas e salinidades, e sobreviver bem em grandes culturas de água do mar artificial 1. É fácil de distinguir entre omeen homens e mulheres com base em diferenças morfológicas claras, principalmente, das grandes, em forma de gancho, apêndices tronco anterior que os machos usam para agarrar as fêmeas durante o acasalamento. Para o trabalho embrionário e de desenvolvimento, P. hawaiensis tem várias características muito atraentes. Embriogênese dura aproximadamente 10 dias eo tempo para a maturidade sexual é cerca de seis semanas a 28 º C (mas note que Parhyale sobrevive bem em temperaturas que variam de cerca de 20-30 º C, e que a informação detalhada encenação de desenvolvimento está disponível para os embriões criados a 18 º C 4 , 25 º C 4, e 26 º C 5,6). Adultos acasalar durante todo o ano no laboratório, por isso embriões estão disponíveis em qualquer época do ano. As fêmeas colocam 2-20 (dependendo da idade das fêmeas) ovos fecundados num marsúpios ventral situada entre os vários primeiros pares de pernas (Figuras 1A e 1B), e isto é possível reunir estas embriãos muito cedo no desenvolvimento sem matar a fêmea ou danificar os embriões (Figura 1C). Os embriões sobreviver em água do mar artificial filtrada através de incubação, pode ser fixado para a expressão do gene ou posterior análise histológica 7, e uma tabela de preparação detalhada permite a identificação precisa do progresso através do desenvolvimento 5. Protocolos robustos têm sido utilizados para realizar a análise de expressão gênica por hibridização in situ 8-15 ou imunomarcação 4,16,17, knockdown funcional por interferência de RNA 13,15 ou morpholinos 12, e germinal estável transgênese 18. Usando o sistema de transgénese, expressão indutível 14 e 19 armadilha potenciador métodos também podem ser utilizados para investigar a função de genes em P. hawaiensis. Enquanto a sequência do genoma disponível publicamente não está disponível atualmente, um transcriptoma contendo transcrições produzido durante a ovogênese e embriogênese tem abelhan de novo reunidos e anotados 20, e depositado em um banco de dados pesquisável 21, facilitando a descoberta do gene. Em suma, o P. hawaiensis é um organismo modelo altamente tratável adequado para múltiplas abordagens experimentais e genéticas para a compreensão do desenvolvimento. Ao contrário das clivagens sinciciais de D. primeiros melanogaster, P. embriões hawaiensis clivar holoblastically após a fertilização (Figura 2A). Linhagem análise rastreio mostrou que a clivagem pela terceira, cada uma das terceira blastómeros de clivagem é especificamente destinada a dar origem a uma das três camadas germinais ou da linha germinal 6 (Figura 2B). Estes dados, juntamente com dados de microarranjos 22, linhagem de células analisa 6,23, e as experiências de isolamento de blastômeros 4 sugeriram que os potenciais de desenvolvimento são segregados para pelo menos alguns terceiros blastômeros de clivagem por herança assimétrica de cell determinantes sorte. Deste modo, em experiências de ablação blastómero na qual o precursor de linha germinal (denominado &quot;g&quot; no Parhyale linhagem celular nomenclatura 6) foi removida na fase de oito células, os embriões não tinham células germinais em quatro estágios de desenvolvimento posteriores, como indicado pela ausência de células expressando a proteína vasa, que é um marcador de linha germinal na maioria dos metazoários 24. Em contraste, as experiências de ablação blastômeros somáticas mostrou que P. embriões hawaiensis também possuem capacidades regulatórias significativas, de modo que os destinos de mesoderme ou ectoderma blastômeros precursoras cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes 25. Como substituição destino celular regulador pode ocorrer, ea extensão da adoção destino celular autônoma por blastômeros somáticas, permanece desconhecida. Técnicas embriológicas experimentais tais como a ablação blastomere pode ser útil em entending a autonomia relativa e nonautonomy de decisões destino de células 26,27 e são, portanto, de interesse no estudo da P. embriogênese hawaiensis. Nos experimentos que demonstraram substituição regulador da ectodérmicas e mesodérmicas linhagens, ablação blastomere foi realizada pela injeção de 28 e excitação subseqüente de corantes phototoxic 25. Embora esta técnica seja eficaz em matar a blastomere injectado (s), que não remover completamente o corpo da célula morta do embrião. Além disso, foram observadas diferenças entre os dados de linhagem de células recolhidas nos estadios gastrulação da embriogênese, injetando blastômeros com traçadores fluorescentes linhagem 28,29, e os dados recolhidos pelo seguinte blastômeros não perturbados por meio do desenvolvimento das mesmas fases embrionárias 23. