Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

O objetivo geral deste procedimento é medir os coeficientes de difusão de proteínas de membrana em células vivas. Isso é realizado primeiramente cultivando células que expressam a proteína marcada com GFP e, em seguida, adquirindo uma sequência de imagens com lapso de tempo em um microscópio de disco giratório com o foco ajustado na membrana plasmática. O segundo passo é selecionar um recorte na pilha de imagens em que a membrana esteja plana e não haja organelas em movimento.

Em seguida, a imagem recortada é analisada utilizando um software de espectroscopia de correlação de imagem baseado em casos. O passo final é calcular a média dos gráficos de difusão no Excel. Em última análise, a microscopia de células vivas combinada com kicks é utilizada para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biofísica de membranas, como determinar os coeficientes de difusão de proteínas de membrana sob diferentes condições. Na primeira vez em que o código kicks for utilizado, abra o MATLAB e clique em arquivo. Em seguida, defina o caminho, clique em adicionar com subpastas e localize a pasta no computador onde o código kicks está armazenado.

Clique em OK. Antes de salvar e fechar o MATLAB durante a aquisição, é importante manter a membrana em foco durante todo o período de imageamento. Selecione uma região retangular de interesse ou ROI na parte plana da membrana onde a fluorescência esteja uniformemente distribuída.

Exclua organelas celulares em movimento e regiões da membrana proeminentes. O tamanho do recorte é escolhido de modo que sejam geradas estatísticas suficientes para bons gráficos de K ao quadrado. Recorte a região e salve o recorte como um arquivo tiff.

Arquive em uma pasta apropriada. Se houver várias recortes do mesmo filme, utilize uma numeração incremental, como recorte da pilha um, tiff, pilha um, recorte dois, tif, e assim por diante. Para realizar a análise, primeiro abra o MatLab e digite ICS gooey na janela de comando e pressione enter ICS.

GUI é o nome executável do programa de interface gráfica do usuário de espectroscopia de correlação de imagem no ICS Gooey. Clique na aba kicks. Encontre a pasta com o nome da pasta, código MATLAB.

Role até o arquivo com o nome scripts e abra-o clicando duas vezes. Este arquivo chama-se editor. No editor.

Role para carregar os conjuntos de dados de chutes. Em seguida, copie ou digite o nome do arquivo e o local da pasta na linha de comando. Na linha de comando abaixo, insira o local da pasta.

Defina o número de quadros a serem analisados. Utilize as mesmas configurações para todos os filmes consecutivos na série de dados. Se houver desvio de foco nos quadros posteriores.

Estes devem ser excluídos da análise no editor. Clique em salvar e, em seguida, clique em avaliar. O conjunto de dados agora está carregado no software de análise na janela de análise de kicks na interface gráfica do usuário (gui).

Insira as configurações para a análise desmarcando primeiro as caixas de linfócitos T. Em seguida, insira o número de atraso temporal a ser analisado. Insira o valor máximo de K ao quadrado.

Normalmente está entre 20 e 50 inicialmente. A análise deve ser repetida até que os melhores valores sejam determinados, e então a configuração deve ser usada para todos os filmes consecutivos na série de dados. Verifique sempre que as configurações selecionadas proporcionem um bom ajuste para os dados, conforme evidenciado por gráficos de resíduos quadráticos adequados e um gráfico de difusão linear.

Em seguida, clique em configurações de armazenamento e prossiga. Depois, clique em sim para exibir todos os gráficos. Clique em carregar série de imagens e, em seguida, clique em espaço de trabalho.

Selecione o recorte da série de imagens antes de clicar em importar do espaço de trabalho. Agora, insira as configurações de aquisição do sistema de imagem na caixa de tamanho do pixel. Informe o tamanho projetado do pixel para o sistema de imagem no qual as pilhas de imagens foram adquiridas.

Clique para selecionar as ROI e inserir uma. Em seguida, clique em OK e use a imagem inteira. Clique em realizar análise de kicks e clique em sim para fazer a filtragem de imóveis.

Os resultados serão abertos automaticamente como imagens. Minimize a janela de configurações, minimize a janela de informações da célula e minimize a janela de fotofísica na janela de dinâmica. Verifique se o gráfico de dinâmica exibe um ajuste linear dos dados com uma inclinação negativa, o que indica que os pontos de dados estão correlacionados e pode-se assumir difusão livre.

