Name: Medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a medir o fluxo sanguíneo retiniano em camundongos usando microscopia intravital com microesferas fluorescentes. Este método permite quantificar diâmetros vasculares e velocidades sanguíneas com precisão.

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Financiado pelo NIH EY017599 (NRH).

Os procedimentos que envolvem o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do LSUHSC-S e realizados de acordo com os critérios traçados pelos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Preparação de soluções de perfusão
<ol>
	<li>Sonicar uma solução de estoque a 1% (em peso) de microesferas de 1,9 μm de diâmetro.</li>
	<li>Retire ~ 25-30 x 106 microesferas fluorescentes verdes (ou seja, ~ 10 μl da solução estoque) em uma seringa de 300 μl. Dilua as microesferas retirando mais 240 μl de solução salina para a seringa.</li>
	<li>Preparar uma solução de 50 μl de dextrano fluorescente de 2 x 106 peso molecular dissolvido em solução salina estéril, com a dose injectada no intervalo de 3-10 mg/kg. Mantenha o dextrano coberto com papel alumínio até a hora de sua infusão.</li>
</ol>
2. Anestesia Animal e Canulação Vascular
<ol>
	<li>Anestesiar o animal para inserção cirúrgica de cânulas vasculares e para posicionamento estacionário sob uma objetiva microscópica. Muitas opções de protocolos anestésicos estão disponíveis, com várias vantagens e desvantagens e efeitos potenciais nos parâmetros sistêmicos. Entre as muitas opções diferentes estão uma combinação de cetamina (100-150 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) e acepromazina (2 mg/kg), ou uma combinação de cetamina (50 mg/kg) e pentobarbital (50 mg/kg). Os procedimentos descritos são agudos e concluem com a eutanásia induzida por uma overdose de pentobarbital (150 mg/kg) seguida de uma toracotomia; A inclusão de um analgésico não é necessária para o procedimento terminal.</li>
	<li>Mantenha uma almofada de aquecimento embaixo do animal pelo restante do experimento.</li>
	<li>Mantenha os olhos úmidos com solução salina tamponada com fosfato durante as inserções cirúrgicas subsequentes de cânulas vasculares.</li>
	<li>Prepare uma cânula vascular para infusões subsequentes de marcadores fluorescentes. Um tubo de polietileno de 20 cm de comprimento (por exemplo, 0,28 mm de diâmetro interno; 0,61 mm de diâmetro externo) é colocado na ponta de uma agulha de seringa, com a ponta afiada da agulha quebrada de antemão dobrando-se para frente e para trás com um hemostático.</li>
	<li>Encha uma seringa e um tubo com solução salina heparinizada (25 U / ml).</li>
	<li>Raspe um lado da parte inferior do abdômen e faça uma incisão para expor a veia femoral.</li>
	<li>Para canular a veia femoral, amarre o vaso com uma sutura 5.0, faça uma incisão parcial do vaso (aproximadamente metade do diâmetro do vaso) e insira o tubo no vaso, prendendo o tubo com a sutura amarrada ao redor da seção canulada.</li>
</ol>
3. Preparação para Microscopia Intravital
<ol>
	<li>Dilate a pupila do olho com uma gota de solução oftálmica de tropicamida a 1%, seguida de uma gota de solução oftálmica de hipromelose a 2,5%.</li>
	<li>Cubra o olho com uma lamínula de vidro de 5 mm.</li>
	<li>Coloque o animal em uma placa de acrílico, que será posicionada embaixo da objetiva do microscópio de um microscópio vertical. Coloque estrategicamente uma gaze cirúrgica embaixo da cabeça para permitir um eixo direto através da objetiva até a retina central e o disco óptico.</li>
	<li>Focalize através do microscópio no disco óptico, encontrando o disco com uma objetiva de baixa potência 4X e usando um filtro de fluoresceína.</li>
</ol>
4. Infusão de microesferas fluorescentes para medir velocidades
<ol>
	<li>Usando uma objetiva 4X, concentre-se na retina com o disco óptico no centro do campo de visão.</li>
	<li>Infundir a solução de microesferas fluorescentes a um débito de 250 μl/min/kg.</li>
	<li>Grave em vídeo a retina visível ao redor do disco óptico, usando um tempo de exposição da câmera de ~ 8 ms.</li>
	<li>Pare a infusão de microesferas quando uma duração suficiente de vídeo tiver sido gravada (1-2 min); alguma solução de microesfera provavelmente permanecerá sem uso.</li>
</ol>
5. Infusão de um marcador de plasma fluorescente para medir diâmetros
<ol>
	<li>Usando uma objetiva 4X, concentre-se na retina com o disco óptico no centro do campo de visão.</li>
	<li>Infundir a solução preparada de dextrano fluorescente na veia femoral como um bolus durante ~ 5 segundos, durante a gravação de vídeo. Este vídeo ajudará a determinar a identidade das arteríolas versus vênulas, com as arteríolas sendo perfundidas primeiro. Execute esta etapa com o tempo de exposição da câmera definido para ~8 ms, embora o tempo de exposição preciso não seja crítico.</li>
	<li>Mude para uma objetiva de 10X e tempo de exposição de 20 a 40 ms para melhorar a resolução para filmar cada uma das 4 a 7 arteríolas e 4 a 7 vênulas na retina superficial. Concentre-se (e grave em vídeo) aproximadamente um quadrante da retina visível de cada vez, com o centro do disco óptico em um canto do campo de visão. Deve-se tentar minimizar o tempo que a luz do microscópio ilumina o tecido para reduzir a possibilidade de fototoxicidade induzida por luz/corante17.</li>
</ol>
6. Análise de vídeo
<ol>
	<li>Usando uma escala micrométrica, calibre o sistema de vídeo para uma conversão de μm/pixel.</li>
	<li>Com o software de processamento de imagem, reproduza o vídeo gravado.</li>
	<li>A partir do vídeo da infusão em bolus de dextrana fluorescente, identifique arteríolas vs vênulas.</li>
	<li>Para cada uma das 4-7 arteríolas e 4-7 vênulas registradas com a objetiva 10X, meça os diâmetros preenchidos com dextrana fluorescente, calculando a média de 5 medidas de diâmetro por vaso ao longo do comprimento visível.</li>
	<li>Para cada uma das mesmas arteríolas e vênulas, meça o comprimento da faixa das microesferas fluorescentes, usando 10 faixas de microesferas sucessivas em cada vaso para evitar viés de seleção. Divida os comprimentos das faixas pelo tempo de exposição para calcular a velocidade da microesfera, por exemplo, 160 μm/8 ms = 20 μm/ms = 2 cm/s. Calcule a média de 10 velocidades por embarcação.</li>
	<li>Calcule a vazão volumétrica para cada vaso com a seguinte equação: vazão = velocidade média × π × diâmetro2/4.</li>
	<li>Some as taxas de fluxo arteriolar e, separadamente, as taxas de fluxo venular, para obter o fluxo sanguíneo total da retina.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Esta técnica de microscopia de vídeo intravital pode ser aplicada não apenas em camundongos, mas também em ratos. Este protocolo baseia-se em apenas várias suposições, mas é limitado ao uso sob anestesia e com dilatação da pupila, como descrevemos. As outras suposições e limitações são as seguintes:
1. Suposição de erro mínimo de ampliação óptica resultante da natureza refrativa do olho. Como descrito por outros18-20, o método de preenchimento do espaço entre a córne...

