Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade citotóxica de linfócitos T CD8 específicos para antígeno utilizando um ensaio de citometria de fluxo baseado em células. Isso é realizado primeiramente expandindo os linfócitos T CD8 efetores por seis dias na presença do peptídeo de interesse; na segunda etapa, as células T CD4 alvo são sensibilizadas com o peptídeo de interesse e então misturadas com células T CD4 não sensibilizadas. Em seguida, os linfócitos T CD8 efetores e as células T CD4 alvo são cultivados em co-cultura por seis horas em diferentes proporções de efetores para alvo.

No passo final, a morte das células T CD4 carregadas com peptídeo e o número de células T CD8 efetoras são quantificados por citometria de fluxo. Em última análise, a capacidade intrínseca de lise das células T CD8 específicas para antígeno, expressa em unidades líticas, pode ser calculada. As principais vantagens desta técnica de ensaio de liberação de oximateriais, é que ela utiliza células-alvo primárias autólogas em vez de linhagens celulares imortalizadas e a célula-alvo real.

Isso e os números de células efetoras são quantificáveis no nível de célula única. Logo, uma auxiliar de pesquisa do meu laboratório demonstrará o procedimento para isolar as células efetoras positivas para CD8. Comece descongelando pbmc autólogos criopreservados em banho-maria a 37 graus Celsius e, em seguida, lave as células em até 50 mililitros de meio completo.

Após a contagem, dilua os PBMCs a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro em meio completo e, em seguida, adicione IL-2 e o peptídeo de interesse à cultura. Em seguida, semeie um mililitro da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Após três dias de cultivo, substitua metade do sobrenadante por meio completo fresco. Após seis dias de cultivo, utilize uma pipeta multicanal para transferir as células para um reservatório estéril e, então, conte e lave as células.

Re-suspenda o pellet a 50 milhões de células por mililitro em um tampão de separação e incube os PBMCs em um tubo cônico redondo de 14 mililitros com um coquetel de enriquecimento de linfócitos T CD8 positivos humanos a 50 microlitros por mililitro de células, à temperatura ambiente. Após 10 minutos, incube as células com partículas magnéticas conjugadas com IgG anti-CD8 a 150 microlitros por mililitro por mais cinco minutos, e então complete a suspensão celular até 7 mililitros com tampão de separação adicional. Coloque o tubo no ímã de separação; após cinco minutos, com o tubo ainda no ímã, despeje as células em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, marque uma pequena alíquota das células com anticorpos contra CD3 e CD8 em PBS suplementado com 2% de FBS durante 30 minutos a quatro graus Celsius.

Confirme que a pureza das células é de 95% CD8 positivo ou superior por citometria de fluxo. Agora, adicione 225 microlitros de meio completo em cinco tubos com tampa rosqueável e, em seguida, dilua seriamente as células de 1:2 a 1:32. Para isolar as células-alvo CD4 positivas, comece descongelando pbmc autólogos criopreservados em banho-maria a 37 °C.

Transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio. Enriqueça células T que expressam CD4 por separação com partículas magnéticas, conforme acabou de ser demonstrado, confirmando pureza de 95% ou superior de células T positivas para CD4 por citometria de fluxo. Após contagem das células, divida-as em dois tubos cônicos de 15 mililitros e, em seguida, lave-as com PBS morno; re-suspenda os pellets a 20 milhões de células por mililitro em PBS.

Após garantir que as células estejam protegidas da luz, marque metade das células T CD4 positivas com uma solução de trabalho fresca de CFSE em alta concentração, até uma concentração final de 0,2 milimolar, e a outra metade com uma solução de trabalho fresca de CFSE em baixa concentração, até uma concentração final de 0,04 milimolar, por 15 minutos a 37 °C em 5%CO2. Ao final do período de marcação, centrifugue as células e re-suspenda os pellets em um mililitro de meio completo aquecido para interromper a reação de marcação. Estimule as células T CD4 positivas marcadas com CFSE em baixa concentração com o peptídeo de interesse em concentração final de cinco microgramas por mililitro em meio completo, por 45 minutos no incubador de cultura celular.

