Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Os objetivos deste protocolo são usar a perfusão LOR para isolar miócitos cardíacos de corações de camundongos adultos com genética conhecida e analisar a contratilidade e os transientes de cálcio dos miócitos. Após uma injeção de heparina, o coração é removido de um camundongo anestesiado. Ele é rapidamente montado através da aorta em uma cânula conectada a uma seringa de tampão de perfusão.

A aorta está segura. Uma sutura e um tampão são perfundidos lentamente para limpar as artérias coronárias. A cânula é então montada em um aparelho LOR com tampão de perfusão fluido.

O coração é digerido com uma solução livre de cálcio de colagenase e protease até ficar palpavelmente macio. O ventrículo esquerdo é colocado no tampão livre de cálcio e disperso com pinças e pipetagem suave. Depois que a solução é filtrada pela malha, as células são gradualmente introduzidas em concentrações mais altas de cálcio para remover as células mortas e garantir que os miócitos sejam tolerantes ao cálcio.

As células saudáveis são em forma de bastonete, enquanto as células mortas não têm essa forma. Os miócitos são então carregados com corante radiométrico de ligação de cálcio RA dois A e colocados no palco do microscópio. Para análise, as células são estimuladas eletricamente enquanto a contratilidade é medida usando o comprimento do sarcômero e a detecção de borda e os transientes de cálcio são medidos analisando o deslocamento espectral das duas células carregadas RA.

A cardiomiopatia dilatada é causada por uma variedade de mutações. No entanto, entender o mecanismo por trás dessa doença cardíaca pode ser difícil. O isolamento de cardiomiócitos nos permite analisar a contratilidade e os transientes de cálcio da célula contratual do coração, livre de cálcio e 1,2 milimolar.

As soluções de tirano de cálcio podem ser preparadas com antecedência no dia do isolamento. Prepare os tampões de digestão, tampão e transferência de enzima de tampão de profusão livre de cálcio A e B de acordo com o protocolo escrito. Filtrando todas as soluções através de um filtro de 0,2 mícron antes do uso.

Faça os tampões de transferência de um a quatro com concentrações crescentes de cálcio, misturando os tampões A e B de acordo com o protocolo escrito. Defina a vazão de um aparelho LOR para três mililitros por minuto e defina a temperatura do banho-maria circulante de modo que a saída da ponta da cânula seja de cerca de 37 graus. Execute 70% de etanol pelo sistema por 15 minutos, seguido por cem mililitros de água, garantindo que todas as bolhas sejam removidas do sistema.

Antes de seu primeiro isolamento, crie uma cânula anexando um pequeno pedaço de tubo PE 50 à ponta de um adaptador de isca 20 3G e aqueça a ponta do tubo para criar um pequeno lábio. Conecte a cânula a uma pequena seringa lu lock cheia de tampão de perfusão. Certifique-se de que a cânula esteja cheia de tampão.

Injete um camundongo com 200 heparina via injeção IP. Comece a passar o tampão de profusão através do L endorf para que ele passe totalmente pelo sistema antes que o coração seja conectado. Após cinco minutos, anestesiar o camundongo com isde flúor.

Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado para beliscar o dedo do pé bilateral firme. Abra o tórax cortando abaixo do esterno e em ambos os lados da caixa torácica, excise rapidamente o coração, tomando cuidado para deixar o máximo de aorta possível preso ao coração. Coloque imediatamente o coração no gelo.

Tampão de profusão fria, trabalhando o mais rápido possível Sob um microscópio de dissecação, remova qualquer tecido extra. Trabalhe com cuidado para remover o excesso de gordura sem danificar a aorta subjacente. Apare a aorta imediatamente abaixo dos primeiros ramos.

Usando dois pares de pinças finas, segure cuidadosamente a borda da aorta e puxe suavemente sobre a ponta da cânula. Certifique-se de que a ponta da cânula não passe pela válvula aórtica para o ventrículo esquerdo. Prenda a aorta com uma pequena alça de sutura 5.0.

Empurre suavemente uma pequena quantidade de tampão de perfusão através da cânula, observando as artérias coronárias limparem o sangue. Remova a cânula da seringa e conecte-a ao aparelho L endorf com perfusão fluida. Buffer. Cuidado para não introduzir bolhas.

