Name: Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Aprenda a observar processos de reparo celular após lesão de membrana usando corantes fluorescentes e imagem ao vivo. Este método permite estudar a exocitose lisossômica e o tráfego de proteínas em células lesionadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants AR055686 e AR060836 e pós-doutorado para AD pelo francês Associação de Distrofia Muscular (AFM). A facilidade de imagem celular utilizada neste estudo é apoiado pelo National Institutes of Health Grants HD040677.

1. Repair Membrana imagens de células Usando Granel (grânulo de vidro) Wounding Este protocolo permite a marcação separadamente as células feridos e aqueles que não conseguem curar. A quantificação destas populações de células requer a utilização de três condições: 1. Teste (C1) - As células são deixadas a reparar na presença de Ca2 +, 2. Controlo 1 (nenhuma lesão C2) - As células são incubadas na presença de Ca 2 +, mas não lesionado, e 3. Controlo 2 (sem reparação C3) - células são deixadas para reparar na ausência de Ca 2 +. <ol><li> Cultivar células de&gt; 50% de confluência em três lamelas estéreis e lavar C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C e lamelas de transferência de silicone de O-rings. </li><li> Adicione 100 ml de solução de dextrano FITC pré-aquecido no CIM em C1 e C2 ou em PBS em C3. </li><li> Ferir membrana plasmática em C1 e C3 por suavemente ondulado 40 mg contas de vidro sobre a lamela à temperatura ambiente por lamelas de inclinação manualmente para trás ediante 6-8 vezes em um ângulo de 30 °. Nota: Para lesões leves, garantir as contas de vidro estão espalhados de maneira uniforme, minimizando, assim, lesões repetidas. Para melhorar a reprodutibilidade do ferimento entre as amostras, simultaneamente, realizar a lesão de contas de vidro de diferentes amostras a ser comparadas. </li><li> Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO 2 ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min. </li><li> Sem permitir que as esferas rolam, remover as esferas de vidro e de FITC-dextrano por lavagem com CIM (C1 e C2) ou PBS (C3), a 37 ° C. </li><li> Local lamelas de volta no anel O e adicionar 100 ml de solução TRITC dextrano pré-aquecido lisina solucionáveis ​​no CIM em C1 e C2 ou em PBS sobre C3. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 5 min em ambiente de CO 2. </li><li> Lavar as lamelas duas vezes com pré-aquecido CIM e fixar com PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar duas vezes com PBS e incuba-se durante 2 minutos à temperatura ambiente em corante Hoechst. </li><li> Wash samples duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de montagem e células de imagem usando um microscópio de epifluorescência. </li><li> Use as células de C2 para determinar a intensidade de coloração de fundo vermelho e verde e usar esse valor para limite os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3). </li><li> Pontuação número total de células que são a) verde (lesionado e reparado) e b) vermelho ou vermelho e verde (ferido, mas não conseguiram reparar) em amostras C1 e C3. </li><li> Contagem&gt; 100 células verdes para cada condição e expressam a fração de células que não conseguiram reparar como um por cento de todas as células lesadas (verde e vermelho). </li></ol> 2. Imagens ao vivo da cinética de reparo da membrana celular após lesão Laser <ol><li> Lave as células pré-aquecido com CIM e, em seguida, colocar a lamela na CIM com corante FM. </li><li> Coloque a lamela em um suporte no topo fase incubadora mantida a 37 ° C. </li><li> Seleccionar uma região de 2 1-2 mm da membrana da célula, e para irradiar &lt;, 10 mseg com o laser pulsado. Atenuar a potência do laser, através do software de 40-50% da potência de pico. Poder Optimal permite lesão consistente, mas não-letal e isso deve ser determinado por tentativa e erro para cada linha de instrumento individual e celular sendo usado. </li><li> Para monitorar o reparo, a imagem a cada 10 segundos em epifluorescência e campo claro, começando antes do ferimento e continuar por 3-5 min após lesão. Nota: Para qualquer controle reparação, repita os passos de 2,1-2,4 com as células feridos em PBS contendo corante FM. </li><li> Para quantificar a cinética de reparação, medir FM celular corante fluorescente e