Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito dos tratamentos desejados no reparo de células lesionadas e estudar os processos subcelulares que ajudam no reparo de células lesionadas. Isso é conseguido ferindo células na presença de corantes fluorescentes que não podem atravessar as membranas celulares intactas para avaliar a cinética e a capacidade das células lesadas de impedir a entrada desses corantes. Como segunda etapa, monitoramos o aparecimento de proteínas intracelulares na membrana celular lesada, o que identifica a capacidade de um compartimento celular de interesse de participar do reparo fundindo-se à membrana celular lesada.

Em seguida, monitoramos a fusão dos compartimentos celulares de interesse com a membrana celular lesada para monitorar a cinética da lesão. Os resultados da fusão desencadeada deste compartimento são obtidos que mostram que o reparo da lesão da membrana celular está associado à exocitose lisossômica com base no aumento da aparência da proteína de membrana associada ao lisossomo, uma na superfície celular lesada e imagens ao vivo da secreção do conteúdo lisossômico pelas células lesadas. Esses métodos podem ajudar a resolver questões importantes na lesão e reparo celular.

Por exemplo, eles podem ser usados para determinar quais proteínas e compartimentos celulares respondem a lesões focais na membrana celular e, em seguida, avaliar sua cinética da resposta. Demonstrando o procedimento estariam Aurelia D quatro e Hamma Stra dois dos bolsistas de pós-doutorado do meu laboratório. Para marcar separadamente as células lesionadas que cicatrizam e aquelas que não cicatrizam.

Semeie as células em lamínulas estéreis para as três condições experimentais. Cultive as células até atingirem mais de 50% de confluência e, em seguida, lave C um e C dois duas vezes com CIM a 37 graus Celsius. Lave C3 com PBS a 37 graus Celsius.

Em seguida, transfira as lamínulas em anéis de silicone. Adicione 100 microlitros de solução de dextrano fitzy pré-quente no tampão apropriado. Danifique a membrana plasmática em C um e C3 adicionando 40 miligramas de contas de vidro sobre a lamínula à temperatura ambiente e inclinando manualmente a tampa.

Desliza para frente e para trás de seis a oito vezes em um ângulo de 30 graus para lesões leves. Certifique-se de que as esferas de vidro estejam espalhadas uniformemente, minimizando assim lesões repetidas para melhorar a reprodutibilidade da lesão entre as amostras. Realize simultaneamente a lesão do grânulo de vidro das diferentes amostras a serem comparadas, evitando mais rolamento de grânulos.

Transfira todas as lamínulas para uma incubadora de 37 graus Celsius em CO2 ambiente e deixe o reparo prosseguir por cinco minutos sem deixar as contas rolarem. Remova as contas de vidro e o dextrano fitzy lavando com tampão ou PBS. Agora coloque as lamínulas de volta no O-ring e adicione 100 microlitros de lisina pré-aquecida.

Solução de trissy dextrana fixável Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos em CO2 ambiente. Lave as lamínulas duas vezes com CIM pré-aquecido e fixe com 4% de PFA por 10 minutos em temperatura ambiente após duas lavagens de PBS. Incubar durante dois minutos em corante hersch e após duas lavagens com PBS montar a amostra numa lâmina utilizando um meio de montagem.

Em seguida, faça a imagem das células usando um microscópio de epifluorescência da amostra C dois. Determine a intensidade da coloração vermelha e verde de fundo. Em seguida, use esse valor para limitar os canais vermelho e verde para todas as amostras.

Pontue o número total de células verdes. Pontue também as células vermelhas ou vermelhas e verdes nas amostras C e C3. Agora conte mais de 100 células verdes lesionadas para cada condição e expresse a fração de células que não conseguiram se reparar como uma porcentagem de todas as células lesionadas.

Lave as células crescidas a mais de 50% de confluência com CIM pré-avisado e monte a lamínula em CIM com corante FM. Em um suporte na incubadora superior do estágio mantido a 37 graus Celsius. Selecione uma região da membrana celular usando a potência ideal que permita lesões consistentes, mas não letais.

