Name: Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a medir o ritmo de preferência térmica (TPR) em Drosophila usando uma câmara com gradiente de temperatura controlado. Este método permite investigar saídas circadianas independentes da atividade locomotora.

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Somos gratos aos Drs. Aravinthan Samuel e Marc Gershow que ajudaram a desenvolver a versão inicial do aparelho comportamental e Matthew Batie que modificou o aparelho comportamental. Esta pesquisa foi apoiada pelo Trustee Grant do Hospital Infantil de Cincinnati, JST/PRESTO, March of Dimes e NIH R01 GM107582 a F.N.H.

1. Preparação de Moscas
<ol><li>Experimentos de Luz Escura (LD)
	<ol>
<li>Levante moscas em incubadoras (25 °C/40-60% umidade relativa (RH)) sob ciclos leves de 12 horas/escuros de 12 horas (LD). A intensidade de luz das incubadoras é de ~500-1.000 lux.</li>
		<li>Duas incubadoras são necessárias para completar os ensaios comportamentais durante um período de 24 horas. Ambas as incubadoras devem ter uma luz programável com funções ON OFF. Eles também devem ter portas sólidas que não são permeáveis à luz (ou seja, sem vidro ou plexiglass). Nota: Uma incubadora deve ser designada como incubadora "day" e definida para um ciclo LD de 12 horas de luz e 12 horas escuras. A segunda incubadora deve ser designada como incubadora "noturna" e definida para o inverso do primeiro com 12 horas de ano, seguida de 12 horas de luz. A incubadora noturna deve ser colocada no quarto acessível no escuro, de tal forma que moscas que experimentam condições noturnas podem ser facilmente acessadas para os experimentos.</li>
		<li>Coloque os frascos de mosca em incubadoras dia ou noite. Colete moscas recém-eclodidas em um frasco fresco, 20-30 por ensaio e mantenha na mesma incubadora por 2-3 dias.</li>
		<li>Após 2-3 dias, use moscas para o ensaio comportamental de preferência de temperatura.<ol>
<li>Para experimentos diurnos (hora de Zeitgeber (ZT) 0-12), colete moscas da incubadora do dia.</li>
			<li>Logo antes dos experimentos comportamentais, tire os frascos de mosca coletados da incubadora do dia.</li>
			<li>Para experimentos noturnos (ZT 13-24), colete moscas da incubadora noturna.</li>
			<li>Logo antes dos experimentos comportamentais, tire os frascos de mosca coletados da incubadora noturna, enrole com papel alumínio e coloque em uma caixa na sala escura sob uma lâmpada vermelha. Nota: Uma vez que o ensaio comportamental de preferência de temperatura é realizado sob a escuridão para os experimentos noturnos, a exposição à luz às moscas deve ser evitada até o final dos experimentos comportamentais. Nota: As moscas não devem ser expostas ao dióxido de carbono no dia em que os experimentos ocorrerão.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos de Escuridão Constante (DD)
	<ol>
<li>
Dia DD
		<ol>
<li>Uma incubadora extra é necessária para experimentos do dia DD, que chamamos de incubadora de "transição" para o resto do manuscrito. A incubadora de transição deve ser colocada na sala acessível no escuro, de tal forma que moscas que experimentam condições dD podem ser facilmente acessadas para os experimentos. Um exemplo de cronograma de luz para uma incubadora de transição teria a luz ACESA das 13:00 às 19:00 e a luz OFF às 19:00 às 13:00(Figura 1).</li>
			<li>Recolhe as moscas que foram levantadas na incubadora do dia. Coloque os frascos de mosca na incubadora de transição entre 13h e 19h, quando a luz estiver acesa. Desta forma, as moscas ficam devidamente expostas à luz até às 19h, momento em que a luz se desliga.</li>
			<li>No dia seguinte, antes das 13h, em condições escuras, tire os frascos de mosca da incubadora de transição, enrole-os com papel alumínio e coloque-os em uma caixa. Mantenha a caixa em qualquer incubadora por mais um dia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Noite DD