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Nós já publicou os resultados de linhagem celular de embriões analisa em que células individuais foram extirpadas manualmente 23. No entanto, as operações delicadas necessárias para remover blastómeros individuais a partir de embriões na fase inicial de clivagem ainda não foram totalmente descritos. Aqui apresentamos um protocolo para coleta de P. embriões hawaiensis e ablação manual de um único blastômero de uma fase de embrião de oito células. O objectivo deste método é o de conseguir a remoção completa do corpo de célula do embrião, permitindo a observação dos comportamentos celulares e competências destino celular das células remanescentes durante a embriogénese e desenvolvimento pós-embrionário. Nosso protocolo mostra a remoção do precursor g linha germinal (Figura 2C), mas pode ser aplicado a qualquer célula na fase de oito células, ou para as fases de clivagem de blastómeros anteriores. Em princípio, este protocolo pode ser usado para remover as células individuais de embriões em estágio iniciais de clivagem outrr holoblastically clivagem invertebrados marinhos.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteur de 15 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Para transferir embriões intactos e ablacionados por blastômeros de um prato para outro.</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de 22 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Para fazer pontas de pipeta de boca.</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 3 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Utilize algumas inalteradas para recolher e armazenar embriões; cubra algumas com uma camada de Sylgard (ver abaixo) para criar uma superfície de trabalho para as ablações dos blastómeros.</td></tr><tr><td>Placas de 48 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Para cultura de embriões após ablação.</td></tr><tr><td>Filtros de topo de garrafa 0.2 &micro; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>Para criar FASW (veja abaixo).</td></tr><tr><td>Bico de Bunsen</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Para criar ferramenta de fio de tungstênio e pipeta de ponta fina de boca.</td></tr><tr><td>Riscagem de diamante</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>Para criar pipetas Pasteur de boca larga para colecionar casais.</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10 Ferramentas de Fine Science</td><td>Para segurar fêmeas anestesiadas durante a remoção de embriões da bolsa de cria. Estes não precisam ser pinças Dumont de ponta fina - as pontas podem ser pelo menos tão cegas quanto as das pinças para as quais o número de catálogo está listado aqui.</td></tr><tr><td>Fungizona-Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>Adicione ao FASW até uma concentração final de 1 mg / ml e use esta solução para cultivar embriões ablacionados por blastômeros.</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de 4 pol de comprimento, 1/0.58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Para fazer agulhas para perfurar o blastômero a ser ablacionado.</td></tr><tr><td>Vidro de relógio de vidro 300 mm de diâmetro</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>70543-30 Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>Para uso na remoção de embriões da bolsa de cria de fêmeas anestesiadas.</td></tr><tr><td>Água do mar artificial do oceano instantâneo (ASW)</td>Os ecossistemas aquáticos <td>instantâneos do oceano</td><td>IS160</td><td>fazem ASW dissolvendo o sal na água deionizada a uma salinidade de 1,022-1,024.</td></tr><tr><td>Água do mar artificial filtrada instantânea do oceano (FASW)</td> Uso <td>aquático instantâneo do oceano</td><td>IS160 EcoSystems</td><td>0,2 &micro; m para esterilizar ASW. Completar em pequenas quantidades (< 250 ml), conforme necessário.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Para quebrar com segurança a extremidade fina das pipetas Pasteur modificadas para a recolha de casais.