A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

O objetivo geral deste procedimento é detectar o genoma do vírus herpes simplex, tipo um, em seções de gânglios trigêmeos de camundongos latentemente infectados por hibridização in situ fluorescente. Isso é feito inoculando primeiro o vírus no lábio do animal, seguido por um período de incubação de 28 dias durante o qual o vírus se estabelece nos gânglios do trigêmeo. Em seguida, os gânglios do trigêmeo são colhidos, embutidos e seccionados criograficamente.

As seções são submetidas a vários tratamentos preparatórios, incluindo a etapa principal de aquecê-las em um tampão de citrato de sódio. Finalmente, a hibridização fluorescente in situ é realizada usando vestes fluorescentes específicas para herpes. Em última análise, os resultados podem mostrar o posicionamento do genoma viral dentro do núcleo de neurônios infectados individualmente por meio do uso de microscopia confocal.

Em muitos casos, o estudo de um ciclo de vida diferente requer o uso de modelos animais. O principal benefício da técnica representada aqui é que ela fornece dados no nível de célula única usando uma abordagem de fluentização do instituto. O modelo royal killer de infecções por HS reproduz a maioria dos aspectos da história natural da infecção por HSV um em humanos.

Esse é o hospedeiro natural do vírus. A infecção primária é feita nos tecidos orais e, em seguida, o vírus progride dos lábios para os dois gânglios al. Esse é o lado principal da latência do HS V em humanos Combinado dois imuno e coloração.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a latência do vírus do herpes, como a forma como o vírus interage com os componentes nucleares e como essas interações influenciariam a manutenção da latência e, eventualmente, a reativação do vírus. Para começar, tenha um camundongo anestesiado e uma solução estoque de um vírus HSV. Ressuspenso em meio livre de vermelho de fenol.

Usando um estereoscópio binocular, insira a agulha na camada subepitelial do lábio superior esquerdo na borda mucocutânea. Injete 0,5 microlitros de solução de vírus em cinco segundos e, em seguida, faça uma segunda injeção de vírus no mesmo local. Transfira o mouse para uma incubadora ou almofada de aquecimento de 37 graus Celsius até que ele desperte.

Em seguida, coloque-o em sua gaiola doméstica pelo tempo de recuperação necessário antes de consertá-lo de acordo com o protocolo de texto. Corte em cada lado da mandíbula inferior. Em seguida, corte a ponta do nariz logo atrás dos incisivos para revelar a cavidade nasal.

Corte o palato ao meio com uma tesoura e coloque-o ao lado. Os gânglios do trigêmeo estão abaixo do palato. São massas oblongas brancas, de dois a três milímetros de comprimento e conectadas ao nervo trigêmeo.

Corte os ramos do nervo trigêmeo em cada lado dos gânglios para liberá-los do tronco cerebral. Usando um alicate cirúrgico, remova os gânglios e transfira-os para 20% de sacarose em PBS e deixe-os incubar por 24 horas. À temperatura ambiente no dia seguinte, incorpore os dois gânglios do trigêmeo em um único bloco de criosecção.

Incorporando o meio, congele o bloco a menos 80 graus Celsius até que seja seccionado em um criostato. Corte os gânglios do trigêmeo longitudinalmente em seções de 10 mícrons e colete-os em lâminas super frost aquecidas a 30 graus Celsius. Quatro a cinco seções podem caber em um único slide.

Dar ao slide vários rótulos de série pode ser útil. Se várias aplicações a jusante forem planejadas, deixe as fatias secarem por cinco a 10 minutos antes de armazená-las a menos 80 graus Celsius. Para este protocolo, a sonda é preparada marcando cosms contendo porções de 30 kilobases do genoma HSV um com SI 3D CTP por tradução NIC.

É precipitado e suspenso na forma deionizada amida e deve aparecer rosa devido à incorporação de S SI três no primeiro dia. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas em temperatura ambiente e deixe as seções secarem por 10 minutos. Em seguida, reidratar as seções em um XPBS por 10 minutos.

Em seguida, faça permanente no tecido em 0,5% Triton X 100 em um XPBS por 20 minutos. Em seguida, lave as lâminas três vezes por 10 minutos por lavagem com dois XSS e mantenha-as em dois XSSC até que o tampão de desmascaramento seja aquecido. Para desmascarar, pré-aqueça o tampão de citrato no micro-ondas até que o tampão ferva.

Isso é feito enchendo uma bandeja de lâminas de vidro com 200 mililitros de buffer. Coloque a bandeja em um recipiente maior cheio de 500 mililitros de água destilada e pré-aqueça o tampão até ferver. Em seguida, transfira os slides para a bandeja.