representar graficamente a alteração na intensidade (ΔF/F0) durante o curso de imagiologia. Esta informação deve ser em média de mais de 10 células em cada condição e representados graficamente como a média ou valor de célula individual, conforme necessário. </li></ol> 3. Imagem Granel (grânulo de vidro) Lesão Induzida Lysosomal Exocitose As amostras incluem seguintes células cultivadas para&gt; 50%confluência: 1. Test (C1) - Células autorizados a reparar na presença de Ca 2 +, 2. Controlo 1 (C2; Nenhuma lesão) - Células não lesionados nem incubadas com o anticorpo primário, e 3. Controle 2 (C3; No reparação) - Células autorizados a reparar na ausência de Ca 2 +. <ol><li> Lavar lamelas C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C, e transferi-los em silicone O-rings. </li><li> Adicione 100 ml de pré-aquecido lisina solucionáveis ​​dextrano TRITC no CIM em C1 e C2 e na PBS em C3. </li><li> Ferir membrana plasmática em C1 e C3 tal como no passo 1.3. </li><li> Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO 2 ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min. </li><li> Remover as esferas de vidro e TRITC dextrano por lavagem das lamelas em meio de crescimento frio, assegurando novamente sem laminação das pérolas de vidro sobre as células. </li><li> Lavar as lamelas duas vezes com meio de cultura fria e transferir para os anéis de vedação. </li><li> Para C1 e C3, Adicione 100 ml de rato anticorpo anti LAMP1 rato em meio de crescimento completas frias e adicione a, meios de crescimento completo frio para C2. </li><li> Para permitir a ligação do anticorpo lamelas incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lave as lamelas três vezes com CIM frio e corrigir todos lamelas com PFA 4% por 10 min à temperatura ambiente e depois enxaguar 3x com CIM. </li><li> Incubar todas as lamelas em 100 ul de solução de bloqueio durante 15 minutos a RT </li><li> Incubar todas as lamelas em 100 mL de Alexa Fluor 488 anticorpo anti rato durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar duas vezes com PBS e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente em Hoechst. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de instalação e de imagem usando um microscópio de epifluorescência. </li><li> Usando imagens de células C2, determinar a coloração de fundo não específica no vermelho (TRITC dextrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpos) canais e usar esses valores de coloração de fundo para limiar os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Use as&gt; 100 rotulado vermelhas células de C1 e C3 para medir a intensidade de coloração LAMP1 (verde) em células lesadas. Para uma experiência de sucesso da coloração LAMP1 em células a partir de C3 será significativamente menor do que nas células de C1. </li></ol> 4. Imagens ao vivo da Membrana Celular Lesão Provocado Tráfico subcelular <ol><li> Fluorescente rotular o compartimento de interesse através da transfecção de repórter adequado (por exemplo, CD63-GFP para os lisossomas 8) ou utilizando corantes fluorescentes 9. </li><li> Para lisossomos de etiquetagem com corante fluorescente, incubar as células cultivadas para 50% de confluência em meio de crescimento contendo FITC-dextrano </li><li> Permitir dextrano a ser sujeita a endocitose, durante 2 horas (ou mais, conforme necessário para a rotulagem endossomal suficiente com dextrano pela linha celular de interesse) na incubadora de CO 2. </li><li> Lavar as células com meio de crescimento pré-aquecido e incubar em que, durante 2 horas numa incubadora de CO2 para permitir que todosendocytosed dextrano a se acumular no lisossomo. </li><li> Antes de imagem, lavar a lamela na pré-aquecido CIM e montar em um suporte lamela no último estágio incubadora a 37 ° C. </li><li> Realizar widefield (para circulação em todo o celular) ou TIRF (movimento na superfície da célula e exocitose) de imagem - as células que não têm lotado FITC dextrano lisossomos rotulados são ideais para a imagem do movimento e exocitose de lisossomos individuais. </li><li> Alinhando os lasers TIRF para microscópio de imagem: Use 60X ou 100X com objetivo&gt; 1,45 NA. Configure o ângulo de feixe de laser incidente TIRF usando a abordagem do fabricante. </li><li> Ferir a membrana celular por irradiação de uma pequena região (1-2 mm 2) para &lt;100 mseg, com o laser pulsado a 40-50% de atenuação. </li><li> Para monitorar a resposta do lisossoma para a célula lesão, células de imagem em 4-6 frames / seg por pelo menos 2 minutos ou mais, dependendo da dinâmica de exocitose em células de interesse. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Lesão da membrana celular in vivo ocorre devido a uma variedade de factores de stress fisiológico e várias abordagens experimentais foram desenvolvidos para imitar estes. Estes incluem ferindo membrana celular das células aderentes raspando-los fora do prato ou por passagem através de um furo de 9,10 seringa estreita. Depois de tais lesões das células curar em suspensão e não adere à matriz extracelular, como sucede normalmente em tecido. Ainda outros, como o uso de poros formando toxinas alterar qui...

Membrana celular mantém a integridade das células, fornecendo uma barreira entre a célula e para o ambiente extracelular. Um estímulo químico, elétrico ou mecânico que exceder o limite fisiológico normal, assim como a presença de patógenos invasores cada um pode resultar em prejuízo para a membrana da célula e desencadear uma resposta celular subseqüente para reparar esse dano. Para sobreviver essas lesões na membrana celular, as células possuem um mecanismo eficiente para o reparo. Este mecanismo é dependente de cálcio e envolve o tráfico intracelular de proteínas, tais como anexinas e MG53, entre outros, bem como os compartimentos intracelulares tais como endossomas, lisossomas, Golgi e vesículas derivadas mitocôndrias para a membrana celular ferido 1-7. No entanto, os dados da sequência de acontecimentos moleculares e subcelulares envolvidos na reparação da membrana celular danificada permanece pouco compreendido. Resposta de reparação da célula podem ser agrupadas em orelhaly e respostas tardias. Respostas precoces, que ocorrem dentro de segundos a minutos o tempo de escala, são tremendamente importantes para determinar a natureza das respostas tardias que levam à reparação celular de sucesso ou morte celular. Ensaios de ponto final com base na análise bioquímica e celular em massa ajudaram a estabelecer o envolvimento de processos moleculares e celulares de reparação. Mas, devido à heterogeneidade e rapidez de resposta de reparação celular, ensaios de ponto final não fornecem os detalhes cinéticos e espaciais da seqüência de eventos que levam a reparar. Abordagens que permitem lesão controlada da membrana celular e permitem monitorar o reparo da membrana celular e respostas subcelulares associados a alta resolução espacial e temporal são ideais para tais estudos. Aqui, estas abordagens têm sido apresentadas. Dois dos protocolos descrevem abordagens para acompanhar a cinética em tempo real de reparação da membrana celular e as respostas intracelulares associados com o processo de reparação em células vivas seguintes inj a laserUry. Como complemento a estes ensaios baseados imagens de células vivas, os ensaios de ponto final também foram descritos que fornecem uma medida de base populacional para o monitoramento reparação de células individuais e as respostas subcelulares associados. Para demonstrar a sua utilidade destas abordagens têm sido utilizadas para controlar o tráfico e exocitose de lisossomos em resposta à lesão da membrana celular.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Usado para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Usado para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>FITC dextran (fixável por lisina)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml em contas de vidro CIM ou PBS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextrano (fixável por lisina)</td> <td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg / ml em CIM ou PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td> <td>EMS</td><td>15710</td><td>4% em PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 em</td></tr><tr><td>PBS FM corante</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&micro; l em CIM ou PBS</td></tr><tr><td>FITC dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml em meio de crescimento</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in meio de crescimento</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-rato para galinhas IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in solução