Name: Coleta e análise de Arabidopsis Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a coletar exsudados de floema de Arabidopsis usando o método facilitado por EDTA. Esta técnica permite analisar metabolitos, proteínas e RNAs para estudar sinalização vegetal.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation-NSF IOS concessão # 1144391 a SHB.

1. Preparação de plantas <ol><li> Sementes de Arabidopsis podem ser germinadas directamente no solo ou em placas de MS. Crescer as plantas para quatro a seis semanas em câmaras de crescimento com um fotoperíodo de 12 horas (22 ° C dia, 15 ° C noite, 14). As plantas aquáticas uma a duas vezes por semana. Use a bandeja inferior para rega, não plantas aquáticas a partir do topo, permitir que as bandejas para secar antes de voltar a regar. Certifique-se que as plantas são bem hidratado no momento da colheita. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e pratos <ol><li> K-EDTA solução 2: Fazer uma solução 100 mM de K-EDTA 2 de estoque, o qual pode ser mantido no refrigerador. No dia da recolha, dilui-se a solução de 1-5 (uma solução de EDTA a peça, quatro partes de água) para se obter uma solução a 2 20 mM de K-EDTA. </li><li> Encha um copo ou placa de Petri (diâmetro de 7-15 cm) até a metade com a solução 20 mM 2-EDTA K. Se a coleta de amostras de diferentes tratamentos (por examplo controle e plantas sal estressado ou diferentes genótipos), preparar pratos separados para cada tratamento. </li><li> Encha número desejado de tubos de reacção de 1,7 ml com 1,4 ml de solução de 2 K-EDTA 20 mM. Encher um igual número de tubos de reacção com 1,4 ml de água desionizada autoclavada ou Millipore. </li><li> Coloque as toalhas de papel no banco para definir plantas em, obter uma nova lâmina de barbear e colocar luvas. </li></ol> 3. Coleção de Floema Exsudatos (Descrito no fluxograma na Figura 1) <ol><li> Colheita folhas de roseta de quatro a seis semanas de idade, as plantas, cortando-os com a lâmina na base do pecíolo, perto do centro da roseta. </li><li> Imediatamente coloque as folhas nos pratos contendo 20 mM de K 2-EDTA. Certifique-se a extremidade cortada do pecíolo está submerso na solução (Figura 2). </li><li> Uma vez as folhas 15 terem sido recolhidos (ca. 3-4 plantas), empilhar folhas suavemente no topo de cada um dos outros tchapéu pecíolos o corte estão alinhados uns com os outros. Recorte na base dos pecíolos (cerca de 1 mm) e transferir imediatamente as folhas em um dos tubos de reacção com a solução de 2 20 mM de K-EDTA. As folhas caber mais fácil se eles estão um pouco enrolado. Evite apertar as folhas de uma vez que esta pode causar lesão de células e, portanto, leva à cobrança de conteúdo da célula folha. </li><li> Se mais material é necessário, cubra delicadamente as amostras com uma toalha de papel molhado. Use um novo conjunto de pratos se para a coleta de amostras de diferentes tratamentos ou genótipos. </li><li> Uma vez que todas as amostras são posicionados em tubos de reacção, recolhe os exsudados ou no escuro ou à luz. </li><li> Para a coleta no escuro, a linha no chão de um grande prato raso com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reacção cheias de folhas no prato e quer cobrir com toalhas de papel molhadas ou colocar em uma parte traseira de plástico preto com fendas para ventilação. Coloque toda a configuração em um armário ou um quarto escuro. </li><li> Para a coleta na luz, forrar o fundo de um recipiente de acrílico transparente com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reacção cheias de folha no recipiente e feche-o. </li><li> Após 1 hora, remover as folhas suavemente a partir do recipiente e os tubos de reacção e lava-se cuidadosamente com água destilada, desionizada ou Millipore para remover todo o EDTA. Este passo serve para três fins: (1) remove o EDTA para minimizar os danos para as células, (2) que elimina a interferência de EDTA com SDS-PAGE e