Name: Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda o isolamento de cardiomiócitos de corações de camundongos adultos usando perfusão LOR para análise de contratilidade e transientes de cálcio. Este método permite estudar disfunções celulares cardíacas.

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Marc Wozniak para o uso do Departamento de celular e Developmental Biology videografia equipamento. Universidade Vanderbilt imagens de células recurso compartilhado. Este trabalho é apoiado pela AHA concessão 12PRE10950005 de ERP, AHA concessão 11GRNT7690040 a DMB, NIH concessão R01 HL037675 a DMB. DMB é o Presidente Gladys P. Stahlman no Cardiovascular Research.

Certifique-se de todos os procedimentos que envolvem animais são aprovados pelo uso de animais apropriados e cuidados com o corpo. 1 Prepare Banco Buffers em adiantado <ol><li> Prepare 2 L estoque de Ca2 + de Tyrode livre (Tabela 1). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. </li><li> Prepare 2 L estoque 1,2 mM de Ca2 + Tyrode (Tabela 2). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. </li></ol> 2 No dia do experimento, Prepare Perfusão, Transferência e Digestão Buffers <ol><li> Prepare tampão de perfusão de 150 ml em Ca 2 + de Tyrode livre (Tabela 3) e filtrar através de um filtro de 0,2 m. </li><li> Preparar 35 ml de Ca 2 + transferência livre &quot;Tampão A&quot; (Tabela 4) e 25 ml de Ca2 + contendo &quot;Tampão B&quot; (Tabela 5). Filtre através de um filtro a cada 0,2 m. </li><li> Preparar soluções de 00,06, 0,24, 0,6, e 1,2 mM de Ca 2 + por mistura de tampão A e B por Tabela 6. </li><li> Preparar um tampão de digestão de 25 ml por dissolução de enzimas de digestão em 25 ml de tampão de perfusão (Tabela 7) com base no peso corporal (BW) do rato. Filtrar através de um filtro de 0,2 m antes da utilização. </li></ol> 3. Setup Experimental <ol><li> Montar um aparelho de Langendorff o fluxo constante, disponíveis comercialmente ou através de um bomba peristáltica, tubagem, e um permutador de calor da bobina para permitir uma taxa de fluxo de 3 mL / min de perfusato aquecida a 37 ° C. Um esquema simples é fornecida na revisão de 2011 por Bell, et al 18. </li><li> Ajuste temperatura do banho de circulação de água (~ 47 ° C) do aparelho de Langendorff de modo que a partir da saída da cânula é de 37 ° C a uma taxa de fluxo de 3 ml / min. </li><li> Executar etanol a 70%, através do sistema de perfusão durante 15 min, seguido de 100 ml de tipo I de água ultrapura. Tampão de perfusão Executar através do system durante 5 minutos, enquanto a eliminação de bolhas de ar. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com um método desejado. </li><li> Criar uma cânula, anexando uma peça curta (cerca de 3 mm) de tubagem PE-50 para a ponta de um adaptador Luer 23 L-topo. Ponta de tubo de calor para criar um rebordo ao longo da aorta que vai ser posicionado. </li></ol> 4. Cardiomyocyte Isolamento <ol><li> Injectar rato com 0,2 mL de solução de heparina (1000 IU / ml), por meio de injecção intraperitoneal. </li><li> Após 5 min, anestesiar rato com isofluorano. Quando totalmente anestesiados (sem resposta à forte pitada pé), spray peito com etanol 70%. Abra o peito, rapidamente extirpar do coração, tomando cuidado para não danificar a aorta, e coloque em 4 ° C tampão de perfusão. Use uma pinça curva para agarrar e levantar sob o coração. Isso cria espaço para cortar os anexos por trás do coração com uma tesoura fina. </li><li> Canular coração, segurando gentilmente a borda da aorta com dois pares de uma pinça fina e puxando cuidadosamente o opening da aorta ao longo da borda da cânula. Assegurar a ponta da cânula não está para além da válvula aórtica no ventrículo e, como isso vai inibir a perfusão do coração através das artérias coronárias. </li><li> Fixar a aorta à cânula por amarrar um laço de seda de sutura 5-0 em torno da aorta imediatamente acima do bordo da cânula. </li><li> Nota: Os passos 4.2 através de 4.4 deve ser concluída o mais rapidamente possível para a digestão de melhor qualidade. </li><li> Nota: O coração pode ser suspenso directamente sobre a cânula já ligado ao aparelho de Langendorff com fluir tampão de perfusão. No entanto, pendurando o coração para uma cânula ligada a uma pequena