Irradie a amostra por menos de 10 milissegundos com o laser pulsado para conseguir isso. Atenue a potência do laser através do software para 40 a 50% da potência de pico para monitorar, reparar, adquirir imagens a cada dois a 10 segundos em epi, fluorescência e campo claro, começando antes da lesão e continuando por três a cinco minutos após a lesão. Para quantificar a cinética de reparo, meça a fluorescência do corante FM celular.

Calcule a mudança na intensidade durante o curso da imagem. Calcule a média dos dados de mais de 10 células em cada condição e plote como valor médio ou de células individuais. Lave as lamínulas de C um e C dois.

Preparações de cultura com CIM a 37 graus Celsius e lavagem C3 com PBS a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira as amostras em anéis de silicone. Adicione 100 microlitros de lisina pré-quente fixável trissy dextran.

Lesionar a membrana plasmática em C um e C3 como mostrado anteriormente. Em seguida, evitando mais rolar de contas. Transfira todas as lamínulas para uma incubadora de 37 graus Celsius em CO2 ambiente e deixe o reparo prosseguir por cinco minutos.

Agora, para remover as contas de vidro e Trixie dextran, lave as lamínulas em meio de crescimento frio, garantindo que não haja rolamento das contas de vidro nas células. Enxágue as lamínulas duas vezes com meio de crescimento frio e transfira para os anéis de vedação para C um e C3. Adicione 100 microlitros de anticorpo anti-US de lâmpada de rato um em meio de crescimento completo frio e adicione o meio de crescimento completo frio a C dois para permitir a ligação do anticorpo. Incube lamínulas por 30 minutos a quatro graus Celsius após três lavagens com CIM frio.

Fixe todas as lamínulas com 4% de PFA por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue três vezes com CIM. Em seguida, incube todas as lamínulas em 100 microlitros uma solução de bloqueio por 15 minutos, seguida por 100 microlitros de anticorpo anti-rato por 15 minutos.

Lave duas vezes com PBS e incube em sua mancha por dois minutos em temperatura ambiente após duas lavagens de PBS. Monte as amostras em uma lâmina e, em seguida, faça a imagem das amostras usando um microscópio de epifluorescência usando imagens de C duas células. Determine a coloração de fundo inespecífica nos canais vermelho e verde.

Use esses valores de coloração de fundo para limitar os canais vermelho e verde para todas as amostras. Use as mais de 100 células marcadas em vermelho de C um e C3 para medir a intensidade da coloração da lâmpada um nas células lesionadas. Em um experimento bem-sucedido, as células de coloração da lâmpada um de C3 serão significativamente menores do que nas células de C um para rotular lisossomos com corante fluorescente incubar as células crescidas a 50% de confluência em meios de crescimento contendo dextrano fitzy

Deixar o dextrano ser endocitado durante duas horas na incubadora de cultura de células. Lave as células com meio de crescimento pré-aquecido e incube nele por duas horas em uma incubadora de CO2 para permitir que todo o dextrano endocitose se acumule no lisossomo antes da imagem. Enxágue a lamínula em CIM pré-aquecido e monte em CIM em um suporte de lamínula na incubadora superior do palco a 37 graus Celsius.

Selecione para células que não tenham lisossomos marcados com dextrano fitzy lotado para imagem. O movimento e exocitose de lisossomos individuais. Adquira imagens de campo amplo para o movimento do lisossomo em toda a célula.

Alternativamente, adquira imagens de grama para movimento na superfície celular e para monitorar sua exocitose. Lesionar a membrana celular por irradiação, como mostrado anteriormente, para monitorar a resposta do lisossomo às células de imagem de lesão celular em quatro a seis quadros por segundo por pelo menos dois minutos ou mais, dependendo da dinâmica da exocitose nas células de interesse. Neste ensaio em massa, todas as células lesionadas são marcadas e aquelas que não foram reparadas são identificadas, enquanto as células não lesionadas permanecem sem marcação.

