Name: Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a medir a atividade citotóxica de células T CD8+ antígeno-específicas usando um ensaio baseado em células com citometria de fluxo. Este método utiliza células-alvo autólogas primárias para avaliar a capacidade lítica em unidades líticas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Escritório de Turismo, Comércio e Desenvolvimento Econômico da Flórida.

1. Preparação de células T CD8+ efetoras
<ol>
	<li>Descongele PBMCs criopreservadas autólogas (2-3 frascos de 50 x 106 células) transferindo o criovial de nitrogênio líquido para um banho-maria a 37 ° C.</li>
	<li>Lave as células enchendo o tubo a 50 ml com RPMI completo (4 mM de L-glutamina e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina, suplementado com 10% de FBS). Contar PBMCs e ressuspender células a uma concentração de 5 x 106/ml em RPMI completo.</li>
	<li>Adicione peptídeo específico (5 μg / ml) e IL-2 (10 ng / ml) aos PBMCs.</li>
	<li>Estabelecer a cultura em placa de 96 poços profundos; semear 1 ml de suspensão celular em cada poço.</li>
	<li>Após 3 dias de cultura, substitua metade do meio de cultura celular por RPMI completo fresco.</li>
	<li>Após 6 dias de cultura, coletar todos os PBMCs com pipeta multicanal e transferir células em reservatório estéril.</li>
	<li>Contar, lavar e ressuspender PBMCs a 5 x 107/ml no tampão de separação recomendado em tubos de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o cocktail de enriquecimento de células T CD8+ humanas a 50 μl/ml de células. Misture e incube em temperatura ambiente por 10 min. Adicionar partículas magnéticas a 150 μl/ml e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Aumente a suspensão celular até 7 ml adicionando o tampão de separação. Proceda ao isolamento imunomagnético da célula T CD8+ intocada, colocando o tubo no ímã. Após 5 min, com o tubo ainda no ímã, despeje as células de interesse em um novo tubo cônico de 15 ml. Pegue uma pequena alíquota e core as células com anticorpos contra CD3 e CD8 em 1X PBS-2% FBS por 30 min a 4 ° C. A pureza das células T CD8+ pode então ser medida por citometria de fluxo com uma pureza esperada de 95% ou superior.</li>
	<li>Ressuspenda as células T CD8+ em 450 μl com RPMI completo.</li>
	<li>Adicione 225 μl de RPMI completo em 5 tubos com tampa de rosca.</li>
	<li>Preparar diluições seriadas (de 1:2 a 1:32) transferindo 225 μl de CD8+ para o tubo seguinte (ver figura 1 painel superior).</li>
</ol>
2. Preparação de células T CD4+ alvo
<ol>
	<li>Descongelar PBMCs criopreservadas autólogas (1 frasco para injetáveis de 50 x 106 células) transferindo o criogenio do nitrogênio líquido para um banho-maria a 37 °C.</li>
	<li>Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 50 ml contendo 10 ml de RPMI.</li>
	<li>Lave as células e ressuspenda PBMCs a 5 x 107 / ml com tampão de separação em tubos de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o cocktail de enriquecimento de células T CD4+ humanas a 50 μl/ml de células. Misture e incube em temperatura ambiente por 10 min. Adicione partículas magnéticas a 100 μl/ml e incube por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aumente a suspensão celular até 7 ml adicionando tampão de separação. Proceda ao isolamento das células T CD4+ colocando o tubo no ímã. Após 5 min, com o tubo ainda dentro do ímã, despeje as células desejadas em um novo tubo cônico de 15 ml. Pegue uma pequena alíquota e core as células com anticorpos contra CD3 e CD4 em 1x PBS-2% FBS por 30 min a 4 ° C. A pureza das células T CD4+ pode então ser medida por citometria de fluxo com uma pureza esperada de 95% ou superior.</li>
	<li>Conte as células T CD4 +, divida-as em dois tubos cônicos de 15 ml e lave em 1x PBS morno.</li>
	<li>Prepare uma solução de trabalho de 0,4 μM de alta CFSE em PBS quente.</li>
	<li>Prepare uma solução de trabalho de baixo CFSE de 0,04 μM diluindo uma porção da solução de trabalho de alto CFSE 10x em PBS quente.</li>
	<li>Ressuspenda as células a 20 x 106 / ml de PBS (se o número de células T CD4 + for menor que 10 x 106 / ml, ressuspenda as células em 0,5 ml de PBS) e core metade das células T CD4 + adicionando um volume igual de 0,4 μM de solução de trabalho alta CFSE (concentração final de 0,2 μM). Por exemplo, para 1 ml de células, adicione 1 ml da solução de trabalho CFSE. Manchar a metade restante do CD4 + adicionando um volume igual de 0,04 μM de solução de trabalho CFSE baixa (concentração final de 0,02 μM). Corar as células por 15 min a 37 ° C em atmosfera de 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, pellet cells a 1.500 rpm por 5 min e ressuspende em 1 ml de RPMI completo quente para extinguir a reação de marcação.</li>
	<li>Pulsar células T CD4+ com baixo teor de CFSE adicionando o peptídeo de interesse a uma concentração final de 5 μg/ml no RPMI completo e incubar por 45 min em atmosfera de CO5% 2 a 37 °C.</li>
	<li>Lave as células T CD4 + com CFSE alto e baixo CFSE em RPMI completo. Repita para um total de duas lavagens. Ressuspender a uma concentração de 2 x 105 células/ml cada em RPMI completo.</li>
	<li>Misture as duas populações-alvo em uma proporção de 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (consulte a Figura 1 no painel inferior).</li>
</ol>
3. Cocultura
<ol>
	<li>De cada diluição de células T CD8+, semeie 100 μl em duplicata para uma placa de 96 poços de fundo redondo.</li>
	<li>Adicionar as células T CD4+ alvo mistas (100 μl) a cada diluição de células efetoras, perfazendo um volume final de 200 μl.</li>
	<li>Para medir a apoptose basal, semeie 3 poços apenas com células-alvo.</li>
	<li>Incubar a cocultura por 6 horas em atmosfera de 5% de CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>
4. Coloração e Aquisição por Citometria de Fluxo
<ol>
	<li>Transfira as células para uma placa de 96 poços com fundo em V e cove com tetrâmeros pMHC conjugados com PE por 15 min em atmosfera de CO5% 2 a 37 ° C.</li>
	<li>Lave em 1x PBS-2% FBS e core as células com célula morta corrigível Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 por 30 min a 4 °C, protegida da luz.</li>
	<li>Lave as células uma vez com 1x PBS-2% FBS e ressuspenda em 100 μl com formaldeído a 2% em 1x PBS.</li>
	<li>Adquira células no citômetro de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O ensaio aqui descrito permite quantificar a principal função das células T CD8+: a atividade citolítica. A mensuração precisa dessa função é de suma importância na caracterização das funções efetoras das células T CD8+, pois estudos anteriores relataram discordância entre essa função e a secreção de citocinas das células T CD8+ antígeno-específicas10,11. Devido ao curto tempo de incubação da cocultura (6 horas) e ao uso de células-alvo autólogas, há baixa taxa de morte inespecífica das células-alvo. Este ensa...