seringa de tampão de perfusão sob um microscópio de dissecção foi encontrada para ser mais bem sucedido. Isso permite que uma pequena quantidade de tampão de perfusão a ser empurrado através, prestando atenção para limpeza de artérias coronárias e garantindo coração está firmemente conectado à cânula. A cânula é então pendurado na Langendorff com tampão de corrida de perfusão. </li><li> Perfundiro coração com Ca2 + livre tampão de perfusão a um caudal de 3 ml / min durante 2-3 min. </li><li> Mudar para a enzima tampão de digestão e perfuse por 7-10 min, o coração vai se tornar mais suave e de cor mais clara. </li><li> Nota: O tempo de digestão pode ser ajustada com base na atividade enzimática e tamanho do coração. </li><li> Uma vez que o coração é palpável flácido, retire o coração da cânula e coloque em um prato p60 estéril com tampão A (Ca2 + buffer de transferência gratuita). </li><li> Remover átrios e grandes vasos. Remover ventrículo direito, se desejar. Com uma pinça, separar o ventrículo em pedaços pequenos. Pipeta várias vezes com uma pipeta esterilizada de 5 ml de transferência para dispersar ainda mais as células. </li><li> Filtra-se a suspensão de células para um tubo cónico de 50 ml através de um filtro de 250 um de malha de nylon. </li><li> Permitir que a suspensão para sedimentar durante cerca de 10 min. </li><li> Transferir a pelota na solução de Ca 2 + de 0,06 mM. Permitir que as células sedimentar durante 10 minutos. Células saudáveis ​​irá agregar, enquanto a maioria das células mortas vão flutuar. </li&gt; <li> Aspirar o sobrenadante, e transferir o sedimento para o Ca 2 + solução 0,24 mM. </li><li> Repetir 10 min de incubação, a aspiração, e transferir-se através dos restantes dois Ca 2 + soluções até que as células estão na solução 1,2 mM. Neste ponto, a maioria das células deverá ser em forma de haste miócitos. </li></ol> 5. medição na contração e cálcio Transitórios <ol><li> Nota: Tanto a contratilidade e transientes de cálcio podem ser medidos simultaneamente. </li><li> Prepare Fura-2 AM solução por ressuspensão em DMSO anidro para uma concentração de 1 ug / uL. Solução de Fura-2 AM pode ser armazenado num exsicador a -20 ° C. </li><li> Carga 1 ml de células em suspensão com 1 ml Fura-2 AM. Permitir que as células se sentar no escuro 10 min, em seguida, aspirar o sobrenadante. Lavar duas vezes com uma solução de Ca2 + de Tyrode, permitindo que as células de granulação no escuro durante 10 min entre as lavagens. </li><li> Coloque uma lamela de vidro em uma inserção de estágio que permite pe aquecidarfusion / aspiração e eletrodo de andar com um estimulador campo miócitos. Coloque inserção fase em microscópio invertido configurado para medição de fluorescência, adicionando uma gota de óleo de lente se utilizando uma objectiva de imersão em óleo. </li><li> Configure perfusão gravidade aquecida com solução 1,2 mM de Ca2 + de Tyrode tão solução no palco atinge 37 ° C. Anexar aspiração a vácuo. Anexar eletrodos. </li><li> Ligue o sistema de microscópio, e abrir a fluorescência e aquisição de dados dimensionamento celular software ratiometric. </li><li> Adicione algumas gotas de células carregadas Fura-02:00 à inserção fase, bloqueando momentaneamente perfusão permitir que as células saudáveis ​​para resolver. </li><li> Use objectiva de 40x de localizar celular desejado. Uma célula saudável deve ser em forma de haste e não contrair espontaneamente. É visível e uniformemente contrato deve quando a célula é estimulada em 5-20 V. </li><li> Nota: a análise fisiológica requer uma digestão de alta qualidade. É possível ter células que parecem saudáveis, mas não fazer pa<html> ce bem para análise fisiológica. Protocolo de digestão pode exigir refinamento para obter alta qualidade, os miócitos saudáveis. Além disso, corações mutantes ou doentes podem necessitar de modificações no protocolo. </li><li> Ajustar a rotação da lente e abertura mudança tão célula desejada está alinhada horizontalmente na tela e no fundo não é visível. </li><li> Alinhe bares detecção de bordas a cada final de miócitos e ajustar limite. Alinhar detecção sarcómero sobre uma porção de célula com sarcómeros uniformes. Quanto mais tempo você pode fazer este bar, mais preciso será o modelo matemático