Correção Deriva de exemplo a seguir 4D confocal tempo-lapso
12 de abril de 2014
Microscopia de lapso de tempo permite a visualização de processos de desenvolvimento. Crescimento ou deriva de amostras durante a aquisição de imagem reduz a capacidade de acompanhar e medir movimentos celulares durante o desenvolvimento de forma precisa. Descreve-se o uso de open source software de processamento de imagem para corrigir desvio tridimensional da amostra ao longo do tempo.
A Microscopia TimeLapse permite uma visualização dos processos de desenvolvimento, crescimento ou deriva da amostra que ocorre sobre esta imagem. A aquisição pode resultar em uma incapacidade de seguir ou rastrear os movimentos celulares, o seguinte protocolo. Usamos software de processamento de imagem de código aberto para corrigir desvios tridimensionais ao longo do tempo.
A captura de uma série de seções ópticas em diferentes planos focais permite a geração de um modelo tridimensional da amostra. Isso pode ser estendido em quatro dimensões, criando uma série de conjuntos de dados 3D com lapso de tempo. Em experimentos de lapso de tempo de longo prazo, é comum observar o movimento da amostra.
Isso pode ser causado por precisões deslizantes no estágio de controle de hardware e posições focais, enquanto em outros casos deriva como resultado de movimentos induzidos pelo crescimento da amostra ou flexibilidade dentro dos métodos de mídia de montagem existem para compensar a limitação desses movimentos com muitas melhorias nos sistemas de foco de hardware e o aumento da rigidez do meio de montagem. No entanto, essas abordagens não podem ser aplicadas em muitos casos devido à configuração de imagem necessária para fornecer condições adequadas para a manutenção e correção do crescimento das amostras. Para deriva de amostra, desenvolvemos um plugin para utilizar a plataforma de processamento de imagens de código aberto de Fiji.
Nosso plug-in de desvio 3D correto é capaz de formar um registro de correlação de fase para corrigir o movimento que ocorre como um desvio de função ou amostra em experimentos de lapso de tempo tridimensionais em experimentos multicanais. O plug-in de desvio 3D correto utiliza um canal para determinar a correção necessária. Essa correção é então aplicada a quaisquer canais adicionais, resultando no registro do conjunto de dados The four D.
O pacote Web gratuito de código aberto. Fiji é um fork de distribuição, o programa Image J, que contém plug-ins pré-instalados para executar vários processos em dados coletados de experimentos de microscopia. Fiji fornece uma arquitetura de plug-in mais fácil e inclui na instalação padrão.
Uma cópia do plug-in correto de três EG, que usaremos para esta análise quando a instalação for concluída Open Fiji. Fiji suporta a importação de uma vasta gama de formatos de imagem de microscopia proprietários. Isso pode ser conseguido através de arrastar e soltar ou através dos usuários, o ambiente de microscopia aberta.
Plugin de importação de formatos biográficos. Se o conjunto de dados exceder o tamanho da memória instalada em seu sistema, abra o arquivo de imagem como uma pilha virtual e de uma opção de gerenciamento de memória. O conjunto de dados que usaremos nesta análise foi gerado a partir de um experimento de série temporal tridimensional do ACTA, peixe-zebra transgênico GFP, no qual a GFP é expressa no músculo esquelético.
Para visualizar os núcleos, esta linha transgênica foi injetada com o núcleo localizando M cereja para melhor representar esses pisos de flúor, podemos alterar as tabelas de pesquisa para cada um desses canais na ferramenta de canal de cores. Ao longo da série temporal coletada, parece que a amostra de peixe zíper flutuou no campo de visão. Ela corrigiu esse desvio, abriu o plug-in de desvio 3D correto no submenu de registro dos plug-ins instalados em Fiji.
Os marcadores do vendedor que são amplamente expressos em uma amostra ou não estão envolvidos nos eventos de marketing durante a aquisição da imagem fornecem a melhor fonte para correção de desvio. Neste exemplo, o ACTA, fluorescência GFP no canal um. Se a memória for limitada em seu sistema, selecione a opção de pilha virtual e permita que o plug-in Correct 3D drift seja executado.
O conjunto de dados corrigido terá um tamanho de tela maior em comparação com o original. Acomodando o movimento da amostra. A geração de imagens máximas de projeção das seções ópticas permite a comparação do desvio que foi removido da amostra corrigida a ser feita.
A projeção de intensidade máxima remove a dimensão do conjunto de dados, mas como uma abordagem útil para examinar rapidamente os resultados da correção de desvio. Aqui vemos as imagens de projeção máxima para cada ponto de ligação em seus conjuntos de dados corrigidos e não corrigidos. Quando esse experimento de lapso de tempo é projetado como uma única imagem, a quantidade de desvio que pode ocorrer mesmo em um experimento de lapso de tempo curto é aparente.
As correções feitas registrando o desvio de um canal de sua amostra também são aplicadas a todos os outros canais contidos nesta pilha de imagens. O procedimento para correção de desvio se a memória for limitada em seu sistema é ligeiramente alterado. Selecione a opção de pilha virtual usada no formato de compra, no menu de importação e no menu pop-up do plug-in de desvio 3D correto.
Ao selecionar Esta opção, você será solicitado a selecionar um local para o qual um plug-in possa exportar arquivos de imagem individuais para cada fatia de canal e ponto de tempo do seu experimento de lapso de tempo. A pilha virtual gerada contém a mesma correção de desvio do nosso exemplo anterior. Se abrirmos o local de salvamento selecionado, veremos os arquivos de sequência de imagens individuais resultantes Gerados.