cromatografia, e (3) suprime a quaisquer compostos que tenham acumulado a partir do corte / danificado células. Transferir de imediato para os tubos de reacção preparados contendo água esterilizada e voltar para os recipientes de coleta umidificado para a coleta de exsudato. Neste ponto, adicionar inibidor de RNase se o exsudado precisa de ser utilizado para a extracção de RNA. Opcional: inibidor de proteinase podem ser adicionados se a análise da proteína é desejada. </li><li> Após o tempo de coleta de intenção, retire e discard as folhas e congelar os exsudato do floema em N 2 líquido para uso posterior. Se o armazenamento prolongado é necessário, liofilizar as amostras e armazenar a -80 ° C. </li><li> No caso de Arabidopsis, metabolitos já pode ser detectado após a recolha de exsudado para 1 hr. No entanto, a coleta de 5-8 horas é aconselhável se está prevista a análise de componentes menos abundantes. Para plantas maiores, como Perilla, tempos de coleta mais longos (8 horas) são recomendados. Exsudado recolhido a partir de 15 folhas é geralmente suficiente para uma pista de um gel de SDS-PAGE (proteínas), para extracção de ARNm, GC-MS (açúcares e metabolitos). Para a análise de lipídios a partilha de 2-3 amostras (exsudato 30-45 folhas) é recomendado e leva a resultados mais claros. </li></ol> 4. Análise subseqüente (para vídeo mostramos apenas 4.4) <ol><li> Para a análise de proteínas, amostra ressuspender em 15 mL de água e 30 mL de tampão Lämmli, o calor de 95 ° C por 5 min, girar rapidamente para baixo qualquer precipitates e carrega toda a amostra num gel de SDS-PAGE (45 ul bolsos de carga). As amostras devem ser corados com Coomassie coloidal ou outras manchas sensíveis uma vez que a abundância de proteínas é muito baixa. </li><li> Por análise do açúcar e pequenas metabolito, adicionar agentes de derivatização para a amostra seca, conforme descrito na literatura 14. </li><li> ARNm podem ser analisados ​​por meio de RT-PCR, ou de microarray análise de RNA-Seq. </li><li> Para a análise de lípidos imediatamente piscina 2-3 amostras e partição contra clorofórmio: metanol (1:1), no exaustor de fumos, como se segue: adicionar uma quantidade igual de clorofórmio: metanol a cada amostra, vortex durante alguns segundos, e centrifuga-se durante 4 min a 400 x g. Recolher a fase inferior (orgânico) em um tubo de vidro com tampa de teflon e partição repita com a fase superior mais três vezes. Secar as fases orgânicas reunidas sob um fluxo de N 2 e se submeter a uma análise mais aprofundada (cromatografia em camada fina: TLC 14, 37; espectrometria de cromatografia de massa líquida: LMS C-14). </li></ol>

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<li>Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolome+and+proteome+suggest+functional+independence+of+dual+phloem+transport+systems+in+cucurbits%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits.</a> PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origin+and+Composition+of+Cucurbit+%22Phloem%22+Exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate.</a> Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phloem-Delivered+RNA+Pool+Contains+Small+Noncoding+RNAs+and+Interferes+with+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation.</a> Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

A recolha de EDTA-facilitada de floema exsudados é muito simples, necessita de equipamentos mínima, e é aplicável para a maioria das plantas. Em geral, este método aumenta a capacidade para analisar exsudato floema de mais espécies. Embora o exsudado é diluída, é fácil de recolher muitas amostras diferentes ou a partir de muitas plantas de escala até uma grande quantidade de material. Isto permite então que para a detecção de novos compostos que são em muito baixa abundância e, de outro modo ser ignorada. Este método pode ser usado para várias espécies de plantas e funciona como descrito para os