de comprimento do sarcômero será, desde que ele não esteja em duas populações de sarcômeros. </li><li> Células ritmo em 2 Hz e 5-20 V para 10-15 segundos antes de gravar. </li><li> Rastreamento Record. A luz ambiente deve ser minimizado para a melhor gravação de cálcio transiente. </li></ol> 6 Análise <ol><li> Analisar os traços usando fluorescência ratiometric e dimensionamento de células software de aquisição de dados. </li></ol>título &quot;&gt; 7. Estudos Futuros <ol><li> Este protocolo prevê excesso de células que podem ser usados ​​para uma variedade de outras experiências, incluindo: fixação e imunomarcação, avaliando os efeitos diretos da droga, a cultura de curto prazo, e microscopia de força atômica. </li></ol>

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Isolamento de cardiomiócitos de qualidade requer um certo nível de prática e de otimização. Este protocolo contém passos-chave que podem afetar significativamente o resultado da digestão. Estes devem ser considerados com cuidado na realização e solução de problemas do protocolo. O tempo de remoção do coração de canulação e perfusão deve ser minimizado, de preferência menos do que cinco minutos. Lavar o coração imediatamente em tampão de perfusão gelada após a remoção a partir do rato e dissecando e canulação do coração ...

Os cardiomiócitos fornecem a força contrátil para o coração. Cada miócito contém elementos citoesqueléticos e contráteis organizados essenciais para a contração. O coração não contém apenas cardiomiócitos, mas também fibroblastos, tecido conjuntivo e miócitos modificados, como as fibras de Purkinje. Alterações em qualquer um ou em todos esses tipos de células podem ser observadas na insuficiência cardíaca, dificultando a determinação da causa final da disfunção cardíaca. A diminuição da contratilidade ventricular de um coração com insuficiência cardíaca é precedida por graus variados de acúmulo de tecido fibroso e hipertrofia e disfunção dos cardiomiócitos1. As arritmias podem ser causadas por disfunção nas células condutoras2, fibrose interrompendo a condução cardíaca3 ou alterações na expressão dos canais iônicos nos cardiomiócitos1,4. Na verdade, esses problemas muitas vezes coexistem de maneira complicada.
Isolar e estudar cardiomiócitos permite examinar a disfunção contrátil e elétrica de miócitos individuais no contexto da função cardíaca geral. Técnicas para isolar miócitos cardíacos individuais foram desenvolvidas há mais de 40 anos em um esforço para estudar melhor a fisiologia dessa célula do coração. As técnicas de isolamento foram aprimoradas para aumentar o rendimento e a qualidade das células, com o desenvolvimento vital da perfusão coronariana via canulação da aorta, realizado pela primeira vez em 19705. Este artigo descreve o isolamento de cardiomiócitos seguido de medição de contratilidade e transientes de cálcio usando fluorescência raciométrica e software de aquisição de dados de dimensionamento celular. Em modelos genéticos e ambientais de doenças cardíacas, a utilização deste protocolo fornece informações importantes sobre contratilidade celular, contratilidade e relaxamento sarcomérico, transientes de cálcio e ruptura do citoesqueleto. Esse sistema é frequentemente utilizado para testar o efeito de drogas em cardiomiócitos isolados6,7. Empregamos o sistema para comparar a contratilidade e os transientes de cálcio de cardiomiócitos entre camundongos do tipo selvagem e camundongos com uma mutação que leva à cardiomiopatia dilatada.
O estudo de miócitos cardíacos individuais tem inúmeras vantagens sobre outros métodos comumente usados para estudar anatomia e fisiologia cardíaca. A ecocardiografia e a eletrocardiografia fornecem informações sobre a função contrátil e a condução elétrica do coração em geral. Nenhum desses métodos explica a causa ou a natureza da disfunção abaixo do nível de todo o órgão. A medição da contratilidade de cardiomiócitos individuais usando algoritmos de detecção de borda e comprimento do sarcômero pode demonstrar que alterações na célula contrátil do coração estão presentes na disfunção cardíaca global. A medição dos transientes de cálcio demonstra a influência das mudanças no fluxo de íons em nível celular para disfunção contrátil ou arritmias.