		<ol>
<li>Colete as moscas que foram levantadas na incubadora noturna no escuro sob uma lâmpada vermelha. Ou, adicionalmente, coletar as moscas quando a luz da incubadora noturna estiver acesa.</li>
			<li>Enrole os frascos coletados com papel alumínio no escuro sempre que as luzes estiverem desligadas e coloque os frascos em uma caixa. Mantenha a caixa em qualquer incubadora por mais dois dias(Figura 1B). Nota: Uma vez que o ensaio comportamental de preferência de temperatura é realizado sob a escuridão para os experimentos noturnos, a exposição à luz às moscas deve ser evitada até o final dos experimentos comportamentais.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos de Luz Constante (LL)
	<ol>
<li>
Dia LL
		<ol>
<li>Uma incubadora extra é necessária para experimentos diários ll. Esta incubadora mantém a condição LL (25 °C, 800 lux), com a luz ACESA continuamente.</li>
			<li>Recolher moscas que foram levantadas na incubadora do dia. Coloque os frascos de mosca na incubadora LL a qualquer momento durante seu "dia".</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Noite LL
		<ol>
<li>Recolher moscas que foram criadas na incubadora noturna. Transfira os frascos de mosca da incubadora noturna para a incubadora LL durante o tempo em que a luz na incubadora noturna estiver acesa. Nota: Por exemplo, a luz se apaga às 7h da manhã na incubadora noturna. Transfira os frascos de mosca da incubadora noturna para a incubadora LL antes das 7h e mantenha os frascos na incubadora LL por mais 4 dias. Nota: No dia 4 em condições de LL, a oscilação da atividade locomotor é abolida15,16, enquanto o TPR ainda é sustentado 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. O aparelho para o ensaio comportamental de preferência de temperatura
<ol><li>Coloque uma tampa de plexiglass (29 cm x 19,2 cm)(Figura 4) em uma placa de alumínio.</li>
	<li>Monitore a temperatura do ar entre a placa e a tampa. Seis sondas de temperatura são anexadas em várias posições no interior da tampa dentro de uma das pistas(Figura 2). Nota: Certifique-se de que as sondas não toquem na placa de alumínio ou na tampa do plexiglass. A temperatura do ar deve ser definida para um gradiente de 18-32 °C.</li>
	<li>Coloque o aparelho em uma sala ambiental mantida em 25 °C/65-75% RH. Esta sala precisa ser selada de qualquer luz externa. Uma sala ambiental é normalmente equipada com ventiladores para manter uma certa temperatura e umidade. Nota: O ar do ventilador provavelmente perturba um gradiente de temperatura estável no aparelho. Para evitar isso, utilizamos uma folha transparente que cobre a área ao redor do aparelho.</li>
	<li>Prepare um termômetro e higrômetro para verificar a temperatura e a umidade na sala ambiental. Nota: A luz influencia a preferência de temperatura de Drosophila3. A mesma intensidade de luz deve ser fornecida no aparelho uniformemente. A intensidade das luzes da nossa sala ambiental é de ~800 lux. Nota: Quando os experimentos comportamentais forem feitos, coloque um tubo conectado do tanque de CO2 ou forneça perto do orifício da parte superior do aparelho, a fim de anestesiar e se livrar das moscas.</li>
</ol>3. Preparação de aparelhos para uso
<ol><li>Ligue o aparelho por pelo menos 30 minutos para estabelecer o gradiente de temperatura corretamente na superfície da placa(Figura 3).</li>
	<li>Cubra o aparelho comportamental com repelente de água para evitar que as moscas subam as paredes ou o teto da tampa. Limpe o repelente de água em excesso e deixe a tampa por 25-30 minutos para secar.</li>
	<li>Remova qualquer condensação na placa de alumínio. Coloque a tampa do plexiglass na placa de alumínio e fixe com seis grampos C(Figura 2). Nota: É muito importante que a tampa esteja bem selada, se necessário, pode ser usada fita adesiva dupla.</li>