Após a incubação, lave ambas as populações de células T CFSC alta e baixa. Duas vezes com meio incompleto e ressuspenda ambas as suspensões celulares em 200.000 células por mililitro em meio incompleto. Em seguida, misture as duas populações-alvo na proporção de um para um, CFSE alta para CFSE baixa.

Agora, adicione 100 microlitros das células T CD4 positivas misturadas a cada poço de uma placa de 96 poços com fundo redondo e, em seguida, semeie um microlitro de cada suspensão de células T CD8 positivas em duplicata, obtendo um volume final de 200 microlitros por poço. Meça a apoptose basal semeando três poços apenas com células-alvo e, em seguida, incube o cultivo em co-cultura por seis horas na incubadora de cultivo celular. Após a conclusão da incubação, transfira as células para uma placa VBO de 96 poços e marque cada poço com Tetrameros de peptídeo-MHC conjugados com PE durante 15 minutos.

No incubador de cultura celular, lave as células com PBS suplementado com 2% de FBS e, em seguida, marque as células por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegido da luz após a lavagem das células. Novamente, re-suspenda os pellets em 100 microlitros de 2% de formaldeído em PBS e analise as células por citometria de fluxo. Após a co-cultura, as células são analisadas e selecionadas conforme demonstrado nestes gráficos de dispersão.

A razão entre células-alvo viáveis CFSE alto versus CFSE baixo, não apresentadas ou pulsadas com peptídeo, é analisada a partir de um pequeno gate de dispersão para frente versus dispersão lateral, selecionando células vivas. As células são selecionadas com base na negatividade para marcador de viabilidade e positividade para CD4, e são representadas em função do CFSE para analisar a razão entre células CFSE baixo versus CFSE alto. Em seguida, um gate maior de dispersão para frente versus dispersão lateral é criado para enumerar o número total de células efetoras e-alvo, vivas ou mortas. Após a incubação de seis horas, células T CD8 positivas, tetramero positivas e células T CD4 positivas CFSE baixo são representadas para analisar a razão entre células efetoras versus células-alvo.

O número total de linfócitos T efetores CD8 positivos é então determinado pelo direcionamento nas células duplamente positivas para CD8 e tetraméricas. O número total de células-alvo é determinado pelo direcionamento nas células T CD4 positivas, CFSE baixo e células positivas e negativas para marcador de viabilidade. A proporção alvo de células CFSE baixo versus CFSE alto é de um para um.

Quando as células-alvo CD4 positivas são cultivadas na ausência de células efetoras, essa proporção diminui drasticamente. Quando as células pulsadas CFSE baixo positivas são incubadas com a população total de linfócitos T CD8 positivos contendo linfócitos T efetores CD8 positivos específicos ao antígeno.

À medida que a proporção diminui, as células-alvo pulsadas com CFSE baixo CD4 positivo começam a se tornar positivas para vivo-morto. A diluição das células efetoras resulta, portanto, em uma restauração da proporção de CFSE e, por fim, na restauração do número de células T alvo viáveis pulsadas com peptídeo, CFSE baixo e CD4 positivo. A porcentagem de lise específica pode então ser representada graficamente como uma função da proporção efetora para alvo em escala logarítmica. Como demonstrado no gráfico, uma regressão linear é calculada a partir do gráfico, e a equação da linha de tendência é utilizada para calcular as unidades líticas.

Esse é o número de linfócitos T efetores positivos para CD8 necessário para matar 30% de 1 milhão de linfócitos T alvo positivos para CD4, a fim de determinar a capacidade citolítica intrínseca dos linfócitos T positivos para CD8 específicos para o antígeno e para comparar os resultados entre doadores. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a citometria para medir a atividade citotóxica de linfócitos T CD específicos para o antígeno. Esta técnica também pode ser facilmente adaptada para seu próprio tipo de célula F.