Além de complementar estudos de órgãos inteiros, este protocolo fornece células facilmente coradas para componentes subcelulares. É possível ver alterações no citoesqueleto colorindo seções de tecido de todo o coração; no entanto, só é possível visualizar uma seção transversal de células. Um cardiomiócito inteiro é mais espesso do que a seção de tecido típica e, dado o arranjo e o comprimento dos cardiomiócitos, é difícil ver células inteiras em uma única seção. Os cardiomiócitos isolados podem ser fixados imediatamente e corados para uma variedade de elementos do citoesqueleto e canais iônicos. As imagens confocais podem ser compiladas em pilhas z de espessura total da célula. Além disso, a coloração de miócitos cardíacos isolados permite a coloração de componentes impossíveis de visualizar em cortes, como as invaginações da membrana conhecidas como túbulos T.
Existem linhagens celulares cultivadas de miócitos cardíacos, algumas das quais têm perfis transcricionais e características fenotípicas semelhantes aos miócitos cardíacos. Algumas, como a linhagem celular HL-1, até retêm alguma organização sarcomérica e capacidade contrátil rudimentar8. Apesar dessas qualidades, as células cultivadas não têm a forma de "vagão de caixa" e a estrutura do túbulo T dos cardiomiócitos e têm menos organização sarcomérica. Esses componentes são essenciais para a função dos cardiomiócitos in vivo. Além disso, o uso de células cultivadas permite a manipulação genética, mas não a manipulação fisiológica in vivo. Os cardiomiócitos isolados mantêm sua organização celular por tempo suficiente para serem estudados, mas ainda são facilmente visualizados e até transduzidos9. 
Os cardiomiócitos isolados são extremamente versáteis, fornecendo um substrato para analisar de forma idêntica células de condições experimentais variadas. O isolamento e a análise fisiológica de miócitos têm sido usados por inúmeros laboratórios para uma variedade de experimentos, incluindo o estudo do efeito de drogas6,7 ou pequenas moléculas10, estressores ambientais11, infecção12, doença13 ou mutação genética14,15 na contratilidade e / ou transientes de cálcio e estudando a regulação da contratilidade e liberação de cálcio dentro de um cardiomiócito15-17. Com a aplicação de qualquer um desses estressores, as alterações na função cardíaca podem ser devidas a qualquer combinação de alterações nos próprios cardiomiócitos e alterações no ambiente circundante do coração, como cicatrizes, alterações na condutividade ou alterações na matriz extracelular. Este é um protocolo ideal para responder a perguntas de pesquisa sobre a estrutura e função individual dos miócitos no contexto da insuficiência cardíaca por qualquer causa.
Embora tenha inúmeras vantagens sobre outras técnicas, a análise fisiológica de cardiomiócitos isolados não é ideal para todas as questões de pesquisa. O isolamento é um procedimento terminal, portanto, os cardiomiócitos só podem ser avaliados em um momento da vida do camundongo. Isso pode ser parcialmente superado usando coortes e sacrificando camundongos individuais ao longo do desenvolvimento da doença ou monitorando o camundongo para determinar se ele tem insuficiência cardíaca clinicamente significativa antes do isolamento. Embora este protocolo possa determinar se ocorreu disfunção cardiomiócita, não se pode concluir que essa disfunção é a causa raiz da insuficiência cardíaca sem informações experimentais adicionais. É possível que a própria disfunção cardiomiócita seja secundária a outras alterações no coração. Apesar desses desafios, o estudo de cardiomiócitos oferece informações valiosas para determinar a natureza da disfunção no coração, especialmente quando combinado com outros experimentos. 
