Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

O objetivo geral deste procedimento é identificar modificações pós-traducionais de proteínas envolvidas em complexos proteicos de plantas, primeiramente expressando de forma transitória ou estável na planta a proteína de interesse marcada com uma etiqueta. Em seguida, extrair as proteínas totais do tecido da planta e imunoprecipitar a proteína de interesse. Depois, separar as proteínas imunoprecipitadas em um gel de acrilamida e extrair e digerir as proteínas da faixa do gel de interesse.

Agora submeta as amostras de proteína para espectrometria de massas. Em última análise, os resultados da espectrometria de massas podem detectar alterações dinâmicas em modificações pós-traducionais, como a fosforilação. Diferentemente de métodos alternativos, como a incubação in vitro de quinase com substrato, este método expressa proteínas em planter.

Assim, você não precisa saber qual quinase é responsável pela fosforilação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia vegetal, como a forma pela qual os sinais são transduzidos em resposta ao estresse, a mudanças ambientais ou ao reconhecimento de patógenos. Além da identificação de locais de fosforilação em complexos de proteínas de resistência ativados, este método pode ser amplamente aplicado a qualquer modificação pós-traducional de qualquer complexo proteico vegetal.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não estão acostumados a trabalhar com grandes quantidades de extrato e a realizar mais etapas do protocolo em um único dia. Para expressão transitória, cultive as cepas de agrobactérias até a fase estacionária. Recolha as agrobactérias por centrifugação a 3000 Gs durante cinco minutos.

Resuspenda os pellets no tampão de infiltração. Infiltra agora. Plantas de N. benthamiana com quatro semanas de idade com bactérias agro utilizando uma seringa de um mililitro sem agulha ou por vácuo com 0,02% de surfactante, de dois a cinco dias após a infiltração.

Colete as folhas infiltradas, congele-as em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius. Em seguida, triture 20 gramas de tecido vegetal com nitrogênio líquido usando um almofariz e um pistilo, adicionando 80 mililitros de tampão C frio às 20 gramas. Misture bem e descongele em gelo.

Agora, homogeneíze com três rajadas de 10 segundos cada, em velocidade máxima. Filtre o homogenato e centrifugue a 30.000 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, adicione 100 microlitros de uma matriz de afinidade adequada a 500 microlitros de tampão bloqueador frio D por cinco minutos a quatro graus Celsius e lave três vezes com um mililitro de tampão D frio. Em seguida, remova o sobrenadante do extrato foliar e passe-o através de uma seringa com filtro de 0,45 micrômetro.

Filtre em um novo tubo sobre gelo. Aliquote o extrato bruto. Para um blot imunológico.

Adicione cinco unidades de tampão de carregamento XSDS, vorteie e aqueça os amostras até fervura para desnaturar. Adicione 50 microlitros da matriz de afinidade, suspensa no tampão D, a cada tubo. Incube com rotação suave por duas horas a quatro graus Celsius, centrifugue para formar o pellet da matriz de afinidade.

Em seguida, retire uma alíquota do extrato não ligado para um blot imunológico. Descarte o restante da amostra, deixando aproximadamente 500 microlitros no fundo do tubo. Resuspenda a suspensão com uma ponteira de grande diâmetro.

Reúna a solução de suspensão mista de ambos os tubos em um único tubo de 1,5 mililitro. Pulsar três vezes por cinco segundos utilizando uma centrífuga de bancada para precipitar a matriz de afinidade e remover o sobrenadante após três a cinco lavagens com um mililitro de tampão D frio. Remova o excesso de tampão D com uma agulha de seringa e elua com 200 microlitros do tampão de eluição apropriado sob agitação constante. Reúna os três EITs em um único tubo.

Em seguida, concentre as proteínas utilizando 30 microlitros de vórtex com resina de absorção. Deixe em repouso por cinco minutos e precipite a resina, descartando o sobrenadante. Adicione 50 microlitros de tampão de carga um XSDS à matriz de afinidade precipitada ou ao vórtex com resina de absorção e aqueça em banho-maria a 80-100 graus Celsius por 10 minutos em um centrífuga com bloco aquecido.