Deixe o tampão de perfusão fluir pelo coração por dois a três minutos. Perfundir oito deve ir de sangrento para claro mudar o fluxo para digestão, tampão e digerir por sete a 10 minutos. Depois que o tampão for preenchido, o fluxo de lang endorf pode ser reciclado assim que o coração estiver palpável.

Flácido, retire da cânula e coloque em um prato P 60 com tampão a. Remova os átrios, grandes vasos e ventrículo direito e transfira para um segundo prato de tampão a. Usando fórceps.

Separe suavemente o ventrículo esquerdo em pequenos pedaços. Se o coração for digerido adequadamente, o tecido deve se separar facilmente pipetar suavemente várias vezes com uma pipeta de transferência estéril de cinco mil para dispersar ainda mais as células. Use uma pipeta de passado estéril para transferir a solução contendo células e tecidos através de um filtro de malha de náilon de 250 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros.

Deixe as células espeleografarem por aproximadamente 10 minutos. As células vivas se depositarão no fundo do pellet e as células mortas flutuarão. Transfira o pellet para o tampão de transferência de cálcio 0,06 milimolar.

Deixar repousar durante 10 minutos, aspirar o sobrenadante que contém as células mortas e transferir o sedimento para a solução de cálcio a 0,24 milimolar. Repita a aspiração e a transferência de peletização por meio de soluções crescentes de cálcio até que as células tenham sido peletizadas no tampão de transferência de cálcio de 1,2 milimolar. Neste ponto, o pellet conterá muitas células saudáveis em forma de bastonete, não se contraindo espontaneamente para carregar células com menos ou dois corantes.

Transfira um mil de células ressuspensas para um tubo de orph de um mil. Adicione um microlitro de um milimolar fira dois em DMSO anidro. Misture invertendo suavemente o tubo.

Deixar as células em pellet durante 15 a 20 minutos na escuridão após as células terem sido peletizadas, aspirando o sobrenadante e adicionando uma solução de tirano de cálcio a 1,2 milimolar. Misture e deixe as células assentarem por mais cinco a 10 minutos. Em seguida, repita a lavagem.

Configure o microscópio invertido para coleta de dados. Primeiro coloque uma lamínula de vidro em uma inserção de platina projetada para aspiração de profusão e para estimulação elétrica das células. Se estiver usando uma objetiva de óleo, coloque uma gota de óleo na lente de 40 x e coloque a inserção da platina no microscópio.

Conecte os eletrodos. Configure uma profusão aquecida por gravidade de solução de tirano de cálcio 1,2 milimolar e anexe a aspiração ao vácuo. Ligue o microscópio e o sistema de estimulação celular.

Abra o software do assistente de íons. Carregue algumas gotas de algumas ou duas células carregadas no palco enquanto bloqueia o fluxo de perfusão. Para permitir que as células saudáveis se estabeleçam, restaurem a profusão, muitas das células mortas restantes serão lavadas.

Use a ocular para localizar uma célula saudável em forma de bastonete que se contrai ao estimular de cinco a 20 volts espontaneamente, as células em contração devem ser evitadas devido ao vazamento da membrana. Altere a saída visual para a câmera. Ajuste a rotação da lente para que a célula fique visível na janela.

Ajuste a abertura para que a maior parte do fundo seja removida. Coloque o marcador de medição do sarcômero sobre uma área da cela com sarcômeros uniformes. Altere o tamanho da caixa, se necessário, para garantir que o marcador não cubra populações diferentes, se desejar.

Alinhe também as barras de detecção de borda. Comece a estimular as células 10 a 15 segundos antes de iniciar o experimento. Comece a gravar.

Analise o encurtamento do sarcômero e os traços de proporção URA dois com o software Ion Wizard. Possíveis comparações entre cardiomiócitos selvagens e nocautes incluem tempo de encurtamento fracionário para tempo de pico de encurtamento para 50% de relaxamento para análise de contratilidade, bem como tempo de pico basal para pico e tempo para 50% de medo basal ou duas proporções para avaliar o fluxo de cálcio. As células produzidas com este protocolo são ideais para muitos outros experimentos e procedimentos, incluindo coloração para componentes subcelulares e cultura de curto prazo.

Agora que você viu este vídeo, você deve ser capaz de isolar cardiomiócitos de camundongos selvagens e knockout e analisar a contratilidade e os transientes de cálcio dessas células. Boa sorte com seu experimento.