O protocolo a seguir é adaptado de um fornecido pelo Dr. Chee Lim, Vanderbilt University. Embora os dados de contratilidade e fluxo de cálcio sejam altamente reprodutíveis e úteis na comparação de corações com manipulação genética ou ambiental, o isolamento em si continua sendo um protocolo dependente da técnica, exigindo otimização. Minimizar o tempo entre a remoção do coração do camundongo e a perfusão do coração por meio da canulação aórtica é essencial para uma digestão de qualidade. Além disso, o tempo de digestão e a concentração enzimática podem ser otimizados para miócitos da mais alta qualidade. As etapas que provavelmente exigem otimização, juntamente com sugestões de otimização, são indicadas abaixo.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>EM Science</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanodiona-monóxido (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td></td><td>Sigma T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase B</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-823</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-882</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV</td><td>Sigma</td><td>P-5147</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>Butler Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Teflabs</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO - Sigma</td><td></td><td>anidro 276855</td><td></td></tr><tr><td>Estimulação celular IonOptix e sistema de análise fluorescente</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 &mu; m filtro de malha de nylon</td><td>Sefar America</td><td>Lab Pak 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>23 G Adaptador Luer-stub</td><td>Becton Dickinson</td><td>1482619E</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 tubulação</td><td>Becton Dickinson</td><td>427410</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e fisiológica análise de rato cardiomyocytes

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Os cardiomiócitos, a célula laboriosa do coração, contêm elementos citoesqueléticos e contráteis primorosamente organizados que geram a força contrátil usada para bombear o sangue. Os cardiomiócitos individuais foram isolados pela primeira vez há mais de 40 anos para melhor estudar a fisiologia e a estrutura do músculo cardíaco. As técnicas melhoraram rapidamente para incluir a digestão enzimática via perfusão coronariana. Mais recentemente, a análise da contratilidade e do fluxo de cálcio de miócitos isolados forneceu uma ferramenta vital na análise celular e subcelular da insuficiência cardíaca. A ecocardiografia e os eletrocardiogramas fornecem informações sobre o coração apenas no nível do órgão. Existem sistemas de cultura de células de cardiomiócitos, mas as células carecem de estruturas fisiologicamente essenciais, como sarcômeros organizados e túbulos T necessários para a função dos miócitos no coração. No protocolo aqui apresentado, os cardiomiócitos são isolados por perfusão de Langendorff. O coração é removido do camundongo, montado através da aorta em uma cânula, perfundido com enzimas de digestão e as células são introduzidas para aumentar as concentrações de cálcio. O software de detecção de bordas e sarcômeros é usado para analisar a contratilidade, e um corante fluorescente de ligação ao cálcio é usado para visualizar transientes de cálcio de cardiomiócitos eletricamente estimulados; aumentar a compreensão do papel que as alterações celulares desempenham na disfunção cardíaca. Tradicionalmente usado para testar os efeitos da droga nos cardiomiócitos, empregamos esse sistema para comparar miócitos de camundongos WT e camundongos com uma mutação que causa cardiomiopatia dilatada. Este protocolo é único em sua comparação de células vivas de camundongos com função cardíaca conhecida e genética conhecida. Muitas condições experimentais são comparadas de forma confiável, incluindo manipulação genética ou ambiental, infecção, tratamento medicamentoso e muito mais. Além dos dados fisiológicos, os cardiomiócitos isolados são facilmente fixados e corados para elementos do citoesqueleto. O isolamento de cardiomiócitos por perfusão é um método extremamente versátil, útil no estudo das alterações celulares que acompanham ou levam à insuficiência cardíaca em uma variedade de condições experimentais.

Uma vez que a contratilidade e traçados transitórios são coletados (Figura 2), os dados são facilmente analisadas com o software apropriado. Toda a rastreio, ou respectivas porções, pode ser calculada a média (Figura 3). Contractilidade pode ser analisado de uma variedade de maneiras. Para a função sistólica, pode-se avaliar a magnitude da contração com fração de encurtamento, ou a velocidade de contração com o tempo para atingir o encurtamento, e velocidade de contração. A função diast...

