Name: Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Aprenda a observar processos de reparo celular após lesão de membrana usando corantes fluorescentes e imagem ao vivo. Este método permite estudar a exocitose lisossômica e o tráfego de proteínas em células lesionadas.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants AR055686 e AR060836 e pós-doutorado para AD pelo francês Associação de Distrofia Muscular (AFM). A facilidade de imagem celular utilizada neste estudo é apoiado pelo National Institutes of Health Grants HD040677.

1. Repair Membrana imagens de células Usando Granel (grânulo de vidro) Wounding Este protocolo permite a marcação separadamente as células feridos e aqueles que não conseguem curar. A quantificação destas populações de células requer a utilização de três condições: 1. Teste (C1) - As células são deixadas a reparar na presença de Ca2 +, 2. Controlo 1 (nenhuma lesão C2) - As células são incubadas na presença de Ca 2 +, mas não lesionado, e 3. Controlo 2 (sem reparação C3) - células são deixadas para reparar na ausência de Ca 2 +. <ol><li> Cultivar células de&gt; 50% de confluência em três lamelas estéreis e lavar C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C e lamelas de transferência de silicone de O-rings. </li><li> Adicione 100 ml de solução de dextrano FITC pré-aquecido no CIM em C1 e C2 ou em PBS em C3. </li><li> Ferir membrana plasmática em C1 e C3 por suavemente ondulado 40 mg contas de vidro sobre a lamela à temperatura ambiente por lamelas de inclinação manualmente para trás ediante 6-8 vezes em um ângulo de 30 °. Nota: Para lesões leves, garantir as contas de vidro estão espalhados de maneira uniforme, minimizando, assim, lesões repetidas. Para melhorar a reprodutibilidade do ferimento entre as amostras, simultaneamente, realizar a lesão de contas de vidro de diferentes amostras a ser comparadas. </li><li> Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO 2 ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min. </li><li> Sem permitir que as esferas rolam, remover as esferas de vidro e de FITC-dextrano por lavagem com CIM (C1 e C2) ou PBS (C3), a 37 ° C. </li><li> Local lamelas de volta no anel O e adicionar 100 ml de solução TRITC dextrano pré-aquecido lisina solucionáveis ​​no CIM em C1 e C2 ou em PBS sobre C3. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 5 min em ambiente de CO 2. </li><li> Lavar as lamelas duas vezes com pré-aquecido CIM e fixar com PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar duas vezes com PBS e incuba-se durante 2 minutos à temperatura ambiente em corante Hoechst. </li><li> Wash samples duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de montagem e células de imagem usando um microscópio de epifluorescência. </li><li> Use as células de C2 para determinar a intensidade de coloração de fundo vermelho e verde e usar esse valor para limite os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3). </li><li> Pontuação número total de células que são a) verde (lesionado e reparado) e b) vermelho ou vermelho e verde (ferido, mas não conseguiram reparar) em amostras C1 e C3. </li><li> Contagem&gt; 100 células verdes para cada condição e expressam a fração de células que não conseguiram reparar como um por cento de todas as células lesadas (verde e vermelho). </li></ol> 2. Imagens ao vivo da cinética de reparo da membrana celular após lesão Laser <ol><li> Lave as células pré-aquecido com CIM e, em seguida, colocar a lamela na CIM com corante FM. </li><li> Coloque a lamela em um suporte no topo fase incubadora mantida a 37 ° C. </li><li> Seleccionar uma região de 2 1-2 mm da membrana da célula, e para irradiar &lt;, 10 mseg com o laser pulsado. Atenuar a potência do laser, através do software de 40-50% da potência de pico. Poder Optimal permite lesão consistente, mas não-letal e isso deve ser determinado por tentativa e erro para cada linha de instrumento individual e celular sendo usado. </li><li> Para monitorar o reparo, a imagem a cada 10 segundos em epifluorescência e campo claro, começando antes do ferimento e continuar por 3-5 min após lesão. Nota: Para qualquer controle reparação, repita os passos de 2,1-2,4 com as células feridos em PBS contendo corante FM. </li><li> Para quantificar a cinética de reparação, medir FM celular corante fluorescente e representar graficamente a alteração na intensidade (ΔF/F0) durante o curso de imagiologia. Esta informação deve ser em média de mais de 10 células em cada condição e representados graficamente como a média ou valor de célula individual, conforme necessário. </li></ol> 3. Imagem Granel (grânulo de vidro) Lesão Induzida Lysosomal Exocitose As amostras incluem seguintes células cultivadas para&gt; 