Choque aplicação de ondas de culturas de células

O objetivo geral deste procedimento é evitar efeitos físicos distrativos durante o tratamento in vitro com ondas de choque, a fim de obter resultados reprodutíveis. Isso é conseguido primeiramente preenchendo completamente um frasco de cultura celular com meio de cultura e, em seguida, colocando o frasco em um banho-maria aquecido. O segundo passo é utilizar uma quantidade generosa de gel ultrassônico ao acoplar o aplicador ao banho-maria.

Em seguida, o aplicador é posicionado contra a membrana do banho-maria de forma horizontal. O passo final é garantir que a fonte de ondas de choque esteja alinhada com o centro do frasco de cultura celular, a fim de posicionar as células dentro do foco da onda. Por fim, a análise de suas células pode ser realizada, por exemplo, com PCR em tempo real e um arranjo de citocinas para demonstrar uma alteração nos genes e citocinas de interesse.

Tivemos pela primeira vez a ideia para este modelo quando observamos que os métodos existentes de aplicação de ondas curtas diretamente em culturas celulares não consideram o efeito da reflexão da onda na transição entre o meio de cultura e o ar ambiente. O procedimento será demonstrado pela Dra. Chante, estudante de doutorado do meu grupo de pesquisa. Para começar, aqueça 3,5 litros de água da torneira a 37 graus Celsius.

Em seguida, transfira a água aquecida para o banho-maria. O nível da água deve ficar três centímetros abaixo do topo do banho-maria e deve cobrir completamente a membrana. Depois, conecte o sensor de temperatura a uma fonte de alimentação e coloque o sensor de temperatura no encaixe na parede traseira do banho-maria.

Em seguida, enquanto agita a água, conecte continuamente o aquecedor a uma fonte de alimentação e aqueça a água até atingir uma temperatura estável de 37 graus Celsius. Em condições estéreis, semeie as células em frascos de cultura T 25.

Assim, atingirão 90% de confluência após incubação durante a noite. Em seguida, coloque os frascos verticalmente e preencha com meio de cultura até a base do gargalo do frasco para evitar contaminação. Não permita que o meio entre em contato com o gargalo do frasco ou com a tampa de fechamento.

Em seguida, feche os frascos com uma tampa sólida sem filtro para evitar contaminação pela água do banho. Depois, selar as tampas com paraforma. Após os frascos serem selados, prenda-os em um suporte.

Em seguida, insira os frascos fixados no banho-maria e alinhe o centro do frasco de cultura celular ao centro da membrana do aplicador de ondas de choque. Aplique uma quantidade generosa de gel de transmissão de ultrassom no aplicador de ondas de choque e na membrana do banho-maria. Depois, conecte o aplicador à membrana e certifique-se de que não haja bolhas de ar entre eles.

Em seguida, posicione o aplicador de ondas de choque no centro da membrana e certifique-se de que esteja alinhado horizontal e verticalmente com o frasco de cultura celular, garantindo o tratamento de toda a área de crescimento celular. Em seguida, realize um experimento piloto para determinar a distância ideal entre o aplicador de ondas de choque e o frasco de cultura, bem como para definir os parâmetros corretos de tratamento. Certifique-se de manter o frasco de cultura e o aplicador em posição estável durante a ativação do dispositivo de ondas de choque.

Uma vez determinada a distância ideal, realize o experimento sob os parâmetros desejados de tratamento com ondas de choque. Após a conclusão do tratamento com ondas de choque, remova o frasco de cultura celular do banho-maria, seque com papel toalha e desinfete a superfície externa do frasco. Em seguida, transfira o meio do frasco para um tubo de centrífuga.

Pelotize as células sob parâmetros normais de centrifugação. Re-suspenda o pellet celular em dois mililitros de meio de cultura celular, transfira a suspensão celular de volta para o frasco contendo cinco mililitros de meio de cultura celular e cultive as células até a confluência necessária para experimentos de análise celular. A análise por PCR em tempo real de células endoteliais da veia umbilical humana revelou uma superexpressão dos níveis de mRNA de tie dois após o tratamento com ondas de choque.

Isso sugere que o tratamento com ondas de choque aumenta a proliferação de células endoteliais e a angiogênese. Os níveis de citocinas na veia umbilical foram quantificados utilizando um arranjo de citocinas.

Observou-se também um aumento significativo nas duas citocinas inflamatórias IL-6 e IL-8, ambas envolvidas na inflamação que acompanha o processo angiogênico após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que numerosos pesquisadores na área da ciência básica de ondas de choque explorassem os efeitos em um único tipo celular em experimentos in vitro. Esperamos convencer ainda mais pesquisadores a utilizarem este modelo, a fim de obterem resultados reprodutíveis e comparáveis na ciência das ondas de choque.