de bloqueio</td></tr><tr><td>Mídia de montagem</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Petridish com fundo de vidro</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Anel O de</td> <td>siliconeBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Porta-lamínulas</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Usado para meio de crescimento: 10% FBS, 1% P/S em DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina/Sreptomicina</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Usado para meio de crescimento: 10% FBS, 1% P/S em DMEM</td></tr><tr><td>Soro de galinha</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% soro de galinha em CIM é usado para bloquear a solução durante a imunocoloração</td></tr><tr><td>PBS (livre de Ca2+ e Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador TIRF&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de epifluorescência</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Camera Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição e análise de imagens</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsado</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de palco</td><td>Tokaihit, Japão</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens de células lesão de membrana e processos subcelulares envolvidas no reparo

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

A capacidade das células para curar feridas é um processo celular fundamental, mas os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na cura feridas células estão mal compreendidos. Aqui são descritos os ensaios para monitorar a capacidade e cinética de cura das células em cultura após a lesão localizada. O primeiro protocolo descreve uma abordagem ponto final baseado para avaliar simultaneamente reparo da membrana celular capacidade de centenas de células. O segundo protocolo descreve uma abordagem de imagem em tempo real para monitorar a cinética de reparo da membrana celular em células individuais, após lesão localizada com um laser pulsado. Como as células de cura feridas envolve o tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão, o terceiro protocolo descreve o uso de uma abordagem baseada ponto final acima para avaliar um tal evento tráfico (lisossomal exocitose) em centenas de células lesionadas e simultaneamente o último protocolo descreve o uso de lesões de laser pulsado em conjunto com micros TIRFcópia para monitorar a dinâmica de compartimentos subcelulares individuais em células lesadas em alta resolução espacial e temporal. Embora os protocolos aqui descrever a utilização dessas abordagens para estudar a relação entre a reparação da membrana celular e exocitose lisossomal em células musculares em cultura, podem ser aplicadas como tal, para qualquer outra célula de cultura aderente e compartimento subcelular de escolha.

Protocolos aqui descritas para imagens de células único são monitorar a capacidade e cinética de reparo da membrana celular (protocolos 1 e 2) eo tráfico subcelular e fusão de lisossomos durante a reparação (Protocolos 3 e 4). Protocolo 1 mostra um ensaio de massa que permite marcar todas as células lesionadas e identificar as células danificadas que não conseguiram reparar. Os resultados na Figura 1 mostram que, enquanto as células não lesionados (Figura 1 A)</stron...

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o efeito de tratamentos desejados na reparação de células lesadas e estudar os processos subcelulares que auxiliam na reparação dessas células. Isso é alcançado ao lesionar células na presença de corantes fluorescentes que não conseguem atravessar membranas celulares intactas, a fim de avaliar a cinética e a capacidade das células lesadas de impedir a entrada desses corantes. Como segundo passo, monitoramos o aparecimento de proteínas intracelulares na membrana da célula lesada, o que identifica a capacidade de um compartimento celular de interesse participar da reparação por meio da fusão com a membrana da célula lesada.Em seguida, monitoramos a fusão de compartimentos celulares de interesse com a membrana celular lesionada, a fim de acompanhar a cinética da lesão. A fusão induzida desse compartimento fornece resultados que demonstram que a reparação da lesão da membrana celular está associada à exocitose lisossomal, com base no aumento da presença da proteína de membrana associada ao lisossoma 1 na superfície da célula lesionada e na imagem em tempo real da secreção do conteúdo lisossomal por células lesionadas. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas importantes sobre lesão e reparação celular.Por exemplo, esses métodos podem ser usados para determinar quais proteínas e compartimentos celulares respondem a lesões focais na membrana celular e, em seguida, avaliar a cinética dessas respostas. A demonstração do procedimento será realizada por Aurelia D quatro e hamma stra dois, pós-doutorandas do meu laboratório. Para marcar separadamente as células lesadas que cicatrizam e aquelas que não conseguem se recuperar.Plante as células em lamínulas estéreis para as três condições experimentais. Incube as células até atingirem mais de 50% de confluência, depois lave C um e C dois duas vezes com CIM a 37 graus Celsius. Lave C3 com PBS a 37 graus Celsius.Em seguida, transfira as lamínulas para anéis de silicone. Adicione 100 microlitros de solução pré-aquecida de dextrana fitzi no tampão apropriado. Lesione a membrana plasmática em C um e C3 adicionando 40 miligramas de esferas de vidro sobre a lamínula à temperatura ambiente e inclinando manualmente a lamínula.Mova para frente e para trás seis a oito vezes em um ângulo de 30 graus para lesão leve. Certifique-se de que as microesferas de vidro estejam distribuídas uniformemente, minimizando assim lesões repetidas para melhorar a reprodutibilidade da lesão entre as amostras. Realize simultaneamente a lesão com microesferas de vidro nas diferentes amostras a serem comparadas, evitando o rolamento adicional das microesferas.Transfira todas as lamínulas para uma incubadora a 37 graus Celsius com CO₂ ambiente e permita que o reparo prossiga por cinco minutos sem deixar as esferas rolarem. Remova as esferas de vidro e o dextrano fitzi lavando com tampão ou PBS. Agora, coloque as lamínulas de volta no anel O e adicione 100 microlitros de lisina pré-aquecida.Solução fixável de dextrana trissy Incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos em CO2 ambiente. Lavar as lamínulas duas vezes com CIM pré-aquecido e fixar com PFA 4% por 10 minutos à temperatura ambiente após duas lavagens com PBS. Incubar por dois minutos no corante hersch e, após duas lavagens com PBS, montar a amostra em uma lâmina utilizando meio de montagem.Em seguida, visualize as células utilizando um microscópio de fluorescência epipiluminiscente da amostra C dois. Determine a intensidade de coloração de fundo nas cores vermelha e verde. Em seguida, utilize este valor para definir o limiar dos canais vermelho e verde para todas as amostras.Conte o número total de células que estão verdes. Também conte as células que estão vermelhas ou tanto vermelhas quanto verdes nas amostras C1 e C3. Em seguida, conte mais de 100 células verdes lesionadas para cada condição e expresse a fração de células que não realizaram o reparo como uma porcentagem de todas as células lesionadas.Lave as células cultivadas até mais de 50% de confluência com CIM pré-aquecido e monte a lamínula em CIM com corante FM. Em um suporte no incubador de platina mantido a 37 graus Celsius. Selecione uma região da membrana celular usando potência ótima que permita lesão consistente, mas não letal.Irradie a amostra por menos de 10 milissegundos com o laser pulsado para alcançar isso. Atenuar a potência do laser por meio do software para 40 a 50% da potência máxima, a fim de monitorar, reparar e adquirir imagens a cada dois a 10 segundos em epifluorescência, fluorescência e campo claro, iniciando antes da lesão e continuando por três a cinco minutos após a lesão. Para quantificar a cinética do reparo, meça a fluorescência do corante FM celular.Calcule a alteração na intensidade ao longo do processo de aquisição de imagens. Faça a média dos dados de mais de 10 células em cada condição e represente graficamente como valores médios ou individuais das células. Lave as lamínulas de C um e C dois.Prepare os cultivos com CIM a 37 graus Celsius e lave o C3 com PBS a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira as amostras para anéis de silicone em forma de O. Adicione 100 microlitros de dextrano trissy fixável com lisina pré-aquecido.Lesione a membrana plasmática em C um e C3 conforme mostrado