50%confluência: 1. Test (C1) - Células autorizados a reparar na presença de Ca 2 +, 2. Controlo 1 (C2; Nenhuma lesão) - Células não lesionados nem incubadas com o anticorpo primário, e 3. Controle 2 (C3; No reparação) - Células autorizados a reparar na ausência de Ca 2 +. <ol><li> Lavar lamelas C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C, e transferi-los em silicone O-rings. </li><li> Adicione 100 ml de pré-aquecido lisina solucionáveis ​​dextrano TRITC no CIM em C1 e C2 e na PBS em C3. </li><li> Ferir membrana plasmática em C1 e C3 tal como no passo 1.3. </li><li> Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO 2 ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min. </li><li> Remover as esferas de vidro e TRITC dextrano por lavagem das lamelas em meio de crescimento frio, assegurando novamente sem laminação das pérolas de vidro sobre as células. </li><li> Lavar as lamelas duas vezes com meio de cultura fria e transferir para os anéis de vedação. </li><li> Para C1 e C3, Adicione 100 ml de rato anticorpo anti LAMP1 rato em meio de crescimento completas frias e adicione a, meios de crescimento completo frio para C2. </li><li> Para permitir a ligação do anticorpo lamelas incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lave as lamelas três vezes com CIM frio e corrigir todos lamelas com PFA 4% por 10 min à temperatura ambiente e depois enxaguar 3x com CIM. </li><li> Incubar todas as lamelas em 100 ul de solução de bloqueio durante 15 minutos a RT </li><li> Incubar todas as lamelas em 100 mL de Alexa Fluor 488 anticorpo anti rato durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes com PBS e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente em Hoechst. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de instalação e de imagem usando um microscópio de epifluorescência. </li><li> Usando imagens de células C2, determinar a coloração de fundo não específica no vermelho (TRITC dextrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpos) canais e usar esses valores de coloração de fundo para limiar os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Use as&gt; 100 rotulado vermelhas células de C1 e C3 para medir a intensidade de coloração LAMP1 (verde) em células lesadas. Para uma experiência de sucesso da coloração LAMP1 em células a partir de C3 será significativamente menor do que nas células de C1. </li></ol> 4. Imagens ao vivo da Membrana Celular Lesão Provocado Tráfico subcelular <ol><li> Fluorescente rotular o compartimento de interesse através da transfecção de repórter adequado (por exemplo, CD63-GFP para os lisossomas 8) ou utilizando corantes fluorescentes 9. </li><li> Para lisossomos de etiquetagem com corante fluorescente, incubar as células cultivadas para 50% de confluência em meio de crescimento contendo FITC-dextrano </li><li> Permitir dextrano a ser sujeita a endocitose, durante 2 horas (ou mais, conforme necessário para a rotulagem endossomal suficiente com dextrano pela linha celular de interesse) na incubadora de CO 2. </li><li> Lavar as células com meio de crescimento pré-aquecido e incubar em que, durante 2 horas numa incubadora de CO2 para permitir que todosendocytosed dextrano a se acumular no lisossomo. </li><li> Antes de imagem, lavar a lamela na pré-aquecido CIM e montar em um suporte lamela no último estágio incubadora a 37 ° C. </li><li> Realizar widefield (para circulação em todo o celular) ou TIRF (movimento na superfície da célula e exocitose) de imagem - as células que não têm lotado FITC dextrano lisossomos rotulados são ideais para a imagem do movimento e exocitose de lisossomos individuais. </li><li> Alinhando os lasers TIRF para microscópio de imagem: Use 60X ou 100X com objetivo&gt; 1,45 NA. Configure o ângulo de feixe de laser incidente TIRF usando a abordagem do fabricante. </li><li> Ferir a membrana celular por irradiação de uma pequena região (1-2 mm 2) para &lt;100 mseg, com o laser pulsado a 40-50% de atenuação. </li><li> Para monitorar a resposta do lisossoma para a célula lesão, células de imagem em 4-6 frames / seg por pelo menos 2 minutos ou mais, dependendo da dinâmica de exocitose em células de interesse. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Lesão da membrana celular in vivo ocorre devido a uma variedade de factores de stress fisiológico e várias abordagens experimentais foram desenvolvidos para imitar estes. Estes incluem ferindo membrana celular das células aderentes raspando-los fora do prato ou por passagem através de um furo de 9,10 seringa estreita. Depois de tais lesões das células curar em suspensão e não adere à matriz extracelular, como sucede normalmente em tecido. Ainda outros, como o uso de poros formando toxinas alterar qui...