A matriz de afinidade fervida é resina por dois minutos a 10.000. Alíquota GS de cinco microlitros do sobrenadante para bloqueio imunológico e corrida com outras frações em um gel SDS de 10 centímetros de comprimento. Gel para separação e identificação de proteínas fosforiladas por espectrometria de massas.

Carregue os 45 microlitros restantes em um gel de SDS-PAGE para coloração. O gel de SDS-PAGE com azul brilhante de comassie coloidal. Em seguida, desenhe o gel com lavagens abundantes em água, preferencialmente durante a noite.

Agora, com um bisturi limpo, excise a faixa de interesse do gel, cortando a fatia do gel em cubos de dois a quatro milímetros e transfira a amostra para um tubo. Lave os pedaços de gel com 50% acetonitrila e bicarbonato de amônio 50 milimolar até descolorir. Em seguida, remova a solução com pipeta.

Tendo cuidado para não remover os pedaços de gel. Desidrate a amostra com acetonitrila a 100% durante cinco minutos e remova o líquido livre. Em seguida, reduza as ligações dissulfeto das proteínas com DTT a 10 milimolar e incube por 30 a 45 minutos a 56 graus Celsius com agitação. Remova agora o líquido livre para alquilar os resíduos de cisteína.

Adicione 55 milimolar de cloroacetamida por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Remova o líquido livre e, em seguida, lave os pedaços de gel duas vezes com 50% de acetonitrila por 10 minutos. Remova o líquido livre.

Agora desidrate os fragmentos de gel com acetonitrila a 100% durante cinco minutos e remova o líquido livre para a digestão triptíca. Com 40 microlitros da solução de trabalho de tripsina, permita que os fragmentos de gel se reidratem por 10 minutos em tampão de digestão suficiente para cobrir os fragmentos de gel. Incube a 37 graus Celsius durante a noite para interromper a digestão e extraia os peptídeos dos fragmentos de gel com ácido fórmico a 5%, submetendo à sonicação por cinco a 10 minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo, seque os peptídeos por liofilização ou concentrador a vácuo e armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Este experimento purifica o complexo quinase P-R-F-P-T-O de nacoa hamana. Um NACOA hamana transgênico expressando 35 SPTO foi transformado temporariamente com 35 SPRF flag, e o complexo foi imunoprecipitado com Anti-Flag M dois aros. Os imunoblotas ilustram imunoprecipitação eficiente da proteína PRF alvo, sendo que tanto PTO quanto a proteína efetora interagente foram copurificadas com PRF, conforme indicado pela detecção com anticorpos e análise por espectrometria de massas.

Aqui, a estratégia era direcionar a proteína PTO com Anti-Flag. A estratégia foi alterada. A fim de identificar os sítios de fosforilação de PTO.

A quantidade total da proteína PTO, compreendendo tanto o complexo PRF quanto a forma livre, foi imunoprecipitada com Anti-Flag M dois aros e submetida à fracionamento por SDS-PAGE, digestão tríplice em gel e análise por espectrometria de massas, resultando em peptídeos de PTO que cobrem aproximadamente 80% de sua sequência. Curiosamente, um conjunto de sítios de fosforilação única para peptídeos de PTO foi identificado. Observe que sítios de dupla fosforilação foram identificados apenas na presença de alguma proteína efetora.

É importante obter quantidades suficientes de proteína vegetal para identificar componentes de um complexo proteico e também detectar modificações pós-traducionais de uma proteína de interesse. Lembre-se de que o mapeamento de modificações como fosforilação exige uma quantidade razoável de proteína para espectrometria de massas, portanto, ao menos uma faixa tênue deve ser evidente em seu gel após este procedimento. Outros métodos, como a identificação de componentes do complexo, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma pela qual a ativação do complexo imune leva à imunidade funcional.

Não se esqueça de que trabalhar com tampões orgânicos, bactérias e lâminas de barbear BBL pode ser extremamente perigoso; portanto, tome precauções, como o uso de luvas e jalecos de laboratório.