Registre o coeficiente de difusão para o atraso temporal específico e as configurações de K ao quadrado. Os pontos de dados nos gráficos de K ao quadrado devem estar agrupados ao redor da linha correspondente ao tempo fornecido. Marque a caixa de seleção de atrasos temporais, salve as figuras abertas como imagens e, em seguida, clique em salvar figuras abertas como imagens para armazenar os arquivos de resultado.

Salve em uma nova pasta e, em seguida, clique em limpar os dados atuais e continue com a análise da próxima cultura. Usando os nomes das culturas definidos anteriormente, insira os coeficientes de difusão individuais de cada ROI em uma planilha e certifique-se de anotar o número de atrasos temporais e os valores de K ao quadrado. Calcule o coeficiente médio de difusão e o desvio padrão utilizando um programa de planilha.

Realize um teste MOV Smirnoff ou um teste t de Student para avaliar as diferenças estatísticas. Utilizando um nível de significância de 5%, podem ser feitas comparações quantitativas entre células. A versão em planilha dos gráficos de difusão, que foi gerada pelo software de análise para cada cultura, e média os dados para cada condição em cada intervalo de tempo.

Gere um novo gráfico médio de difusão para apresentação em artigos ou apresentações. Os resultados apresentados aqui são uma sequência de imagens com lapso de tempo da Aquaporina três marcada com EGFP. Em células MDCK vivas, que são células epiteliais renais, obtidas em um microscópio de disco giratório com o foco ajustado na membrana plasmática.

É mostrada aqui uma imagem da célula com recortes de ROI de exemplo destacados em retângulos para a seleção dos recortes. É importante realizar o recorte na periferia da célula, onde a membrana é uniforme e plana, para que apenas uma difusão bidimensional seja visualizada. Deve-se evitar organelas celulares, vesículas e projeções da membrana, e é fundamental para a análise que não haja deslocamento durante o intervalo de tempo.

Esta amostra representativa foi excluída da análise e dos kicks, pois há vesículas em movimento, que podem contribuir para o coeficiente de difusão. Outro exemplo de amostra excluída, na qual há um orifício na membrana, é mostrado aqui. O gráfico de difusão de uma amostra gerado com kicks é apresentado aqui.

Este método pode ser utilizado para determinar o coeficiente de difusão de uma proteína marcada com proteína fluorescente, um corante ou pontos quânticos. A inclinação da curva no gráfico de difusão é simplesmente o valor negativo do coeficiente de difusão; aqui mostrado para a aquaporina três marcada com EGFP, este é um gráfico de difusão calculado com excesso de intervalos de tempo. Neste caso, a análise foi repetida, mas com menos intervalos de tempo, de modo que o gráfico de difusão torne-se linear.

Um gráfico quadrado de caso típico é apresentado aqui. Esta é a curva de correlação média radial e transformada logaritmicamente para um intervalo de tempo selecionado desses gráficos K quadrado. A inclinação é representada graficamente em função dos intervalos de tempo, e o resultado é o gráfico de difusão previamente mostrado.

Ao inspecionar os gráficos de K ao quadrado, é importante que o ajuste seja avaliado a partir desse gráfico de K². Pode-se concluir que a amostra é muito pequena e não pôde ser analisada, pois deveria apresentar uma inclinação negativa e decair linearmente até um nível de ruído de fundo. Este gráfico de K² precisa ser reanalisado com um valor máximo de K² reduzido, já que o ajuste já não é mais adequado, conforme indicado pelos resíduos crescentes em valores maiores de K².

Neste caso, a análise deve ser executada novamente, inserindo um valor máximo de K ao quadrado mais baixo. Um gráfico médio de difusão, média de 10 recortes, é mostrado aqui. O gráfico de difusão foi encontrado no arquivo Excel da análise e a partir dele.

O coeficiente de difusão da AQUAPORINA três EGFP é calculado seguindo este procedimento. Outros métodos, como a medição do coeficiente de difusão de proteínas de membrana após a adição de diferentes fármacos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como alterações no coeficiente de difusão após tratamento com fármacos, e se é provável que haja mudanças nos ambientes lipídicos e/ou nas interações proteína-proteína na membrana.