Membrana celular mantém a integridade das células, fornecendo uma barreira entre a célula e para o ambiente extracelular. Um estímulo químico, elétrico ou mecânico que exceder o limite fisiológico normal, assim como a presença de patógenos invasores cada um pode resultar em prejuízo para a membrana da célula e desencadear uma resposta celular subseqüente para reparar esse dano. Para sobreviver essas lesões na membrana celular, as células possuem um mecanismo eficiente para o reparo. Este mecanismo é dependente de cálcio e envolve o tráfico intracelular de proteínas, tais como anexinas e MG53, entre outros, bem como os compartimentos intracelulares tais como endossomas, lisossomas, Golgi e vesículas derivadas mitocôndrias para a membrana celular ferido 1-7. No entanto, os dados da sequência de acontecimentos moleculares e subcelulares envolvidos na reparação da membrana celular danificada permanece pouco compreendido. Resposta de reparação da célula podem ser agrupadas em orelhaly e respostas tardias. Respostas precoces, que ocorrem dentro de segundos a minutos o tempo de escala, são tremendamente importantes para determinar a natureza das respostas tardias que levam à reparação celular de sucesso ou morte celular. Ensaios de ponto final com base na análise bioquímica e celular em massa ajudaram a estabelecer o envolvimento de processos moleculares e celulares de reparação. Mas, devido à heterogeneidade e rapidez de resposta de reparação celular, ensaios de ponto final não fornecem os detalhes cinéticos e espaciais da seqüência de eventos que levam a reparar. Abordagens que permitem lesão controlada da membrana celular e permitem monitorar o reparo da membrana celular e respostas subcelulares associados a alta resolução espacial e temporal são ideais para tais estudos. Aqui, estas abordagens têm sido apresentadas. Dois dos protocolos descrevem abordagens para acompanhar a cinética em tempo real de reparação da membrana celular e as respostas intracelulares associados com o processo de reparação em células vivas seguintes inj a laserUry. Como complemento a estes ensaios baseados imagens de células vivas, os ensaios de ponto final também foram descritos que fornecem uma medida de base populacional para o monitoramento reparação de células individuais e as respostas subcelulares associados. Para demonstrar a sua utilidade destas abordagens têm sido utilizadas para controlar o tráfico e exocitose de lisossomos em resposta à lesão da membrana celular.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Usado para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Usado para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>FITC dextran (fixável por lisina)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml em contas de vidro CIM ou PBS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextrano (fixável por lisina)</td> <td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg / ml em CIM ou PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td> <td>EMS</td><td>15710</td><td>4% em PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 em</td></tr><tr><td>PBS FM corante</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&micro; l em CIM ou PBS</td></tr><tr><td>FITC dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml em meio de crescimento</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in meio de crescimento</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rato para galinhas IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Mídia de montagem</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Petridish com fundo de vidro</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Anel O de</td> <td>siliconeBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Porta-lamínulas</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Usado para meio de crescimento: 10% FBS, 1% P/S em DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina/Sreptomicina</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Usado para meio de crescimento: 10% FBS, 1% P/S em DMEM</td></tr><tr><td>Soro de galinha</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% soro de galinha em CIM é usado para bloquear a solução durante a imunocoloração</td></tr><tr><td>PBS (livre de Ca2+ e Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador TIRF&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de epifluorescência</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Camera Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição e análise de imagens</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsado</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de palco</td><td>Tokaihit, Japão</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens de células lesão de membrana e processos subcelulares envolvidas no reparo