</td></tr><tr><td>Adaptador de pipeta bucal</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Insira a ponta da pipeta Pasteur puxada nesta extremidade, para ser usada para remover o conteúdo das células extrudadas durante o procedimento de ablação.</td></tr><tr><td>Tubo de pipeta bucal</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>Corte isso para ser longo o suficiente para ficar confortavelmente pendurado em seu pescoço durante o procedimento de ablação.</td></tr><tr><td>Extrator</td> de <td>agulhas Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>Para fazer agulhas de capilares de vidro para perfurar o blastômero a ser ablacionado.</td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>Adicione ao FASW até uma concentração final de 100 unidades/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina, e use esta solução para cultivar embriões ablacionados por blastômeros.</td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de <td>bulbo de borracha</td> Sciences <td>100488-418 VWR</td><td>Para usar pipetas Pasteur para transferir embriões de prato para prato.</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific</td><td>Make up de acordo com as instruções do fabricante. Despeje uma camada de 2-5 mm de espessura em uma placa de Petri de 3 cm para criar uma superfície de trabalho para ablações de blastômeros.</td></tr><tr><td>Fio de tungstênio 0,004 polegadas de diâmetro</td><td>A-M Systems</td><td>719000 A-M Systems</td><td>Use isso para fazer uma ferramenta para remover embriões da bolsa de cria de fêmeas anestesiadas.</td></tr></tbody></table>

ablação de uma única célula de oito células de embriões de crustáceo anfípodes<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

O hawaiensis anfípode Parhyale é um pequeno crustáceo encontrado em habitats marinhos intertidal em todo o mundo. Ao longo da última década, Parhyale emergiu como um organismo modelo promissor para estudos de laboratório de desenvolvimento, proporcionando uma comparação grupo externo útil para o modelo de artrópodes organismo bem estudado de Drosophila melanogaster. Em contraste com as clivagens sinciciais de Drosophila, os primeiros clivagens de Parhyale são holoblásticas. Mapeamento destino usando corantes traçadores injetados primeiros blastômeros têm mostrado que todas as três camadas germinativas e da linha germinal são estabelecidas pelo estágio de oito células. Nesta fase, três blastômeros estão fadados a dar origem ao ectoderma, três estão fadados a dar origem à mesoderme, e os restantes dois blastômeros são os precursores da linha endoderme e germe respectivamente. No entanto, as experiências de ablação blastômeros têm mostrado que os embriões Parhyale também possuem capabiliti regulador significativoes, de tal forma que os destinos de blastômeros cauterizado no estágio de oito células pode ser tomada pelos descendentes de alguns dos blastômeros restantes. Ablação blastomere tenha sido anteriormente descrita por um dos dois métodos: a injecção e a subsequente activação de corantes fototóxicas ou ablação manual. No entanto, fotoablação mata blastômeros, mas não remove o corpo de células mortas do embrião. Remoção física completa dos blastómeros específicos podem ser, por conseguinte, um método preferido de ablação para algumas aplicações. Aqui é apresentado um protocolo para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir da fase de oito células de embriões Parhyale, ilustrando os instrumentos e procedimentos manuais necessárias para a remoção completa do corpo da célula, mantendo as restantes blastómeros viva e intacta. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer célula Parhyale na fase de oito células, ou de blastómeros de outras fases de clivagem antecipada. Além disso, em princípio, este protocolo pode ser aplicável a clea precoceVåge embriões em estágio de outros invertebrados marinhos holoblastically clivagem.

Após a ablação bem sucedida de solteiro terceira clivagem P. micrômeros hawaiensis conforme descrito neste protocolo, os micrômeros restantes gradualmente mudar suas posições ligeiramente, de modo a ocupar parcialmente o espaço anteriormente ocupado pelo blastomere ablacionada. Por exemplo, quando g é removida, o vizinho blastômeros mr e ml deslocar um pouco e chegar a compartilhar as bordas das células laterais que estavam anteriormente em contato dir...

O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.

Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Esta demonstração mostra a técnica para remover a célula precursora da linhagem germinativa de embriões iniciais na vagem. Crustacean parli sys parli é um organismo modelo emergente com grande potencial para uso em pesquisas evolutivas e do desenvolvimento. A maioria dos artrópodes modelo são insetos, e o mais amplamente estudado destes é a mosca-das-frutas Glip Melanogaster. Os insetos estão incluídos no subfilo Pancresta, e o estudo de outros crustáceos fora do grupo dos insetos fornece uma visão mais ampla da história evolutiva das características de desenvolvimento e dos mecanismos moleculares que já foram bem estudados em drosófila.No entanto, muito poucos crustáceos foram bem estabelecidos para análise experimental laboratorial do desenvolvimento. Parelli é um sistema modelo altamente acessível em laboratório e, portanto, representa um valioso acréscimo ao conjunto de organismos modelo. Como animal de laboratório, parli é muito fácil de manter e manipular.Ele pode sobreviver bem em grandes cultivos de água do mar artificial, e é fácil distinguir entre machos e fêmeas com base em diferenças morfológicas evidentes. Mais notavelmente, os grandes apêndices anteriores em forma de gancho que os machos usam para segurar as fêmeas durante o acasalamento para trabalhos de desenvolvimento. Parelli possui várias características muito atrativas, pois os casais acasalam durante todo o ano, tornando possível coletar embriões a qualquer momento.As fêmeas depositam embriões na bolsa de incubação entre os primeiros pares de patas, e é possível coletar os embriões muito cedo no desenvolvimento sem matar a fêmea ou danificar os embriões. Os embriões sobrevivem em água do mar artificial filtrada até a eclosão, e existe uma tabela detalhada de estadiamentos que permite a identificação precisa do progresso do desenvolvimento. Aqui são mostrados alguns estágios do desenvolvimento de parál até a eclosão, até o estágio de oito células do desenvolvimento.Cada uma das células no embrião paral é especificamente destinada a uma das três camadas germinativas ou às células germinativas primordiais. É a especificação da população de células germinativas que é de particular interesse nesta demonstração. Sabe-se que a célula denominada G para linhagem germinativa é o precursor exclusivo da linhagem germinativa, pois experimentos de rastreamento de linhagem em parli mostram que os descendentes de G tornam-se todas as células germinativas, sem que quaisquer descendentes façam parte de outras camadas germinativas.Além disso, experimentos foram realizados removendo o blastômero G do embrião sem danificar as demais células. Nestes experimentos, embriões nos quais o blastômero G foi removido não desenvolveram células germinativas ao longo do restante da embriogênese, conforme indicado pela ausência de células que expressam a proteína vasa, um marcador da linhagem germinativa em organismos modelo ao longo dos metazoários. Agora demonstraremos como coletar embriões de parali e remover manualmente o blastômero G de um embrião de oito células.Este vídeo demonstra a remoção de G, mas pode ser aplicado a qualquer célula na fase de oito células. Para esta parte do procedimento, precisaremos de uma pipeta Pasteur com a extremidade alargada, uma segunda pipeta Pasteur não modificada, água do mar artificial filtrada, um recipiente grande para acomodar os casais, pequenos recipientes de Petri, uma placa de poços de vidro, pinças e uma ferramenta de dissecação composta por um fio fino e curvo na extremidade de uma Pasteur. Luvas para pipeta não são utilizadas nesta demonstração, mas lembre-se de adicionar equipamentos de proteção conforme as normas de gestão de riscos da sua instituição. Para fabricar a pipeta Pasteur alargada, primeiro faça um corte ao redor da pipeta com uma caneta de diamante e, em seguida, quebre cuidadosamente a ponta.Mantenha sobre uma chama por vários segundos para suavizar as bordas. A abertura deve ser ligeiramente mais estreita que a largura máxima da pipeta. Para fabricar a ferramenta de dissecação com fio, insira um fio de tungstênio na extremidade de uma pipeta de vidro e segure sobre uma chama para derreter o vidro.Fixando o fio no lugar, use pinças para curvar suavemente a extremidade do fio, facilitando sua manipulação com a ferramenta. A extremidade com gancho deve ter um pouco mais da metade de um centímetro de comprimento. Colete os casais usando a pipeta de pasteur alargada e transfira-os para um recipiente separado contendo água do mar artificial.Deixe os casais à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, infunda água do mar artificial filtrada com dióxido de carbono. Colete as fêmeas separadas e anestesie-as nesta água.Transfira uma única fêmea para uma placa de poços de vidro em água do mar artificial filtrada com dióxido de carbono, observando sob um microscópio estereoscópico; segure as placas coxais ao longo de um lado do corpo com pinça. Os embriões são visíveis na bolsa de incubação. Insira a ferramenta de dissecação de fio metálico na extremidade posterior da bolsa de incubação e levante suavemente o fio em