Para abrir essa coleção de arquivos, use a ferramenta de importação de sequência de imagens. O arquivo resultante não separará canais, seções ópticas ou pontos de tempo. Para visualizar esses recursos, converta a pilha em uma hiperpilha usando os dados do arquivo de log, insira o número de canais, Fatias ópticas e os pontos de amarração coletados no, Podemos alterar novamente as tabelas de pesquisa para ajustar a cor exibida de nosso experimento de lapso de tempo.
Este protocolo corrige o desvio que ocorre entre os pontos de tempo, o desvio que ocorre na captura de um único ponto de tempo não pode ser corrigido por este protocolo. Recomendamos que os parâmetros usados para aquisição de imagens reduzam o tempo necessário para que cada ponto de tempo seja capturado. A capacidade de corrigir o desvio no software de pós-processamento permite que os movimentos celulares que, de outra forma, seriam habilidades pelo desvio da amostra sejam analisados e medidos.
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Visão Geral
A microscopia com lapso de tempo permite a visualização de processos de desenvolvimento, mas a deriva da amostra durante a aquisição de imagens pode dificultar o rastreamento preciso dos movimentos celulares. Este estudo descreve o uso de um software de processamento de imagens de código aberto para corrigir a deriva tridimensional da amostra ao longo do tempo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia
- Processamento de Imagem
- Desenvolvimento Celular
Antecedentes
- A microscopia com lapso de tempo é essencial para observar processos de desenvolvimento.
- O movimento da amostra pode complicar o rastreamento de movimentos celulares.
- Softwares de código aberto podem fornecer soluções para corrigir deriva.
- A captura de seções ópticas pode criar modelos tridimensionais.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a precisão do rastreamento de movimentos celulares em microscopia com lapso de tempo.
- Para demonstrar a eficácia de um software de processamento de imagens de código aberto.
- Para facilitar a geração de modelos tridimensionais a partir de dados de lapso de tempo.
Métodos Utilizados
- Microscopia com lapso de tempo para capturar processos de desenvolvimento.
- Software de processamento de imagens de código aberto para correção de deslocamento.
- Aquisição de seções ópticas em diferentes planos focais.
- Criação de séries de lapso de tempo de conjuntos de dados tridimensionais.
Resultados Principais
- Correção bem-sucedida da deriva tridimensional da amostra.
- Melhoria na capacidade de rastrear movimentos celulares ao longo do tempo.
- Geração de modelos tridimensionais precisos a partir de dados de imagens sequenciais.
- Demonstração da utilidade de software de código aberto em microscopia.
Conclusões
- Software de código aberto para processamento de imagens é eficaz para corrigir desvios.
- A microscopia com lapso de tempo pode ser aprimorada para estudos de desenvolvimento.
- O rastreamento preciso dos movimentos celulares é essencial para compreender o desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O deslocamento da amostra em imagens confocais de lapso de tempo 4D introduz um erro sistemático que compromete a precisão do rastreamento de movimento celular em estudos de biologia do desenvolvimento. A correção desse deslocamento por meio de métodos abertos de correlação de fase permite a quantificação confiável da dinâmica celular, apoiando a eliminação de riscos mecanicistas na validação de alvos e nos fluxos de trabalho de triagem fenotípica. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, garantindo que os movimentos observados reflitam o comportamento biológico real e não artefatos instrumentais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar movimentos celulares reais de artefatos de deslocamento da amostra.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da validação funcional precisa de alvos em ensaios com imagens sequenciais.
- Valor Preditivo: Melhora a triagem de portfólios ao aumentar a confiança nos resultados fenotípicos obtidos por imagem de células vivas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, garantindo fidelidade espacial em conjuntos de dados 4D.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de imagens com lapso de tempo corrigidas para deslocamento.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em experimentos multicanal ao aplicar o registro de um único canal a todos os canais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a integridade dos dados do descobrimento até a validação pré-clínica, corrigindo o deslocamento das amostras que poderia comprometer a análise de biomarcadores.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Concentra-se no valor preditivo ao permitir o rastreamento preciso da migração, proliferação ou diferenciação celular em sistemas relevantes para a doença.
- Decisões com Base em Risco Ajustado: Apoia critérios de avanço ao fornecer conjuntos de dados livres de deriva para avaliação fenotípica quantitativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, garantindo a qualidade dos dados em ensaios de imagem em células vivas utilizados para validação de alvos e vias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao eliminar efeitos de deriva confundidores em conjuntos de dados confocais 4D.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio e a obtenção de resultados quantitativos ao estabilizar coordenadas espaciais ao longo do tempo para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera conjuntos de dados 4D corrigidos quanto à deriva, permitindo comparação precisa das posições e movimentos celulares entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao preservar a precisão espacial em modelos de doenças utilizados para o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Posiciona o plugin correto de deriva 3D como uma capacidade reutilizável para padronizar a microscopia com lapso de tempo em projetos e equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista decorrente da deriva instrumental.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de fluxos de trabalho de imagem confocal 4D.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou não, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados decorrentes de sinais fenotípicos falsos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados fenotípicos corrigidos quanto à deriva.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no processamento de imagens de microscopia e familiaridade com as plataformas Fiji/ImageJ.
- Necessita de recursos computacionais suficientes ou capacidade de pilha virtual para conjuntos de dados 4D grandes.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de correção de deslocamento para garantir consistência em ambientes com múltiplos usuários.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes tipos de amostras, meios de montagem ou modalidades de imagem.
- Limita-se à correção de deslocamento entre pontos temporais; não pode corrigir movimentos dentro do quadro ou deformação da amostra durante a aquisição.