Verifique se eles estão completamente cobertos com tampão no micro-ondas. Aqueça as lâminas no buffer por cerca de 20 segundos até que o buffer atinja a ebulição. Não deixe o tampão transbordar.

Em seguida, resfrie as lâminas em temperatura ambiente por dois minutos e repita o ciclo de aquecimento mais seis vezes. É fundamental determinar empiricamente o número e a duração dos ciclos alimentares para a reprodutibilidade da etapa de desmascaramento. O forno de microondas, a bandeja, o recipiente, o volume de buffer na bandeja.

O volume de água no recipiente deve ser mantido idêntico Quando o aquecimento terminar. Transferir as lâminas em dois XSSC durante cinco minutos sob uma hotte, incubar as lâminas numa solução de três a uma a quatro de metanol, ácido acético e PBS durante 15 minutos. Em seguida, incubar as lâminas numa mistura de três a um metanol para ácido acético recentemente preparada durante 15 minutos.

Agora desidrate as seções por meio de incubações sucessivas de 10 minutos em etanol a 70%, seguidas de duas incubações de 10 minutos em etanol puro. Deixe as lâminas secarem em temperatura ambiente por 10 minutos para prepará-las para a sonda. Aplique 80 microlitros de solução de sondagem nas seções secas gota a gota e cubra-as com uma lamínula.

Verifique se a solução de sondagem se espalha por toda a superfície da lamínula e se não há bolhas. Em seguida, sele a lamínula com cimento de borracha e deixe secar. Prossiga com a desnaturação incubando as lâminas a 80 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, transfira rapidamente as lâminas para uma bandeja metálica no gelo por cinco minutos. Siga isso com uma hibridização noturna a 37 graus Celsius no dia seguinte. Remova o cimento de borracha com uma pinça com as corrediças em um bloco de calor de 37 graus Celsius.

Remova a lamínula suavemente com a ponta de uma lâmina de bisturi. Em seguida, lave as seções repetidamente com SSC. Agora, core as amostras por 10 minutos com o corante apropriado como DAPI ou ganchos 3 3 3 4 2 a 0,5 microgramas por mililitro em um XPBS.

Em seguida, lave as lâminas três vezes com um XPBS por 10 minutos por lavagem. Após a terceira lavagem, drene o máximo de líquido possível da lâmina. Em seguida, no final de cada lâmina, aplique 80 microlitros de meio de montagem com um agente anti-desbotamento.

Cubra lentamente o meio com uma lamínula de alta qualidade óptica, evitando a formação de bolhas. Em seguida, sele a lâmina com esmalte e guarde-a no escuro a quatro graus Celsius. No desenvolvimento deste protocolo, vários tampões de sal foram testados para desmascaramento.

Enquanto os tampões de EDTA tendiam a danificar o tecido. Citrato de sódio tris, HCL e água destilada foram adequados para detecção de HSV one para verificar se o protocolo funcionaria com sondas comerciais. A detecção do genoma latente do HSV um foi realizada usando uma sonda PAN HSV uma biotinilada obtida da Enzo Biochem, ambos os padrões de pontos únicos e múltiplos para o genoma do HSV um puderam ser detectados.

Além disso, o protocolo de DNA fish foi testado em camundongos e coelhos infectados com três cepas de HSV um comumente usadas. Em todos os casos, os genomas do HSV um mostraram um sinal irregular com brilho e intensidade variáveis. Além disso, a aplicabilidade do protocolo foi testada no ciclo replicativo do HSV um, realizando DNA fish em tecidos de camundongos submetidos a uma infecção geral por herpes.

Nesses animais, agregados grandes e brilhantes de genomas de HSV um foram detectados em vários tecidos, incluindo os olhos e o cérebro do DRG. O protocolo DNA fish é muito versátil. Permite a codetecção do genoma HSV one e RNAs e proteínas virais ou celulares.

Por exemplo, a codetecção de um genoma de HSV junto com o RNA de HSV um lat é viável, a codetecção de um genoma de HSV com proteínas celulares, como a proteína CE NPA A do Centro MERIC, foi utilizada para codetecção de HSV com os corpos nucleares de cromatina e PML. A proteína A associada TRX foi visualizada com uma coloração tripla mostrando HSV 1D NA em vermelho. Seu produto de RNA lat em azul e um TRX em verde.

Uma vez que o desmascaramento é configurado, o procedimento de DNA do peixe é muito robusto. Pode ser feito em menos de 24 horas em lotes de 20 lâminas ou mais. O desenvolvimento desta técnica permitirá que os pesquisadores que investigam vírus do herpes e outros vírus persistentes explorem, no nível de uma única célula, como os componentes celulares e a arquitetura nuclear podem influenciar a biologia desses vírus.