direção à extremidade anterior para separar a cobertura da bolsa, abrindo-a e expondo os embriões.Use uma pipeta de Pasteur para passar água através do saco de incubação aberto, expulsando os embriões. Transfira a fêmea para água do mar artificial filtrada sem dióxido de carbono para permitir a recuperação antes de reintroduzi-la à cultura principal.Transfira os embriões para uma placa de Petri com água do mar artificial filtrada e observe-os ao microscópio para determinar seu estágio. Como muitas vezes é difícil determinar o estágio dos embriões antes de removê-los da fêmea, geralmente precisamos coletar embriões de várias fêmeas para obter um número suficiente de embriões no estágio correto. Muitas vezes, a maneira mais simples de obter embriões de oito células é coletar embriões em estágios anteriores e aguardar sua maturação até o estágio desejado.Além dos embriões que já coletamos para o procedimento de ablação, precisaremos de uma pipeta de pasteur, pinça, água do mar artificial filtrada, uma placa de Petri com uma camada de cola, uma agulha feita a partir de uma capilar de vidro puxada, uma pipeta de boca com uma abertura pequena, placas de Petri limpas e água do mar artificial filtrada com anfotericina e penicilina estreptomicina para a ponta da pipeta de boca. Puxe uma ponta longa da sua pipeta sobre uma chama e quebre a ponta da extremidade menor inserida na extremidade da pipeta de boca. Esta ponta possui o tamanho ideal para o procedimento.A agulha de vidro, que será usada para perfurar G durante o procedimento de ablação, deve ter uma ponta fina, mas ser resistente o suficiente para não quebrar ao ser pressionada contra o corion. Aqui é mostrada uma forma comum utilizada em nosso laboratório. Para a ablação, primeiro devemos identificar qual célula é G; o embrião à esquerda mostra G delineado em preto, e na próxima seção aprenderemos como distinguir G dos outros micrômeros.O embrião à direita mostra o resultado esperado após uma ablação bem-sucedida. Neste embrião, G foi ablatado, conforme indicado pelo círculo preto, e apenas três micrômeros permanecem com o uso de pinça. Gire suavemente o embrião para observar e comparar as células.G pode ser identificado como o menor micrômero situado sobre o menor macrômero; MAV pode ser identificado como o menor macrômero ao girar o embrião. Além disso, G não toca a célula EN, que é o micrômero oposto a ele. Como as células el e er compartilham uma fronteira entre G e EN neste embrião, podemos observar que o menor micrômero está localizado à esquerda e que ele não está em contato com o micrômero oposto.Ao girar o embrião, podemos confirmar que este microespelho está posicionado sobre o macroespelho menor. Agora localizado na parte inferior esquerda do embrião, podemos identificá-lo com confiança como G e prosseguir para a ablação. Em resumo.Para este procedimento, estabilizaremos o embrião com pin&ccedil;as enquanto perfuramos G com a agulha de vidro puxada. Em seguida, aplicaremos uma leve press&atilde;o sobre o embri&atilde;o com as pin&ccedil;as, fazendo com que o conte&uacute;do de G saia do embri&atilde;o atrav&eacute;s do orif&iacute;cio que fizemos. Utilizamos a pipeta de boca para remover o conte&uacute;do de G ap&oacute;s ele sair do embri&atilde;o, de modo que possamos observar quando G tiver sido completamente removido.Agora, para detalhar esse procedimento, preencha a placa de guarda de seda com uma camada rasa de água do mar artificial filtrada. Transfira um embrião de oito células para a placa usando uma pipeta de pastilha com pinças. Com a mão esquerda, oriente o embrião com G voltado para a direita e segure suavemente o embrião para estabilizá-lo usando uma agulha de vidro puxada, perfure suavemente G, sem inserir a agulha muito profundamente para evitar empurrá-la contra os macromiradores abaixo de G; troque a agulha na sua mão direita por uma pipeta bucal com ponteira de pipeta de pastilha puxada.Mantenha a ponta da pipeta próxima ao orifício em G e aplique sucção muito suave. Aperte suavemente o embrião com a pinça enquanto o conteúdo de G é expelido do córion. Aspire-o para dentro da pipeta bucal para permitir uma visualização desobstruída do embrião.Observe cuidadosamente o embrião. À medida que G é removido, a borda de G irá recuar em direção ao orifício na coriona, tornando visível a interseção das células subjacentes. Continue aplicando pressão até que todo o G tenha sido removido e use a pinça para girar o embrião e confirmar visualmente que todo o G foi eliminado.Usando uma pipeta de pasteur, transfira o embrião para água do mar artificial filtrada acrescida de anfotericina e penicilina-estreptomicina. Troque metade da água do embrião diariamente para prevenir infecções. Abaixo, um embrião antes e após a ablação.Como é possível observar, há um espaço vazio onde G estava anteriormente. Quando realizado com delicadeza e quando os embriões são bem cuidados após o procedimento, uma grande porcentagem sobrevive até a eclosão. Em nosso laboratório, a taxa média de sobrevivência é pouco superior a 50%

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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