A retina é um dos tecidos mais metabolicamente ativos do corpo e, consequentemente, requer um suprimento sanguíneo generoso. Duas circulações separadas atendem a essa demanda: a circulação coroidal para a porção externa da retina e a circulação retiniana para a porção interna da retina. As investigações da perfusão retiniana são imperativas para a compreensão dos mecanismos patológicos e consequências da retinopatia diabética, retinopatia induzida por oxigênio, oclusão da artéria ou veia retiniana e acidente vascular cerebral. Vários métodos têm sido empregados para quantificar o fluxo sanguíneo retiniano, com cada técnica tendo suas vantagens, desvantagens, limitações e suposições. Entre essas técnicas estão a infusão de microesferas de 7-8 μm de diâmetro que se alojam em arteríolas pré-capilares1,2, a autorradiografia quantitativa3,4, a microangiopatia óptica-tomografia de coerência óptica5,6, a ressonância magnética7,8 e a videomicroscopia intravital9-16. As vantagens deste último incluem visualização direta ao vivo dos vasos e fluxo da retina, dependência de apenas algumas suposições menores e acessibilidade para laboratórios com microscópio de fluorescência com câmera de vídeo acoplada. Em estudos anteriores de microscopia de vídeo intravital9-16, o dextrano fluorescente foi usado como marcador plasmático, e os glóbulos vermelhos marcados com fluorescência (de um animal doador) foram usados como marcadores de velocidade. No protocolo atual, microesferas marcadas com fluorescência de 1,9 μm de diâmetro, em vez de glóbulos vermelhos, são usadas para medir a velocidade, com essa alteração negando a necessidade de um doador de células sanguíneas.