A atividade citolítica é a principal função das células T CD8+, mas ainda é raramente medida, pois os ensaios usados para esse fim são complicados e difíceis de padronizar. A medição precisa dessa função é de suma importância na caracterização das funções efetoras das células T CD8+, pois ainda não foram descritos preditores confiáveis de citotoxicidade efetiva mediada por células1,2. Aqui, propomos um novo ensaio funcional para medir a atividade citotóxica de células T CD8+ específicas do antígeno em células T CD4+ alvo. Várias abordagens foram desenvolvidas para fornecer alternativas ao ensaio de liberação de cromo padrão-ouro. Apresentamos aqui um ensaio baseado em células que revela todo o processo de matança ao medir a morte de células-alvo vivas. Este método foi derivado de protocolos de ensaios citotóxicos baseados em citometria de fluxo in vivo em camundongos4,5 e in vitro em humanos6. Neste protocolo, as células T CD8+ específicas do antígeno contidas na população total de células T CD8+ são usadas como células efetoras e as células T CD4+ autólogas são usadas como células-alvo. As células T CD8+ efetoras de interesse são enumeradas usando tetrâmeros MHCI/peptídeos7. A morte das células-alvo é calculada pela razão entre as células T CD4+ carregadas/não carregadas com peptídeos. Mostramos anteriormente que esse método era reprodutível, sensível, específico e não dependia do número de células efetoras dentro da população total de células T CD8+8. Ao enumerar o número de células efetoras e alvo no ensaio de cocultura, a capacidade intrínseca das células T CD8+ de matar células-alvo pode ser calculada e expressa em unidades líticas9.

