A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

O objetivo geral deste procedimento é detectar o genoma do vírus do herpes simples, tipo um, em cortes de gânglios trigêmeos de camundongos latentes infectados por hibridização fluorescente in situ. Isso é realizado primeiramente inoculando o vírus no lábio do animal, seguido por um período de incubação de 28 dias, durante o qual o vírus se estabelece nos gânglios trigêmeos. Em seguida, os gânglios trigêmeos são coletados, embutidos e seccionados por criomicrotomia.

As seções são submetidas a vários tratamentos preparatórios, incluindo a etapa fundamental de aquecimento em tampão de citrato de sódio. Por fim, é realizada a hibridização in situ fluorescente utilizando sondas fluorescentes específicas para o herpes. Em última análise, os resultados podem mostrar o posicionamento do genoma viral dentro do núcleo de neurônios individualmente infectados por meio da microscopia confocal.

Em muitos casos, o estudo de um ciclo de vida variado exige o uso de modelos animais. O principal benefício da técnica apresentada aqui é que ela fornece dados no nível de célula única utilizando uma abordagem de individualização institucional. O modelo real de infecções por HS reproduz a maioria dos aspectos da história natural da infecção por HSV tipo um em humanos.

Esse é o hospedeiro natural do vírus. A infecção primária ocorre nos tecidos orais, e em seguida o vírus progride dos lábios até o gânglio trigeminal. Esse é o principal local de latência do HSV em humanos. Combinação de imunomarcção e coloração.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a latência do vírus herpes, como a forma como o vírus interage com componentes nucleares e como essas interações influenciam a manutenção da latência e, eventualmente, a reativação do vírus. Para começar, tenha um camundongo anestesiado e uma solução estoque do vírus HSV-1, ressuspensa em meio sem vermelho de fenol.

Usando um estereomicroscópio binocular, insira a agulha na camada subepitelial do lábio superior esquerdo na borda mucocutânea. Injete 0,5 microlitros de solução viral ao longo de cinco segundos e, em seguida, realize uma segunda injeção do vírus no mesmo local. Transfira o camundongo para uma incubadora ou almofada aquecida a 37 graus Celsius até que desperte.

Em seguida, coloque-o em sua gaiola de origem pelo tempo necessário de recuperação antes de perfundir e fixar conforme o protocolo descrito no texto. Corte em cada lado da mandíbula inferior. Depois, corte a ponta do nariz logo atrás dos incisivos para expor a cavidade nasal.

Corte o palato ao meio com uma tesoura e, em seguida, coloque-o ao lado. Os gânglios trigeminais estão localizados sob o palato. São massas brancas e oblongas, com dois a três milímetros de comprimento, e estão conectados ao nervo trigeminal.

Corte os ramos do nervo trigêmeo em cada lado dos gânglios para liberá-los do tronco encefálico. Usando pinças cirúrgicas, remova os gânglios e transfira-os para solução de sacarose a 20% em PBS, deixando-os em incubação por 24 horas. No dia seguinte, à temperatura ambiente, inclua ambos os gânglios trigêmeos em um único bloco para crioseção.

Médio de inclusão, congele o bloco a menos 80 graus Celsius até que seja seccionado em um criostato. Corte os gânglios trigêmeos no sentido longitudinal em secções de 10 mícrons e colete-as em lâminas super frost aquecidas a 30 graus Celsius. Quatro a cinco secções podem caber em uma única lâmina.

Atribuir várias etiquetas de série à lâmina pode ser útil. Se forem planeadas várias aplicações posteriores, deixe as fatias secarem por cinco a 10 minutos antes de armazená-las a menos 80 graus Celsius. Para este protocolo, a sonda é preparada marcando cossídeos contendo porções de 30 quilobases do genoma do HSV tipo 1 com dCTP SI 3D por tradução NIC.

É precipitado e suspenso em forma desionizada de amida e deve apresentar coloração rosa devido à incorporação de S SI três no primeiro dia. Coloque as lâminas em um porta-lâminas à temperatura ambiente e deixe os cortes secarem por 10 minutos. Em seguida, reidrate os cortes em PBS 1X por 10 minutos.

Em seguida, permeabilize o tecido em Triton X-100 0,5% em 1x PBS por 20 minutos. Lave então as lâminas três vezes, durante 10 minutos cada lavagem, com 2x SSC e mantenha-as em 2x SSC até que o tampão de desmascaramento seja aquecido. Para o desmascaramento, pré-aqueça o tampão citrato em forno de micro-ondas até que o tampão entre em ebulição.

Isso é feito preenchendo uma bandeja para lâminas de vidro com 200 mililitros do tampão. Coloque a bandeja em um recipiente maior cheio com 500 mililitros de água destilada e aqueça o tampão até a ebulição. Em seguida, transfira as lâminas para a bandeja.