listados neste manuscrito. Se novas espécies são exploradas, os dois aspectos que podem precisar de modificação são o número de folhas usadas eo tempo de exsudação. Na maioria dos casos, de cinco a oito horas de exsudação deve ser apropriada. Para confirmar a utilização deste método para uma nova espécie de planta, exsudado precisam de ser recolhidos e um ou mais de a análise subsequente tal como descrito no protocolo da peça 4 nEEDS a ser executada. Dependendo da intensidade do sinal observado, o volume de recolha pode precisar de ser melhorados. Em geral, os lípidos e análise de proteínas requer mais material do que a análise de açúcar e metabolito desde as primeiras são menos abundantes no floema exsudados. Porque a recolha de exsudado EDTA facilitada envolve superfícies de corte, bem como um efeito potencialmente nocivo de EDTA, vários pontos tem que ser considerados: (1) após a incubação de uma hora com EDTA, os pecíolos têm de ser lavados. Isto remove os compostos obtidos a partir de células feridas, bem como a própria EDTA, o que poderia danificar as células ou interferir com a extracção. (2) Para os controlos positivos e negativos devem ser incluídos para assegurar que os dados obtidos são derivados de seiva floema e não a partir de células lesadas (ver passos críticos abaixo). (3) Floema seiva contém várias enzimas, que poderiam ser ativo durante a coleta de exsudato. Assim, em alguns casos, pode ser útil para recolher for diferentes quantidades de tempo. (4) Uma vez que o método envolveu a exsudação em água, a uma quantificação absoluta dos compostos não é possível. Etapas críticas: A chave para o sucesso do uso deste método é o uso de cautela ao manusear a amostra para não ferir as células, bem como o uso de controles apropriados (ver ref 14.). Um controle adequado é a coleção de floema exsudato sem tratamento prévio com EDTA. Neste caso, o floema vedará si e nenhum exsudado pode ser recolhido. Quaisquer compostos contaminantes provenientes das células feridos será detectado aqui. Um segundo controlo seja a análise de açúcares no exsudado. Na Arabidopsis, a sacarose deve ser o metabolito predominante na seiva floema, com sacarose, frutose a proporção de 01:04 - 01:08 (Ref. 8, 14). Para extracção de RNA é necessária a utilização de um inibidor de RNAse. Além disso, um controlo positivo de anteriormente descrevendoed mRNA floema localizada (Ubc9: Ubiquitin enzima conjugante 9, At4g27960, 8, 14) e um controle negativo de, por exemplo, um mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) são aconselháveis. Como o exsudado contém enzimas activas, um curso de tempo é aconselhável fazer alterações no perfil certo floema não são simplesmente devido a variações no tempo de recolha. Em alguns casos, pode ser benéfico utilizar os inibidores de proteases. No entanto, os investigadores precisam ter em mente, que o exsudato coletado será concentrada e que os compostos adicionados será em grande parte concentrada. Um segundo passo crítico no âmbito do protocolo é o recutting do pecíolo em EDTA. Este passo serve um propósito duplo: Em primeiro lugar, são removidos todos os pratos perfurados selado, evitando a formação de novas velas permitindo assim o livre fluxo da seiva floema. Segunda, ele remove a bolha de cavitação no xilema gerado durante o corte e, assim, permite o transporte do xilema. O tamanho do segundo corte dependems de plantas utilizadas. Em plantas com pecíolos maiores deve ser de vários milímetros (superior a 1 cm) sobre o primeiro corte, de plantas como a Arabidopsis, são suficientes 1-2 mm. A utilização deste método pode conduzir à descoberta de novos compostos em exsudatos do floema que poderiam ter de sinalização, de desenvolvimento ou implicações biomédicas. Ele levou um olhar mais aprofundado na sinalização de lipídios de longa distância, o que era um campo pouco estudado dentro da ciência da planta, devido à falta de acesso ao floema.