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

A capacidade das células para curar feridas é um processo celular fundamental, mas os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na cura feridas células estão mal compreendidos. Aqui são descritos os ensaios para monitorar a capacidade e cinética de cura das células em cultura após a lesão localizada. O primeiro protocolo descreve uma abordagem ponto final baseado para avaliar simultaneamente reparo da membrana celular capacidade de centenas de células. O segundo protocolo descreve uma abordagem de imagem em tempo real para monitorar a cinética de reparo da membrana celular em células individuais, após lesão localizada com um laser pulsado. Como as células de cura feridas envolve o tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão, o terceiro protocolo descreve o uso de uma abordagem baseada ponto final acima para avaliar um tal evento tráfico (lisossomal exocitose) em centenas de células lesionadas e simultaneamente o último protocolo descreve o uso de lesões de laser pulsado em conjunto com micros TIRFcópia para monitorar a dinâmica de compartimentos subcelulares individuais em células lesadas em alta resolução espacial e temporal. Embora os protocolos aqui descrever a utilização dessas abordagens para estudar a relação entre a reparação da membrana celular e exocitose lisossomal em células musculares em cultura, podem ser aplicadas como tal, para qualquer outra célula de cultura aderente e compartimento subcelular de escolha.

Protocolos aqui descritas para imagens de células único são monitorar a capacidade e cinética de reparo da membrana celular (protocolos 1 e 2) eo tráfico subcelular e fusão de lisossomos durante a reparação (Protocolos 3 e 4). Protocolo 1 mostra um ensaio de massa que permite marcar todas as células lesionadas e identificar as células danificadas que não conseguiram reparar. Os resultados na Figura 1 mostram que, enquanto as células não lesionados (Figura 1 A)</stron...

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito de tratamentos desejados na reparação de células lesadas e estudar os processos subcelulares que auxiliam na reparação dessas células. Isso é alcançado ao lesionar células na presença de corantes fluorescentes que não conseguem atravessar membranas celulares intactas, a fim de avaliar a cinética e a capacidade das células lesadas de impedir a entrada desses corantes. Como segundo passo, monitoramos o aparecimento de proteínas intracelulares na membrana da célula lesada, o que identifica a capacidade de um compartimento celular de interesse participar da reparação por meio da fusão com a membrana da célula lesada.Em seguida, monitoramos a fusão de compartimentos celulares de interesse com a membrana celular lesionada, a fim de acompanhar a cinética da lesão. A fusão induzida desse compartimento fornece resultados que demonstram que a reparação da lesão da membrana celular está associada à exocitose lisossomal, com base no aumento da presença da proteína de membrana associada ao lisossoma 1 na superfície da célula lesionada e na imagem em tempo real da secreção do conteúdo lisossomal por células lesionadas. Esses métodos po

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA...

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

O método de punção termoplasmônica integra microscopia confocal, pinças ópticas e nanopartículas de ouro para estudar as respostas proteicas durante o reparo da membrana plasmática em células e vesículas unilamelares gigantes. A técnica permite a punção rápida e localizada da membrana, permitindo a identificação de proteínas-chave e seus papéis funcionais na intrincada maquinaria de reparo da membrana plasmática.

Uma Abordagem Termoplasmônica para Investigação do Reparo da Membrana Plasmática em Células Vivas e Membranas Modelo

Aprenda a observar processos de reparo celular após lesão de membrana usando corantes fluorescentes e imagem ao vivo. Este método permite estudar a exocitose lisossômica e o tráfego de proteínas em células lesionadas.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

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