anteriormente. Em seguida, evitando rolamento adicional das microesferas, transfira todas as lamínulas para um incubador a 37 graus Celsius com CO2 ambiente e permita que a reparação prossiga por cinco minutos.Agora, para remover as microesferas de vidro e o dextrano Trixie, lave as lamínulas em meio de crescimento frio, garantindo que as microesferas de vidro não rolem sobre as células. Enxágue as lamínulas duas vezes com meio de crescimento frio e transfira-as para as juntas de vedação em C1 e C3. Adicione 100 microlitros de anticorpo rat anti-US lamp1 em meio de crescimento completo frio e adicione o meio de crescimento completo frio ao C2 para permitir a ligação do anticorpo. Incube as lamínulas por 30 minutos a quatro graus Celsius após três lavagens com CIM frio.Fixe todas as lamínulas com PFA 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes com CIM. A seguir, incube todas as lamínulas em 100 microlitros de uma solução bloqueadora por 15 minutos, seguido por 100 microlitros de anticorpo anti-rato 488 por 15 minutos.Lave duas vezes com PBS e incube no corante her por dois minutos à temperatura ambiente após duas lavagens com PBS. Monte as amostras em uma lâmina e, em seguida, visualize as amostras usando um microscópio de fluorescência epiluminescente com imagens de células C2. Determine a coloração de fundo inespecífica nos canais vermelho e verde.Utilize esses valores de coloração de fundo para definir os limites dos canais vermelho e verde para todas as amostras. Utilize mais de 100 células marcadas em vermelho de C1 e C3 para medir a intensidade da coloração de lamp1 em células lesadas. Em um experimento bem-sucedido, as células com coloração de lamp1 de C3 serão significativamente menores do que nas células de C1. Para rotular lisossomos com corante fluorescente, incube as células cultivadas até 50% de confluência em meio de crescimento contendo dextrano fitzil. Deixe a dextrana ser endocitada por duas horas no incubador de cultura celular. Lave as células com meio de crescimento pré-aquecido e incube nelas por duas horas em um incubador de CO₂ para permitir que toda a dextrana endocitada se acumule no lisossomo antes da aquisição de imagens. Enxágue a lamínula em CIM pré-aquecido e monte em CIM em um suporte de lamínula no incubador de platina a 37 graus Celsius.Selecione células que não apresentam lisossomos rotulados com fitzy dextran muito densos para a aquisição de imagens. O movimento e a exocitose de lisossomos individuais. Adquira imagens de campo amplo para acompanhar o movimento dos lisossomos por toda a célula.Adquira alternadamente imagens de turfas para acompanhar o movimento na superfície celular e monitorar sua exocitose. Lesione a membrana celular por irradiação, conforme mostrado anteriormente, para monitorar a resposta do lisossomo ao dano celular; registre imagens das células a quatro a seis quadros por segundo, durante pelo menos dois minutos ou mais tempo, conforme a dinâmica da exocitose nas células de interesse. Neste ensaio em massa, todas as células lesadas são marcadas e aquelas que não conseguiram se reparar são identificadas, enquanto as células não lesadas permanecem não marcadas.As células lesadas por esferas de vidro na presença de dextrana fitzy são marcadas em verde quando as células são deixadas em repouso na presença de cálcio. A maioria das células lesadas consegue se reparar e não é marcada pela dextrana trissy quando as células são deixadas em repouso. Na ausência de cálcio, a maioria das células lesadas também é marcada em vermelho pela dextrana trissy.Este experimento avalia a cinética da reparação da membrana celular por meio do monitoramento da entrada do corante FM na célula. Quando incubadas no corante FM, células intactas apresentam pouca ou nenhuma coloração intracelular. Após lesão localizada por laser na membrana celular, o FM D começa a entrar na célula e ligar-se às membranas endocelulares, o que provoca um aumento súbito na fluorescência do corante FM, já que a capacidade da membrana celular de se reparar após lesão por laser depende do cálcio.Uma célula lesionada na presença de cálcio é capaz de se reparar, o que faz com que a entrada do corante FM cesse dentro de um minuto após a lesão. Em contrapartida, uma célula permitida se reparar na ausência de cálcio falha no reparo, resultando em