	<li>Deixe a capa por pelo menos 15 minutos. O gradiente da temperatura do ar entre a placa de alumínio e a tampa é criado de 18-32 °C.</li>
</ol>4. Ensaio de comportamento de preferência de temperatura
<ol><li>Carregue as moscas no espaço entre a placa de alumínio e a tampa do plexiglass do aparelho através de pequenos orifícios no centro de cada faixa da tampa (Figuras 2 e 4). Cubra os orifícios com deslizamentos de cobertura para evitar que as moscas escapem.</li>
	<li>Para as condições escuras, desligue todas as luzes da sala ambiental. Uma lâmpada vermelha pode ser usada quando as moscas são colocadas no aparelho. Certifique-se de que as moscas não estão expostas a nenhuma luz, exceto uma lâmpada vermelha até que os experimentos comportamentais estejam prontos.</li>
	<li>Para cada teste, use 20-25 moscas adultas, que não devem ser reutilizadas em testes subsequentes. O ensaio comportamental é realizado por 30 minutos. Tire algumas fotos com ou sem um flash. Tenha cuidado para não fazer muito barulho ou qualquer movimento repentino durante os experimentos.</li>
	<li>Regissuas temperaturas de todas as seis sondas no aparelho. Tome nota da temperatura ambiente, bem como da umidade.</li>
	<li>Anestesiar as moscas do aparelho com gás carbônico, soltar os grampos, remover a tampa do plexiglass e remover as moscas da placa. Após cada experimento, as moscas são descartadas. Limpe qualquer condensação ou umidade da placa. Substitua a tampa da placa e aperte com os grampos em preparação para o próximo experimento.</li>
	<li>Para ter uma representação da preferência de temperatura durante todo o dia, o período de 24 horas é dividido em oito fusos horários, quatro durante o dia e quatro à noite. Por exemplo, usamos estes ZT ou CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24. Nota: Uma vez que as variações do fenótipo causadas pelos efeitos de mascaramento são esperadas logo após a luz ser acesa (ZT0) ou OFF (ZT12), não examinamos o comportamento de preferência de temperatura durante esses tempos (ZT ou CT 0-1, 11.5-13 e 23,5-24). Pelo menos cinco ensaios devem ser feitos em cada fuso horário para que os resultados sejam estatisticamente sólidos.</li>
</ol>5. Análise de dados
<ol><li>Calcule o gradiente de temperatura da seguinte forma: Determine onde as sondas de temperatura são colocadas com base nas duas réguas que são colocadas na parte superior e inferior da tampa do plexiglass ao longo das bordas(Figura 2A).</li>
	<li>Estima-se que o gradiente de temperatura entre as sondas de temperatura seja linear. Com base nos locais das sondas de temperatura, bem como em suas temperaturas registradas correspondentes, desenhe linhas representando cada grau de temperatura na posição apropriada nas imagens. Conte o número de moscas localizadas em cada intervalo de grau. Exclua as moscas nas paredes ou no teto da tampa.</li>
	<li>Calcule a porcentagem das moscas em cada faixa de temperatura de cada pista. Uma temperatura preferencial média é calculada somando os produtos da porcentagem de moscas e temperatura de cada intervalo, como mostrado abaixo: % das moscas x 18,5 °C + % das moscas x 19,5 °C + % das moscas x 20,5 °C ....+ % das moscas x 31,5 °C + % das moscas x 32,5 °C.</li>
	<li>Calcule a temperatura preferencial média em cada fuso horário: O comportamento de preferência de temperatura é realizado >5 vezes durante cada fuso horário (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24). Para calcular a temperatura média preferencial em cada fuso horário, a temperatura média preferencial de cada ensaio é média em conjunto. As barras de erro s.e.m. são iguais ao erro entre as tentativas.</li>
</ol>

