Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

O objetivo geral deste procedimento é determinar a preferência de temperatura da drosófila. Isso é feito preparando primeiro as moscas e o aparelho, que é montado em torno de uma base de alumínio com temperatura controlada. Uma vez que as temperaturas são estabelecidas no aparelho, uma coorte de moscas é carregada e, após meia hora, sua preferência de temperatura é pontuada.

Em última análise, o ensaio pode ser usado com uma grande variedade de condições experimentais. Por exemplo, ritmos circadianos de preferência de temperatura. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo de ritmos alvo.

Uma vez que esses ritmos alvo de preferência de temperatura são controlados por mecanismos diferentes dos da atividade locomotora, esse ensaio de comportamento levará à identificação de novos mecanismos moleculares e celulares que não foram identificados anteriormente usando abordagens de atividade locomotora. Esse método também pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurociência sensorial, como temperatura e sensação de dor. Como esses ensaios comportamentais de temperatura são muito robustos, esse ensaio nos permitirá mapear o circuito neural desde a detecção da temperatura até o processamento, o que nos permitirá mais informações sobre a integração sensorial.

Crie as moscas em incubadoras umidificadas com um ciclo de luz escura 1212. Este protocolo requer duas dessas incubadoras definidas para horários opostos. A incubadora noturna deve estar escura durante o horário normal de trabalho.

Ao acessar uma incubadora durante seu ciclo noturno, use a luz vermelha para iluminar a incubadora. Colete coortes de 20 a 30 moscas recém-nascidas de ambos os sexos e, em qualquer proporção, mantenha-as em sua incubadora por dois a três dias antes de executá-las no ensaio. Pelo menos cinco coortes são necessárias para cada condição testada.

Para construir uma câmara de teste de preferência de temperatura, uma tampa de plexiglass deve ser projetada para caber em uma placa de alumínio sob a placa. Coloque quatro dispositivos peltier. Cada um dos dispositivos peltier deve ser conectado aos controladores de temperatura que podem gerar temperaturas frias ou quentes para evitar o superaquecimento dos pelters.

Um sistema de resfriamento de computador é conectado a tubos de água, ventiladores de resfriamento de ar e fontes de alimentação para monitorar as temperaturas na placa de alumínio. As sondas de temperatura são embutidas na borda da placa de alumínio e conectadas a controladores de temperatura. Defina os lados frio e quente da placa para 12 e 36 graus Celsius, respectivamente, na tampa.

Conecte seis sondas de temperatura em várias posições dentro de uma das pistas. Coloque o aparelho em uma sala ambientalmente controlada a 25 graus Celsius e entre 65 e 75% de umidade relativa. Certifique-se de monitorar essas condições.

A sala deve ter controle de luz e boa circulação de ar para evitar que o ar circulante desestabilize a temperatura. Proteja a área de teste com uma cortina de chuveiro. Luz uniforme deve ser usada no aparelho porque a luminosidade pode influenciar a preferência de temperatura.

Ligue o aparelho por pelo menos 30 minutos. A fim de estabelecer um gradiente de temperatura estável na superfície da placa. Cubra a tampa do aparelho de comportamento com um repelente de água para evitar que as moscas subam pelas paredes ou teto da tampa.

Limpe o excesso de repelente de água e deixe a tampa conduzir por 25 a 30 minutos, se necessário, fita adesiva dupla pode ser usada meia hora depois. Limpe qualquer condensação da placa de alumínio. Em seguida, coloque a tampa de plexiglass na placa de alumínio e prenda com seis grampos C.

É muito importante que a tampa esteja selada. Monitore bem a temperatura do ar entre a placa e a tampa. Certifique-se de que as sondas não toquem na placa de alumínio ou na tampa de plexiglass.

Deixe a tampa se equilibrar no prato por pelo menos 15 minutos. Eventualmente, o gradiente de temperatura do ar entre a placa de alumínio e a tampa variará de 18 a 32 graus Celsius No caso de um experimento comportamental diurno, retire os frascos de mosca da incubadora diurna e teste o ensaio comportamental à luz imediatamente antes de um experimento comportamental noturno. Retire os frascos para moscas da incubadora noturna.

Embrulhe-os em papel alumínio e coloque-os em uma caixa no quarto escuro sob uma lâmpada vermelha. Para experimentos durante períodos escuros, as luzes da sala devem permanecer apagadas o tempo todo até que os experimentos comportamentais sejam concluídos. No entanto, lâmpadas vermelhas podem ser usadas para iluminação usando aspiração.

Carregue 20 a 25 moscas no espaço entre a placa de alumínio. Em seguida, cubra os orifícios com lamínulas para evitar que as moscas escapem. Deixe as moscas se moverem por 30 minutos.

Quando o experimento estiver concluído, tire pelo menos duas fotos para os experimentos de luz. Um flash precisa ser usado para os experimentos escuros. Verifique a temperatura do aparelho.

Observe a temperatura ambiente, bem como a umidade para remover as moscas conectadas tubo de dióxido de carbono perto do orifício na parte superior do aparelho para anestesiar as moscas, descarte as moscas. Eles não devem ser testados novamente. Em seguida, limpe qualquer condensação ou umidade da placa.

Recoloque a tampa na placa e aperte com os grampos em preparação Para o próximo experimento, calcule o gradiente de temperatura da seguinte forma. Primeiro, determine onde as sondas de temperatura são colocadas usando uma régua com base nos locais das sondas e suas temperaturas registradas. Desenhe linhas retas representando cada grau de temperatura na posição apropriada na foto da posição final da mosca.

Em seguida, conte o número de moscas entre cada intervalo de um grau Celsius. Exclua quaisquer moscas nas paredes ou no teto da tampa. Calcule a porcentagem de moscas em cada faixa de temperatura de cada pista e, em seguida, a temperatura média preferida para cada condição.

Colete dados de pelo menos cinco ensaios. Em seguida, use os valores médios de cada tentativa para determinar a temperatura média preferida com erros. Moscas normais levantadas a 25 graus Celsius, preferem uma temperatura mais baixa pela manhã do que à noite.

Um aumento de um a 1,5 grau na preferência de temperatura foi medido durante o dia e um aumento de 1,5 a dois graus Celsius. Observou-se decréscimo na transição do dia para a noite. O ensaio também pode ser usado para testar moscas mutantes.

Por exemplo, verificou-se que a preferência de temperatura de moscas com uma mutação defeituosa na viagem, um canal iônico é maior do que a dos controles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o ensaio de comportamento de preferência de temperatura. Este método permite a investigação de mecanismos moleculares e circuitos neurológicos, ofa e relógios, e como o cérebro integra as diferentes pistas ambientais e nos relógios biológicos.