entrada contínua do corante e, portanto, aumento contínuo da fluorescência do FM d mesmo quatro minutos após a lesão. Assim, o reparo da membrana celular leva a uma estabilização da marcação com o corante FM.Embora a ausência de reparo da membrana celular cause entrada contínua de corante que não atinge um platô. A abordagem de lesão com microesferas de vidro pode ser usada para monitorar a translocação na superfície celular de vesículas e proteínas em resposta à lesão. Aqui, as células são lesionadas na presença de dextrano marcado com trissy.Assim, enquanto as células não lesadas não são marcadas em vermelho, todas as células lesadas são marcadas em vermelho. Observe que as células não lesadas que não são tratadas com anticorpo primário apresentam marcação de nível de fundo para a lâmpada um na superfície celular. No entanto, quando as células são lesadas e deixadas em repouso na presença de cálcio, os lisossomos realizam exocitose e, portanto, há um aumento no nível de marcação da lâmpada um na superfície das células lesadas.Esse aumento na marcação de lamp-1 na superfície celular é muito menor em células que são permitidas cicatrizar na ausência de cálcio. Assim, tanto a quantificação do número de células com intensa coloração de lamp-1 na superfície celular quanto a medição do nível de coloração de lamp.1. na superfície celular de células individuais lesadas fornecem parâmetros para a capacidade da célula de realizar exocitose lisossomal induzida por lesão.Este experimento monitora diretamente a cinética, a natureza e a localização da fusão individual de lisossomos. Em resposta a lesão da membrana celular, as células são lesadas por um laser pulsado e os lisossomos da superfície celular são visualizados por imagem turf, o que permite acompanhar a exocitose induzida por lesão dos lisossomos em células individuais. Esta figura mostra uma célula visualizada por contraste de fase no painel esquerdo e por microscopia turf no painel central.O painel direito mostra a imagem turf da mesma célula 105 segundos após a lesão. Aqui, a lesão desencadeou o recrutamento de um lisossoma para a membrana celular, seguido pela exocitose, conforme mostrado. Esse lisossoma não é visível na imagem turf antes da lesão, mas após a lesão, o lisossoma chega à membrana celular e torna-se detectável.À medida que a vesícula se move mais próxima à membrana celular, ela é excitada mais eficientemente pela iluminação em campo escuro, fazendo com que a fluorescência da fita de dex fitzy lisossomal atinja seu valor máximo. Quando o poro de fusão se abre, isso provoca a neutralização do pH lisossomal e, consequentemente, a desquenchagem da fluorescência da fita de DExT fitzy. Posteriormente, a fita de DExT é liberada da vesícula para o exterior da célula, fazendo com que a fluorescência de ZI se espalhe lateralmente e a fluorescência da vesícula diminua gradualmente. Várias respostas acionadas por lesões nos lisossomos podem ser medidas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar a capacidade das células de se repararem a partir de lesões focais extensas e de como acompanhar compartimentos subcelulares e proteínas que respondem e auxiliam no processo de reparo. Experimentos adicionais utilizando diferentes marcadores vitais, compartimentos ou proteínas podem ser realizados para monitorar a resposta à lesão e o envolvimento nas células IND no reparo.

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA...

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

O método de punção termoplasmônica integra microscopia confocal, pinças ópticas e nanopartículas de ouro para estudar as respostas proteicas durante o reparo da membrana plasmática em células e vesículas unilamelares gigantes. A técnica permite a punção rápida e localizada da membrana, permitindo a identificação de proteínas-chave e seus papéis funcionais na intrincada maquinaria de reparo da membrana plasmática.

Uma Abordagem Termoplasmônica para Investigação do Reparo da Membrana Plasmática em Células Vivas e Membranas Modelo

Aprenda a observar processos de reparo celular após lesão de membrana usando corantes fluorescentes e imagem ao vivo. Este método permite estudar a exocitose lisossômica e o tráfego de proteínas em células lesionadas.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

Explorar mais vídeos