<ol><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li>
<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li>
<li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li>
<li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila.%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li>
<li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Thermal+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Therm.+Biol%22%5BJournal%5D)">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li>
<li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li>
<li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li>
<li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+rhythm+of+body+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li>
<li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li>
<li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li>
<li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li>
<li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li>
</ol>

Não há nada para revelar.

Aqui, ilustramos os detalhes do aparato comportamental de preferência de temperatura e análise do comportamento do TPR. Drosophila exibe as características salientes, robustas e reprodutíveis do TPR controlado pelo relógio. No entanto, nossos dados sugerem que pelo menos dois fatores, luz ambiente e idade, perturbam significativamente os fenótipos comportamentais do TPR.
Observamos que a luz afeta significativamente a preferência de temperatura em Drosophila. É consistente co...

A temperatura é uma sugestão ambiental onipresente. Os animais apresentam uma variedade de comportamentos para evitar temperaturas prejudiciais e buscar os confortáveis. Drosophila apresentam um comportamento robusto de preferência de temperatura6,7. Quando as moscas são liberadas em um gradiente de temperatura de 18-32 °C, as moscas evitam temperaturas quentes e frias e finalmente escolhem uma temperatura preferencial de 25 °C pela manhã3. Os sensores de temperatura quente são um conjunto de neurônios termossensoriais, neurônios AC, que expressam o potencial do receptor transitório Drosophila (TPR), TRPA16,9. Os sensores de temperatura fria estão localizados nos 3º segmentos de antenas, uma vez que a ablação dos 3º segmentos de antenas causa a falta de evasão de temperatura fria6. Recentemente, foi identificada a proteína TRPP Brivido (Brv)10. Como o Brv é expresso nos 3º segmentos de antenas e media a detecção a frio, o Brv é uma possível molécula de sensoriamento a frio, que é fundamental para o comportamento de preferência de temperatura. Em suma, as moscas usam esses dois sensores de temperatura para evitar as temperaturas quentes e frias e encontrar uma temperatura preferida.
Enquanto os mamíferos geram calor para regular sua temperatura corporal, os ectotherms geralmente adaptam suas temperaturas corporais à temperatura ambiente11. Alguns ectotherms são conhecidos por exibir um comportamento diário de TPR que acredita-se ser uma estratégia para os ectotherms para regular seu BTR12. Para determinar se as moscas apresentavam TPR, repetimos a análise comportamental da preferência de temperatura em vários pontos durante um período de 24 horas. Descobrimos que a Drosophila exibe um TPR diário, que é baixo pela manhã e alto à noite e segue um padrão semelhante ao do BTR em humanos13.
Em Drosophila,há ~150 neurônios de relógio no cérebro. Os neurônios do relógio que regulam a atividade locomotor são chamados osciladores M e E. No entanto, curiosamente, os osciladores M e E não regulam tpr, em vez disso, mostramos que os neurônios do relógio DN2 no cérebro regulam a atividade TPR, mas não locomotor. Esses dados indicam que o TPR é regulado independentemente da atividade locomotor. Notavelmente, o BTR mamífero também é regulado independentemente da atividade locomotor. Estudos de ablação em ratos mostram que o BTR é controlado através de neurônios SCN específicos que visam um subconjunto diferente de neurônios de zona subparaventricular do que aqueles que controlam a atividade locomotor14. Portanto, nossos dados consideram a possibilidade de que o MPI mamífero e a mosca TPR sejam evolucionariamente conservados3, uma vez que tanto a mosca TPR quanto a MMH de mamíferos exibem ritmos de temperatura circadianos dependentes do relógio, que são regulados independentemente da atividade locomotor.
Aqui, descrevemos os detalhes de como analisar o ensaio comportamental do TPR em Drosophila. Este método permite a investigação não apenas do mecanismo molecular e circuitos neurais do TPR, mas também de como o cérebro integra diferentes pistas ambientais e relógios biológicos internos.

<table><tbody><tr><td>Bright Lab Jr. Safelight</td><td>Amazon</td><td>#B00013J8UY</td><td>Luz vermelha para salas escuras</td></tr><tr>Produtos <td></td><td>Rain X</td><td>SOPUS</td><td>Repelente à água: Aplique a tampa de plexiglass</td></tr><tr><td>C-Clamp</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura/higrômetro</td><td>Fisher</td><td>15-077-963</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos Peltier</td><td>TE Technology, Inc.</td><td>HP-127-1.4-1.15-71P</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Fluke</td><td>Fluke 52II</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de bancada</td><td>Oven Industries</td><td>5R6-570-15R e 5R6-570-24R</td><td></td></tr><tr><td>Sonda do sensor de temperatura</td><td>Oven Industries</td><td>TR67-32</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td></td><td></td> ATX genérica de 480 Watts <td>sistema de refrigeração do computador</td></tr><tr><td>MCR220-QP-RES Radiador duplo de 120 mm com reservatório&nbsp;</td><td>Sistema de refrigeração do computador</td> <td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>MCP350 Bomba em linha de 12V DC</td><td>Sistema de refrigeração do computador</td><td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Placa gráfica MCW50 refrigerador líquido</td> Sistema <td>de refrigeração do computador</td><td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de SY1225SL12SH Scythe Kaze-Jyuni</td> Sistema <td>de refrigeração do computador</td> <td>Crazy PC</td><td></td></tr></tbody></table>

projeto e análise do comportamento de preferência de temperatura e seu ritmo circadiano em drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

O relógio circadiano regula muitos aspectos da vida, incluindo sono, atividade locomotor e temperatura corporal (BTR) ritmos1,2. Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, chamada ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferencial em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite 3. Surpreendentemente, a atividade TPR e locomotor são controladas através de neurônios circadianos distintos3. A atividade locomotor de Drosophila é uma produção comportamental circadiana bem conhecida e tem proporcionado fortes contribuições para a descoberta de muitos genes e mecanismos de relógio circadianos conservados4. Portanto, a compreensão do TPR levará à identificação de mecanismos circadianos moleculares e celulares até então desconhecidos. Aqui, descrevemos como executar e analisar o ensaio TPR. Essa técnica não só permite dissecar os mecanismos moleculares e neurais do TPR, mas também fornece novas percepções sobre os mecanismos fundamentais das funções cerebrais que integram diferentes sinais ambientais e regulam comportamentos animais. Além disso, nossos dados publicados recentemente sugerem que a mosca TPR compartilha características com o mamífero BTR3. Drosophila são ectotherms, em que a temperatura corporal é tipicamente regulada comportamentalmente. Portanto, o TPR é uma estratégia usada para gerar uma temperatura corporal rítmica nessas moscas5-8. Acreditamos que uma exploração adicional do Drosophila TPR facilitará a caracterização dos mecanismos subjacentes ao controle da temperatura corporal nos animais.