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Os objetivos deste protocolo são utilizar a perfusão LOR para isolar miócitos cardíacos de corações de camundongos adultos com genética conhecida e analisar a contratilidade e os transientes de cálcio dos miócitos. Após uma injeção de heparina, o coração é removido de um camundongo anestesiado. Ele é rapidamente montado pela aorta em uma cânula ligada a uma seringa contendo solução de perfusão.A aorta é fixada. Uma sutura e tampão são lentamente perfundidos para limpar as artérias coronárias. A cânula é então montada em um aparelho LOR com tampão de perfusão em fluxo.O coração é digerido com uma solução livre de cálcio de colagenase e protease até que fique palpavelmente mole. O ventrículo esquerdo é colocado em tampão livre de cálcio e disperso com pinça e pipetagem suave. Após a filtração da solução através de malha, as células são gradualmente expostas a concentrações crescentes de cálcio para remover as células mortas e garantir que os miócitos sejam tolerantes ao cálcio.Células saudáveis têm forma alongada, enquanto células mortas perdem essa morfologia. Os miócitos são então carregados com o corante radiométrico de ligação ao cálcio RA duas A, e colocados na platina do microscópio. Para análise, as células são estimuladas eletricamente enquanto a contratilidade é medida por meio do comprimento do sarcômero e detecção de bordas, e os transientes de cálcio são medidos analisando o deslocamento espectral das células carregadas com RA duas A.A miocardiopatia dilatada é causada por uma variedade de mutações. No entanto, compreender o mecanismo por trás dessa doença cardíaca pode ser difícil. O isolamento de cardiomiócitos permite-nos analisar a contratilidade e os transientes de cálcio da célula contrátil do coração, livre de cálcio e com 1,2 milimolar.As soluções de cálcio-tiro podem ser preparadas com antecedência no dia do isolamento. Prepare o tampão sem cálcio para perfusão, o tampão para digestão enzimática e os tampões de transferência A e B conforme o protocolo escrito. Filtre todas as soluções através de um filtro de 0,2 mícrons antes do uso.Prepare os tampones de transferência de um a quatro com concentrações crescentes de cálcio misturando os tampones A e B de acordo com o protocolo escrito. Ajuste a vazão de um aparelho LOR para três mililitros por minuto e regule a temperatura do banho de água circulante de modo que o fluxo de saída da ponta da cânula seja de aproximadamente 37 graus. Passe etanol 70% pelo sistema durante 15 minutos, seguido por cem mililitros de água, garantindo que todas as bolhas sejam removidas do sistema.Antes do seu primeiro isolamento, crie uma cânula fixando um pequeno pedaço de tubo PE 50 na ponta de um adaptador de engate rápido 20 3G, e aqueça a ponta do tubo para criar uma pequena borda. Conecte a cânula a uma pequena seringa com fechamento lu cheia de tampão de perfusão. Certifique-se de que a cânula esteja preenchida com tampão.Injete um camundongo com 200 de heparina por injeção IP. Comece a passar o tampão de perfusão através do L endorf, de modo que ele percorra completamente o sistema antes de o coração ser conectado. Após cinco minutos, anestesie o camundongo com isofluorano.Assegure-se de que o camundongo esteja completamente anestesiado mediante pinça firme e bilateral nos dedos dos pés. Abra o tórax cortando abaixo do esterno e suba rapidamente pelos dois lados da caixa torácica, excisando o coração com cuidado para deixar o maior comprimento possível da aorta ainda ligado ao coração. Coloque imediatamente o coração sobre gelo.Tamponamento de profusão frio, trabalhando o mais rapidamente possível. Sob um microscópio de dissecação, remova qualquer tecido extra. Trabalhe com cuidado para remover o excesso de gordura sem danificar a aorta subjacente. Corte a aorta logo abaixo dos primeiros ramos.Usando dois pares de pinças finas, segure cuidadosamente a borda da aorta e puxe suavemente sobre a ponta da cânula. Certifique-se de que a ponta da cânula não atravesse a válvula aórtica e entre no ventrículo esquerdo. Prenda a aorta com um pequeno laço de sutura 5,0.Empurre suavemente uma pequena quantidade de tampão de perfusão através da cânula, observando o esvaziamento dos vasos sanguíneos das artérias coronárias. Remova a cânula da seringa e conecte ao aparelho L endorf com tampão de perfusão em fluxo. Tenha cuidado para não introduzir bolhas.Deixe o tampão de perfusão fluir através do coração por dois a três minutos. A perfusão deve mudar de sanguinolenta para límpida; então, mude o fluxo para o tampão de digestão e digira por sete a dez minutos. Após o tampão ter preenchido o langendorf, o fluxo pode ser reciclado assim que o coração estiver palpavelmente flácido.Flácido, retire da cânula e coloque em uma placa P 60 com o Tampão a. Remova as átrios, os grandes vasos e o ventrículo direito e transfira para uma segunda