As células lesionadas por esferas de vidro na presença de dextrano fitzy são rotuladas em verde quando as células podem se reparar na presença de cálcio. A maioria das células lesionadas consegue se reparar e não é marcada por trissy dextrana quando as células podem se reparar. Na ausência de cálcio, a maioria das células lesadas também é marcada em vermelho pelo trissy dextrano.

Este experimento avalia a cinética do reparo da membrana celular monitorando a entrada do corante FM na célula. Quando incubadas em FM, as células intactas apresentam pouca ou nenhuma coloração intracelular. Após a lesão localizada a laser da membrana celular, o FM D começa a entrar na célula e se ligar às membranas endo, o que causa um aumento repentino na fluorescência do corante FM, pois a capacidade da membrana celular de se reparar após a lesão a laser depende do cálcio.

Uma célula lesionada na presença de cálcio é capaz de se reparar, o que faz com que a entrada do corante FM cesse dentro de um minuto após a lesão. Pelo contrário, uma célula que pode se reparar na ausência de cálcio não se repara, o que resulta na entrada contínua de corante e, portanto, no aumento contínuo da fluorescência FM d mesmo quatro minutos após a lesão. Assim, o reparo da membrana celular leva a um platô da coloração do corante FM.

Enquanto a falta de reparo da membrana celular causa a entrada contínua de corante que não se estabiliza. A abordagem de lesão por esferas de vidro a granel pode ser usada para monitorar a translocação da superfície celular de vesículas e proteínas em resposta à lesão. Aqui, as células são feridas na presença de trissy dextrana.

Assim, enquanto as células não lesionadas não são rotuladas em vermelho, todas as células lesionadas são rotuladas em vermelho. Observe que as células não lesionadas que não são tratadas com anticorpo primário mostram rotulagem de nível de fundo para a lâmpada de superfície celular um. No entanto, quando as células são lesadas e podem cicatrizar na presença de cálcio, os lisossomos sofrem exocitose e, portanto, há um aumento do nível de coloração lamp one na superfície das células lesionadas.

Esse aumento na marcação da lâmpada da superfície celular é muito menor nas células que podem cicatrizar na ausência de cálcio. Assim, tanto quantificando o número de células com alta superfície celular lâmpada uma coloração, bem como medindo o nível de superfície celular lâmpada. Um. A coloração em células lesionadas individuais fornece medidas para a capacidade da célula de sofrer exocitose lisossômica desencadeada por lesão.

Este experimento monitora diretamente a cinética, a natureza e a localização da fusão individual dos lisossomos. Em resposta à lesão da membrana celular, as células são lesadas pelo laser pulsado e os lisossomos da superfície celular são visualizados por imagens de grama, o que permite monitorar a exocitose desencadeada por lesão de lisossomos em células individuais. Esta figura mostra uma célula que é visualizada por imagem de contraste de fase no painel esquerdo e por microscopia de relva no painel do meio.

O painel direito mostra a imagem do gramado da mesma célula 105 segundos após a lesão. Aqui, a lesão desencadeou o recrutamento de um lisossomo para a membrana celular, seguido de exocitose. Este lisossomo não é visível na imagem do gramado antes da lesão, mas após a lesão, o lisossomo chega à membrana celular e se torna detectável.

À medida que a vesícula se aproxima da membrana celular, ela é melhor excitada pela iluminação do gramado, fazendo com que a fluorescência da fita dex lisossômica atinja o valor máximo. Quando o derramamento de fusão se abre, isso causa neutralização do pH lisossômico e, portanto, extinção da fluorescência da fita DExT. Posteriormente, a fita DExT é descarregada da vesícula para o exterior da célula, fazendo com que a fluorescência do ZI se espalhe lateralmente e a fluorescência da vesícula diminua gradualmente várias respostas desencadeadas por lesões dos lisossomos podem ser medidas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar a capacidade das células de se reparar de grandes lesões focais e monitorar compartimentos subcelulares e proteínas que respondem e ajudam no processo de reparo. Experimentos adicionais usando diferentes marcações vitais de tags, compartimentos ou proteínas podem ser realizados para monitorar a resposta à lesão e o envolvimento no reparo das células IND.