Um exemplo do ritmo de preferência de temperatura é mostrado na Figura 5. Se o procedimento de comportamento for feito com sucesso, as moscas devem exibir um TPR no qual preferem uma temperatura baixa pela manhã e temperatura mais alta à noite. O aumento ~1-1,5 °C durante o dia na preferência de temperatura deve ser observado durante o dia, independentemente do fundo genético, uma vez que mostramos que as moscas w1118, yw e Canton S exibem uma preferência de temperat...

Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferida em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite. O TPR é regulado independentemente de outra produção circadiana, atividade locomotor. Aqui descrevemos o desenho e análise do TPR em Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a preferência térmica de drosófila. Isso é realizado primeiramente preparando as moscas e o aparelho, que é montado ao redor de uma base de alumínio com temperatura controlada. Uma vez estabelecidas as temperaturas no aparelho, um grupo de moscas é introduzido e, após meia hora, sua preferência térmica é avaliada.No fim das contas, o ensaio pode ser usado com uma grande variedade de condições experimentais. Por exemplo, ritmos circadianos de preferência térmica. Este método pode ajudar a responder as questões principais na área de ritmos-alvo.Como esses ritmos-alvo da preferência térmica são controlados por mecanismos diferentes dos da atividade locomotora, este ensaio comportamental levará à identificação de novos mecanismos moleculares e celulares que não foram previamente identificados por meio de abordagens de atividade locomotora. Este método também pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da neurociência sensorial, como a sensação de temperatura e dor. Como esses ensaios comportamentais de temperatura são muito robustos, o ensaio nos permitirá mapear o circuito neural desde a detecção até o processamento da tempe

design-analysis-temperature-preference-behavior-its-circadian-rhythm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos os procedimentos para registrar os ritmos diários de atividade locomotora...

Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

As moscas-das-frutas Drosophila podem distinguir pequenas mudanças de temperatura e, portanto, selecionar ambientes com condições térmicas favoráveis. Este vídeo descreve um ensaio comportamental que testa a preferência de temperatura de larvas de Drosophila em um gradiente térmico linear.

Ensaio de gradiente de temperatura: um método para testar a preferência de temperatura em larvas de Drosophila

Este vídeo descreve o sistema de monitoramento de atividade (DAM) da Drosophila usado para rastrear a atividade locomotora. Os pesquisadores usam dados de atividade coletados do DAM para estudar os ritmos circadianos em moscas-das-frutas. O clipe de protocolo em destaque mostra como carregar moscas no dispositivo e registrar dados de atividade para experimentos circadianos.

drosófila Monitor de Atividade (DAM): Um Método para Medir a Atividade Locomotora em Moscas

Aqui nós descrevemos um teste de preferência claro-escuro para Drosophila larva. Este ensaio fornece informações sobre regulação inata e circadiano da luz de sensoriamento e processamento photobehavior.

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

O circuito de alimentação em larvas de Drosophila melanogaster serve um modelo simples, mas poderosa que permite mudanças na taxa de alimentação a ser correlacionada com alterações no circuito neural stomatogastric. Este circuito é composto por neurónios serotonérgicos centrais que enviam projecções para os ganchos na boca, bem como o tubo digestivo anterior.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.

Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Aqui, detalhamos como sincronizar drosophila a um dia circadiano. Este é o primeiro e mais importante passo necessário para o estudo de ritmos biológicos e cronobiologia.

Circadiano De Drosophila Melanogaster

Os insetos têm uma faixa de temperatura ambiental ideal na qual eles procuram permanecer dentro, e muitos fatores externos e internos podem alterar essa preferência. Aqui, descrevemos um método econômico e simples para estudar a escolha da temperatura, que permite que os insetos exibam livremente seus comportamentos naturais.

Determinando a preferência de temperatura de mosquitos e outros ectotérmicos

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Aprenda a medir o ritmo de preferência térmica (TPR) em Drosophila usando uma câmara com gradiente de temperatura controlado. Este método permite investigar saídas circadianas independentes da atividade locomotora.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

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