placa com o Tampão a. Usando pinça.Separar suavemente o ventrículo esquerdo em pequenos pedaços. Se o coração estiver adequadamente digerido, o tecido deverá se separar facilmente; pipetar suavemente várias vezes com uma pipeta de transferência estéril de cinco mil. Para dispersar ainda mais as células, usar uma pipeta Pasteur estéril para transferir a solução contendo células e tecido através de um filtro de malha de náilon de 250 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros.Deixe as células sedimentarem por aproximadamente 10 minutos. As células vivas irão se depositar na parte inferior do precipitado e as células mortas irão flutuar. Transfira o precipitado para o tampão de transferência de cálcio 0,06 milimolar.Deixe repousar por 10 minutos, aspire o sobrenadante contendo as células mortas e transfira o pellet para a solução de cálcio 0,24 milimolar. Repita a centrifugação, aspiração e transferência por meio de soluções de cálcio crescentes até que as células sejam pelotadas no tampão de transferência de cálcio 1,2 milimolar. Neste ponto, o pellet conterá muitas células bastonadas saudáveis, não contraindo espontaneamente, para carregar as células com menos ou dois corantes.Transfira um mililitro de células ressuspendidas para um tubo de eppendorf de um mililitro. Adicione um microlitro de fira dois a um milimolar em DMSO anidro. Misture invertendo suavemente o tubo.Deixe as células sedimentarem por 15 a 20 minutos no escuro; após a sedimentação, remova o sobrenadante por aspiração e adicione solução de tyro contendo cálcio 1,2 milimolar. Misture e deixe as células sedimentarem por mais cinco a 10 minutos. Em seguida, repita a lavagem.Configure o microscópio invertido para a coleta de dados. Primeiro, coloque uma lamínula de vidro em um suporte de platina projetado para aspiração por perfusão e para estimulação elétrica de células. Se estiver usando uma objetiva de imersão a óleo, coloque uma gota de óleo na lente de 40 x e posicione o suporte de platina no microscópio.Conecte os eletrodos. Configure uma perfusão aquecida por gravidade com solução de Tyro contendo cálcio 1,2 milimolar e conecte a aspiração à vácuo. Ligue o microscópio e o sistema de estimulação celular.Abra o software assistente de íons. Coloque algumas gotas com poucas ou duas células carregadas sobre a platina, bloqueando ao mesmo tempo o fluxo de perfusão. Para permitir que as células saudáveis se acomodem, restabeleça a perfusão; muitas das células mortas remanescentes serão lavadas.Use a ocular para localizar uma célula saudável com formato de bastonete que se contraia espontaneamente com estimulação de cinco a 20 volts; evite células contráteis devido ao vazamento da membrana. Altere a saída visual para a câmera. Ajuste a rotação da lente de modo que a célula fique visível na janela.Ajuste a abertura para que a maior parte do fundo seja removida. Posicione o marcador de medição do sarcômero sobre uma região da célula com sarcômeros uniformes. Altere o tamanho da caixa, se necessário, para garantir que o marcador não cubra populações diferentes, se desejado.Alinhe também as barras de detecção de bordas. Comece a estimular as células de 10 a 15 segundos antes de iniciar o experimento. Inicie a gravação.Analise os traços de encurtamento do sarcômero e da razão URA dois com o software Ion Wizard. Possíveis comparações entre cardiomiócitos selvagens e knockout incluem encurtamento fracional, tempo para pico de encurtamento, tempo para 50% de relaxamento para análise de contratilidade, bem como linha de base, pico de tempo para pico e tempo para 50% da linha de base do medo ou duas razões para avaliar o fluxo de cálcio. As células produzidas com este protocolo são ideais para muitos outros experimentos e procedimentos, incluindo coloração para componentes subcelulares e cultivo de curto prazo.Agora que você assistiu a este vídeo, deverá ser capaz de isolar cardiomiócitos de camundongos selvagens e com genes silenciados e analisar a contratilidade e os transientes de cálcio dessas células. Boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Este protocolo é usado para isolar cardiomiócitos atriais únicos do coração do rato adulto usando uma abordagem de digestão do pedaço. Esta aproximação é usada para isolar os miócitos atrial direito ou esquerdos que podem ser usados para caracterizar a electrofisiologia atrial do miócitos em estudos da remendo-braçadeira.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (&lt;50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.

Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

Aprenda o isolamento de cardiomiócitos de corações de camundongos adultos usando perfusão LOR para análise de contratilidade e transientes de cálcio. Este método permite estudar disfunções celulares cardíacas.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

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