Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade citotóxica de células T CD oito específicas do antígeno usando um ensaio de citometria de fluxo baseado em células. Isso é realizado primeiro expandindo as células T CD oito efetores por seis dias na presença do peptídeo de interesse na segunda etapa, as células T CD alvo quatro são pulsos com o peptídeo de interesse e, em seguida, misturadas com células TT CD quatro não postadas. Em seguida, as células T CD oito efetoras e as células T CD quatro alvo são co-cultivadas por seis horas em diferentes proporções efetor para alvo.

Na etapa final, a morte das células T CD quatro alvo carregadas com peptídeos e o número de células T CD oito efetoras são quantificados por citometria de fluxo. Em última análise, a capacidade intrínseca de matar as células T CD oito específicas do antígeno expressas em unidades líticas pode ser calculada. As principais vantagens desta técnica de oximatéria como o ensaio de liberação de aro, é que esta técnica usa células-alvo primárias autólogas em vez de linhagens celulares imortalizadas e a célula-alvo real.

Isso e o número de células efetoras são quantificáveis no nível de uma única célula. No início do tempo, o assistente de pesquisa em meu laboratório estará demonstrando o procedimento para isolar as oito células efetoras positivas do CD. Comece descongelando o pbmc criopreservado autólogo em banho-maria a 37 graus Celsius e, em seguida, lave as células em até 50 mililitros de meio completo.

Após a contagem, diluir o pbmc a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro em meio completo e, em seguida, adicionar IL dois e o peptídeo de interesse à cultura. Em seguida, semeie um mililitro da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Após três dias de cultura, substitua metade do sobrenadante por meio completo fresco Após seis dias de cultura, use uma pipeta multicanal para transferir as células para um reservatório estéril e, em seguida, conte e lave as células.

Suspender novamente o pellet a 50 milhões de células por mililitro num tampão de separação e incubar o pbmc num tubo inferior redondo de 14 mililitros com um cocktail de enriquecimento de células T positivas CD oito humanos a 50 microlitros por mililitro de células à temperatura ambiente Após 10 minutos, incubar as células com partículas magnéticas conjugadas anti CD oito IgG a 150 microlitros por mililitro durante mais cinco minutos, e, em seguida, aumente a suspensão da célula para sete mililitros com tampão de separação adicional. Coloque o tubo no ímã de separação após cinco minutos com o tubo ainda no ímã, despeje as células em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, corar uma pequena alíquota das células com anticorpos contra CD três e CD oito em PBS suplementado com 2% de FBS por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Confirme se a pureza das células é 95% CD oito positivo ou superior por citometria de fluxo. Agora adicione 225 microlitros de meio completo em cinco tubos com tampa de rosca e, em seguida, dilua em série as células de um para dois para um para 32. Para isolar o CD, quatro células-alvo positivas começam descongelando o pbmc criopreservado autólogo em banho-maria a 37 graus Celsius.

Transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio. Enriqueça para células T que expressam quatro CDs por separação de partículas magnéticas, como acabamos de demonstrar, confirmando uma pureza de 95% ou superior de células T positivas para CD quatro por citometria de fluxo. Depois de contar as células, divida-as em dois tubos cônicos de 15 mililitros e, em seguida, lave-as em PBS quente e suspenda os pellets a 20 milhões de células por mililitro em PBS.

Depois de garantir que as células estejam protegidas da coloração leve, metade do CD quatro células T positivas com uma solução de alto trabalho CFSE recém-preparada para uma concentração final de 0,2 milimolar e a outra metade em uma solução de baixo trabalho CFSE recém-preparada para uma concentração final de 0,04 milimolar por 15 minutos a 37 graus Celsius em 5% de CO2. No final do período de coloração, gire as células e ressuspenda os grânulos em um mililitro de meio completo quente para extinguir a reação de marcação. Pulsar as células T CFSC baixas de quatro células T positivas com uma concentração final de cinco microgramas por mililitro do peptídeo de interesse em meio completo por 45 minutos na incubadora de cultura de células.

Após a incubação, lave as populações de células T altas e baixas do CFSC. Duas vezes meios incompletos e resus suspendem ambas as suspensões celulares em 200.000 células por mililitro. Cada mídia incompleta, em seguida, misture as duas populações-alvo em uma proporção de um para um CFSE alto para CFSE baixo.

Agora adicione 100 microlitros do CD alvo misto quatro células T positivas a cada poço em uma placa redonda de fundo de 96 poços e, em seguida, semeie um microlitro de cada CD oito suspensão de células T positivas em duplicata para um volume final de 200 microlitros por poço. Meça a apoptose basal semeie três poços apenas com células-alvo e, em seguida, incube a co-cultura por seis horas na incubadora de cultura de células. Após a conclusão da incubação, transfira as células para uma placa de VBO 96 Well e core cada poço com peptídeo conjugado PE MHC Tetramers por 15 minutos.

Na incubadora de cultura de células, lave as células com PBS suplementado com 2% de FBS e, em seguida, core as células por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidas da luz após a lavagem das células. Novamente, suspenda novamente os pellets em 100 microlitros de 2% de formaldeído em PBS e analise as células por citometria de fluxo. Após a co-cultura, as células são analisadas e fechadas conforme demonstrado nesses gráficos de pontos.

A proporção de células-alvo CFSE altas viáveis versus CFSE baixas, não postadas ou pulsadas por peptídeos, é analisada a partir de um pequeno avanço por lado As células vivas GA de dispersão são bloqueadas em células T vivas mortas negativas e CD quatro positivas são plotadas no CFSE para analisar a proporção de células CFSE baixas versus células CFSE altas. Em seguida, uma porta de dispersão maior é criada para enumerar o número total de células efetoras e alvo mortas ou vivas. Após a incubação de seis horas, CD oito células T positivas para tetrâmero positivo e CFSE, quatro células T positivas para baixo CD são plotadas para analisar a proporção de células efetoras versus células-alvo.

O número total de células T efetoras CD oito positivas é então determinado por gating no CD oito células positivas de tetrâmero positivo. O número total de células-alvo é determinado por gating no CD quatro células T positivas, CFSE, células baixas e vivas mortas positivas e negativas. A proporção alvo de células CFSE baixo versus CFSE alto é de um para um.

Quando as quatro células-alvo positivas para CD são cultivadas na ausência de células efetoras, essa proporção diminui drasticamente. Quando as células de pulso positivo baixo CFSE são incubadas. Com a população total de oito células T positivas para CD contendo oito células T efetoras positivas para o antígeno.

À medida que a proporção diminui, o CFSE CD baixo, quatro células-alvo de pulso positivo começam a se tornar mortas-vivas positivas A diluição das células efetoras, portanto, resulta em uma restauração da proporção CFSE e, finalmente, uma restauração no número de pulsos peptídicos viáveis, CFSE, CD baixo quatro células T alvo positivas. A porcentagem de lise específica pode então ser plotada em função da proporção entre o efetor e o alvo em uma escala logarítmica. Conforme demonstrado no gráfico, uma regressão linear é calculada a partir do gráfico e a equação da linha de tendência é usada para calcular as unidades líticas.

Esse é o número de células T efetoras positivas CD oito necessárias para matar 30% de 1 milhão de células T positivas para determinar a capacidade citolítica intrínseca das células T positivas para CD oito antígeno-específicas e para comparar os resultados entre os doadores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como usar a citometria para medir a atividade óxica de células T CD específicas do antígeno. Essa técnica também pode ser facilmente adotada para o seu próprio tipo de célula F.