<table><tbody><tr><td>Microesferas fluorescentes</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F / 10584 (verde)</td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares</td> <td>fluorescentes de dextrano de alto peso molecular</td><td>D-7137 (verde); D-7139 (vermelho)</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscópio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + acessórios</td><td></td></tr><tr><td>4X objetiva</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>abertura numérica 0.13; distância de trabalho 17.2 mm</td></tr><tr><td>10X objetiva</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>abertura numérica 0.25; distância de trabalho 10.5 mm</td></tr><tr><td>Tropicamida solução oftálmica</td><td>Bausch Lomb</td><td>1% Tropicamida</td><td></td></tr><tr><td>Solução oftálmica de hipromelose</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2,5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>Universidade da Califórnia San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de vídeo digital para microscopia</td><td>Fotometria</td><td>CoolSnap ES</td><td>Resolução de 1392 x 1040 pixels; tamanho do pixel 6,45 x 6,45 &mu; m</td></tr></tbody></table>

medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterações no fluxo sanguíneo da retina podem contribuir ou ser consequência de doenças oculares e disfunções visuais. Portanto, a quantificação da perfusão alterada pode auxiliar na pesquisa dos mecanismos das patologias da retina. A microscopia de vídeo intravital de traçadores fluorescentes pode ser usada para medir os diâmetros vasculares e as velocidades da corrente sanguínea da vasculatura retiniana, especificamente as arteríolas que se ramificam da artéria central da retina e das vênulas que levam à veia central da retina. As taxas de fluxo sanguíneo podem ser calculadas a partir dos diâmetros e velocidades, com a soma do fluxo arteriolar, e separadamente do fluxo venular, fornecendo valores do fluxo sanguíneo retiniano total. Este artigo e o vídeo associado descrevem os métodos para aplicar esta técnica a camundongos, que incluem 1) a preparação do olho para microscopia intravital do animal anestesiado, 2) a infusão intravenosa de microesferas fluorescentes para medir a velocidade da corrente sanguínea, 3) a infusão intravenosa de um dextrano fluorescente de alto peso molecular, para auxiliar a visualização microscópica da microvasculatura da retina, 4) o uso de uma câmera de microscópio digital para obter vídeos da retina perfundida e 5) o uso de software de processamento de imagem para analisar o vídeo. As mesmas técnicas podem ser usadas para medir as taxas de fluxo sanguíneo da retina em ratos.

Figura 1 mostra quadros individuais de um vídeo de um experimento, com os painéis A-D e F-I exibindo rastros de microesferas fluorescentes capturados com uma objetiva de 4X&#160;e tempo de exposição de 8 ms (e binning de 2 x&#160;2 pixels para reduzir o tamanho do arquivo de vídeo). Figura 1E mostra a orientação dos vasos retinianos nos demais painéis da figura.Nem todo quadro do vídeo terá um rastro fluorescente em foco; no entanto, alguns quadros podem apresentar múltiplos rastros para...

A microscopia intravital pode ser usada em animais para visualizar e medir diâmetros vasculares da retina, velocidades da corrente sanguínea e fluxo sanguíneo total da retina.

Medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

O objetivo geral deste procedimento é medir o fluxo sanguíneo da retina em camundongos. Isso é feito pela primeira infusão de microesferas fluorescentes através da veia femoral canulada de um camundongo anestesiado. O segundo passo é gravar em vídeo as microesferas que fluem através dos vasos retinianos do camundongo.Em seguida, infunda dextrano fluorescente através da veia femoral e capture o vídeo à medida que flui pelos vasos da retina. A etapa final é medir as velocidades das microesferas e os diâmetros dos vasos a partir dos vídeos gravados para um cálculo do fluxo sanguíneo da retina. Uma das principais vantagens dessa técnica é a capacidade de medir com precisão o fluxo sanguíneo da retina usando um microscópio de fluorescência padrão.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da retina, como até que ponto as alterações no fluxo sanguíneo contribuem para a retinopatia diabética. Embora estejamos demonstrando essa técnica na retina de um camundongo. O método geral pode ser usado em outros tecidos e também em ratos.Sonicar uma solução estoque a 1% de microesferas de 1,9 mícron de diâmetro, retirar 10 microlitros da solução estoque em uma seringa de 300 micro

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

Medições de Microscopia de Vídeo Intravital do Fluxo Sanguíneo Retinal em Camundongos

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

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Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Este artigo relata um método detalhado para a medição dinâmica e quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos individuais da vasculatura hepática de camundongo usando imagens de microscopia intravital em combinação com uma metodologia específica para aquisição e análise de imagens.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.

Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Uma abordagem aberta da janela do vaso usando rastreadores fluorescentes fornece resolução suficiente para a medição do fluxo sanguíneo coclear (CoBF). O método facilita o estudo de mudanças estruturais e funcionais no CoBF no camundongo em condições normais e patológicas.

Medição do fluxo sanguíneo strial em Cochlea de rato utilizando uma janela de vaso aberto e microscopia de fluorescência intravital

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

A vasculatura da retina de camundongos é particularmente interessante na compreensão dos mecanismos de formação do padrão vascular. Este protocolo mede automaticamente o diâmetro dos vasos retinianos de camundongos a partir de imagens de fundo de angiografia fluorescente a uma distância fixa do disco óptico.

Medindo o diâmetro do vaso retiniano a partir de imagens de angiografia fluorescente de camundongo

Aprenda a medir o fluxo sanguíneo retiniano em camundongos usando microscopia intravital com microesferas fluorescentes. Este método permite quantificar diâmetros vasculares e velocidades sanguíneas com precisão.

Medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos

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