<table><tbody><tr><td>Kit de Enriquecimento de Células T CD4+ Humanas EasySep</td><td>Células-Tronco</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Enriquecimento de Células T CD8+ Humanas EasySep</td><td>Células-Tronco</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Proliferação de Células CellTrace CFSE - Para Citometria de Fluxo</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD fixável dead cell</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Anticorpo Anti-CD4 Humano Violeta Brilhante 650</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anticorpo CD8 Anti-humano</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x Solução</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - Ouro, PAA Inativado por Calor</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços; Tratado; Fundo em U; com tampa</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml de poliestireno estéril, reservatórios embalados individualmente</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 poços estéreis com fundo em U, placas estéreis de 2 ml de poços profundos</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), grau de pesquisa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, tampão de separação</td><td>Células-tronco</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo inferior redondo de 14 ml, polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>Stem</td><td>cell 18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 poços; Placa de fundo em V com tampa</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído, reagente ACS, 37% em peso em H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo de tampa de rosca de 1,5 ml, cônico</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

baseada em células de citometria de fluxo ensaio medir citotóxicos atividade

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

A atividade citolítica das células T CD8+ raramente é avaliada. Descrevemos aqui um novo ensaio baseado em células para medir a capacidade das células T CD8 + específicas do antígeno de matar células T CD4 + carregadas com seu peptídeo cognato. As células T CD4+ alvo são divididas em duas populações, marcadas com duas concentrações diferentes de CFSE. Uma população é pulsada com o peptídeo de interesse (CFSE-baixo), enquanto a outra permanece não pulsada (CFSE-alto). As células T CD4+ pulsadas e não pulsadas são misturadas em uma proporção igual e incubadas com um número crescente de células T CD8+ purificadas. A morte específica de células T CD4+ alvo autólogas é analisada por citometria de fluxo após cocultura com células T CD8+ contendo as células T CD8+ efetoras específicas do antígeno detectadas pela coloração de tetrâmero peptídeo/MHCI. A lise específica de células T CD4+ alvo medidas em diferentes razões efetor versus alvo permite o cálculo de unidades líticas, LU30/106 células. Este ensaio simples e direto permite a medição precisa da capacidade intrínseca das células T CD8+ de matar as células T CD4+ alvo.

O esquema na Figura 1 resume o ensaio. Células T CD8+ purificadas (células efetoras) foram ressuspendidas em 450 µl de RPMI completo e diluições seriadas foram realizadas adicionando-se 225 µl de células T CD8+ ao próximo tubo contendo 225 µl de meio (painel superior). Células T CD4+ purificadas (células-alvo) foram contadas, divididas em dois tubos e marcadas com duas concentrações diferentes de CFSE (alta e baixa), conforme descrito no protocolo. As células T CD4+ com baixa marcação por CFSE foram sens...

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade citotóxica de linfócitos T CD8 específicos para antígeno utilizando um ensaio de citometria de fluxo baseado em células. Isso é realizado primeiramente expandindo os linfócitos T CD8 efetores por seis dias na presença do peptídeo de interesse; na segunda etapa, as células T CD4 alvo são sensibilizadas com o peptídeo de interesse e então misturadas com células T CD4 não sensibilizadas. Em seguida, os linfócitos T CD8 efetores e as células T CD4 alvo são cultivados em co-cultura por seis horas em diferentes proporções de efetores para alvo.No passo final, a morte das células T CD4 carregadas com peptídeo e o número de células T CD8 efetoras são quantificados por citometria de fluxo. Em última análise, a capacidade intrínseca de lise das células T CD8 específicas para antígeno, expressa em unidades líticas, pode ser calculada. As principais vantagens desta técnica de ensaio de liberação de oximateriais, é que ela utiliza células-alvo primárias autólogas em vez de linhagens celulares imortalizadas e a célula-alvo real.Isso e os números de células efetoras são quantificáveis no nível de célula única. Logo, uma auxiliar de pesquisa

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para medir a capacidade citotóxica das células assassinas induzidas por citocinas (CIK) contra células cancerígenas. Após a co-cultura de células-alvo cancerígenas com células CIK, as células cancerígenas mortas são identificadas usando um corante de viabilidade fluorescente e são quantificadas usando citometria de fluxo, estimando o efeito citotóxico das células CIK.

Um ensaio in vitro para estudar a capacidade citotóxica de células assassinas induzidas por citocinas

Este vídeo demonstra a atividade lítica das células natural killer contra as células-alvo coradas com fluorescência. O método permite a medição da citotoxicidade induzida por células NK colorindo células mortas e usando um citômetro de fluxo para quantificar células-alvo vivas e mortas.

Preparação de amostra de ensaio de citotoxicidade mediada por células natural killer para análise de citometria de fluxo

Este vídeo mostra um ensaio de apoptose em células cancerígenas induzidas por células T efetoras pré-ativadas. Ao co-cultivar essas células com células cancerígenas marcadas com núcleos fluorescentes, um substrato fluorogênico clivável por caspase é adicionado. As células cancerígenas apoptóticas exibirão uma cor diferente em seus núcleos, levando à fluorescência dupla. Essa fluorescência dupla é indicativa de células cancerígenas sofrendo apoptose.

Um ensaio in vitro para estudar a citotoxicidade de células T CD8+ pré-ativadas contra células cancerígenas

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O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.

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Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

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Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

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