Verifique se eles estão completamente cobertos com o tampão no micro-ondas. Aqueça as lâminas no tampão por cerca de 20 segundos até que o tampão atinja a ebulição. Não permita que o tampão transborde.

Em seguida, resfrie as lâminas à temperatura ambiente por dois minutos e repita o ciclo de aquecimento mais seis vezes. É fundamental determinar empiricamente o número e a duração dos ciclos de aquecimento para garantir a reprodutibilidade da etapa de desmascaramento. O forno de micro-ondas, a bandeja, o recipiente e o volume de tampão na bandeja.

O volume de água no recipiente deve ser mantido idêntico quando o aquecimento for concluído. Transfira as lâminas para duas XSSC por cinco minutos sob capela, incube as lâminas em uma solução de três para um a quatro de metanol, ácido acético e PBS por 15 minutos. Em seguida, incube as lâminas em uma mistura recém-preparada de três para um de metanol para ácido acético por 15 minutos.

Agora desidrate as seções por meio de incubações sucessivas de 10 minutos em etanol 70%, seguidas por duas incubações de 10 minutos em etanol puro. Deixe os lâminas secarem à temperatura ambiente por 10 minutos para prepará-los para a sonda. Aplique 80 microlitros de solução de hibridização gota a gota nas seções secas e cubra-as com uma lamínula.

Verifique se a solução de hibridização se espalha por toda a superfície do lamínula e se não há bolhas. Em seguida, feche o lamínula com cola de borracha e deixe secar. Prossiga com a desnaturação incubando as lâminas a 80 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, transfira rapidamente as lâminas para uma bandeja metálica sobre gelo durante cinco minutos. Prossiga com uma hibridização noturna a 37 graus Celsius no dia seguinte. Remova o cimento de borracha com pinça, mantendo as lâminas em um bloco aquecedor a 37 graus Celsius.

Remova cuidadosamente a lamínula com a ponta da lâmina de bisturi. Em seguida, lave as seções repetidamente com SSC. Agora, cora as amostras por 10 minutos com o corante apropriado, como DAPI ou Hoechst 33342, a 0,5 microgramas por mililitro em 1 XPBS.

Em seguida, lave as lâminas três vezes com 1 XPBS durante 10 minutos por lavagem. Após a terceira lavagem, remova o máximo de líquido possível da lâmina. Então, ao final de cada lâmina, adicione 80 microlitros de meio de montagem com um agente antidesbotamento.

Cubra lentamente o meio com uma lamínula de alta qualidade óptica, evitando a formação de bolhas. Em seguida, selar a lâmina com esmalte e armazená-la no escuro a quatro graus Celsius. No desenvolvimento deste protocolo, vários tampões salinos foram testados para desmascaramento.

Embora os tampões de EDTA tendam a danificar o tecido, o citrato de sódio, tris, HCl e água destilada mostraram-se adequados para a detecção do HSV tipo 1, a fim de verificar se o protocolo funcionaria com sondas comerciais. A detecção do genoma latente do HSV tipo 1 foi realizada utilizando uma sonda biotinilada PAN HSV tipo 1 obtida da Enzo Biochem, sendo possível detectar tanto padrões de sinal único quanto múltiplos pontos para o genoma do HSV tipo 1.

Além disso, o protocolo de DNA FISH foi testado em camundongos e coelhos infectados com três cepas comumente utilizadas do HSV tipo 1. Em todos os casos, os genomas do HSV tipo 1 exibiram um sinal pontilhado com brilho e intensidade variáveis. Além disso, a aplicabilidade do protocolo foi testada no ciclo replicativo do HSV tipo 1 mediante a realização de DNA FISH em tecidos de camundongos submetidos a uma infecção herpética generalizada.

Nesses animais, agregados grandes e brilhantes de genomas do herpes simples tipo um foram detectados em diversos tecidos, incluindo os gânglios da raiz dorsal, olhos e cérebro. O protocolo de hibridização in situ com DNA é muito versátil. Ele permite a detecção simultânea do genoma do HSV-1 e de RNAs ou proteínas virais ou celulares.

Por exemplo, a detecção simultânea do genoma do HSV 1 juntamente com o RNA latente do HSV 1 é viável; a detecção simultânea do genoma do HSV 1 com proteínas celulares, como a proteína centromérica CENP-A, foi utilizada; a detecção simultânea do HSV 1 com a cromatina e os corpos nucleares PML. A proteína associada A TRX foi visualizada com uma coloração tripla mostrando o DNA do HSV 1 em vermelho, seu produto de RNA lat em azul e a TRX em verde.

Uma vez configurado o desmascaramento, o procedimento de hibridização in situ com sondas de DNA é muito robusto. Pode ser realizado em menos de 24 horas em lotes de 20 lâminas ou mais. O desenvolvimento desta técnica permitirá que pesquisadores que estudam vírus herpes e outros vírus persistentes explorem, ao nível de célula única, como componentes celulares e a arquitetura nuclear podem influenciar a biologia desses vírus.