As plantas não podem mover-se para escapar condições adversas. Conseqüentemente, eles tiveram que desenvolver mecanismos para detectar estresses ambientais, obter e transmitir um sinal relacionado com toda a planta, e ajustar o desenvolvimento em conformidade. Existem dois sistemas de transporte para a distribuição de água, nutrientes e outros compostos (sinalização). O primeiro é o xilema; que normalmente transporta água e sais minerais absorvidos pelas raízes ao longo da planta. A segunda é o floema. O ponto de vista do floema mudou de uma simples assimilar sistema de transporte para um canal de RNA, proteínas, vírus, lipídios e outras moléculas pequenas. Ela desempenha um papel importante no transporte de nutrientes e assimilar, a resposta ao stress abiótico e biótico, bem como no crescimento e desenvolvimento da planta. Ele agora é chamado de &quot;superestrada da informação&quot; da planta 18. O floema é constituído por vários tipos de células: parênquima do floema, bem como acompanhante especializado cells e elementos peneira. O elemento de peneira é o local de movimento de longa distância. Para permitir o fluxo longitudinal desobstruída, elementos crivados estão faltando a maioria das organelas, bem como núcleos e são pensados ​​para conter, no máximo, um mecanismo de translação limitado 21, 33. Acredita-se que as células de companhia sintetizar proteínas e outros compostos, que circulam na corrente de floema. Estes compostos são, em seguida, transportados para o elemento de crivo através plasmodesmata e pode funcionar como sinais de longa distância 4,16. Vários grupos de compostos podem ser encontrados em exsudatos floema: <ul><li> Os açúcares são muitas vezes os produtos da fotossíntese e são transportados como &quot;portadores de energia&quot; moléculas para outras partes da planta para armazenamento ou como blocos de construção. No entanto, eles também podem funcionar como anti-congelante, ou como compostos de sinalização. </li><li> As proteínas também podem ser encontrados em exsudados de floema. Eles incluem enzimas metabólicas, mas também têm a função de sinalização. Uma example de uma proteína, que serve como um sinal de desenvolvimento é o lócus de florescência proteína T, o que sinaliza a indução da floração, bem como a queda das folhas em plantas sazonal 6. </li><li> Os ácidos nucleicos que estão presentes em exsudatos do floema, sob a forma de ARNm, pequenas e micro RNAs e RNAs virais. Eles parecem ser amplamente envolvido na sinalização 27, 28, 39. Ao mesmo tempo, rRNA e tRNA para quase todos os aminoácidos foram observados na seiva floema de cucurbitáceas 42. Parecem ser selectivamente transferido para o sistema de tubo de peneira. Os tRNAs mostram as modificações necessárias para a capacidade de transferência de aminoácidos para o aparelho de translação. No entanto, em vez de participar na tradução, que aparecem para inibir este processo. Alternativamente, eles poderiam servir como uma fonte de citocinina ou sinalizar o estado metabólico da planta 42. </li><li> Ácidos gordos oxylipins e outros lípidos também foram encontrados no floema exsudados 3, 13, 14, 23. Jasmoácido nic, um oxylipin se move através do floema, como parte da resposta à infecção pelo patógeno 22, 29, 31, 32. Embora o papel da maioria dos lípidos floema ainda não é claro, algumas delas provavelmente têm função de sinalização 4. </li></ul> O desafio de trabalhar com o floema planta reside na sua capacidade de selar-se sobre o ferimento. Existem quatro principais métodos utilizados para recolher floema exsudato, mas eles só funcionam em selecionar espécies: 1) Em cucurbitáceas é possível obter quantidades razoáveis ​​de floema de exsudado através de cortes do pecíolo. Uma vez que a queda inicial de contaminação de células lesionadas é removido, é possível obter grandes quantidades de razoavelmente pura seiva floema 1, 15. No entanto, com o aumento do tempo de recolha, este exsudado engrossa, tornando-se cada vez inadequados para abordagens de cromatografia líquida (não publicados). Publicações recentes sugerem, que, dependendo das espécies, isto é seiva floema derivado either o fascículo (PF) ou o extrafascicular floema (PE) e que, ao mesmo tempo que contém &quot;móvel&quot; seiva floema dos elementos de peneira (PF), que é também propensas à contaminação a partir de outros tipos de células, incluindo o xilema 40, 41 . 2) A segunda abordagem é a obtenção de floema a seiva através de cortes rasos ou furos no caule ou pecíolo. Este método tem sido utilizado com sucesso no tremoço 17, 25, 36 cucurbitáceas, Brassica napus e 12. Aqui, a contaminação a partir de células lesionadas é mínima e que os exsudados muito puro. No entanto, as plantas precisam de ser saudável e bem regada, pois é muito desafiador para perfurar seletivamente apenas os elementos crivados. Se vasos do xilema são cortados, todos exsudato é atraído para o fluxo do xilema. Isso faz com que o método inadequado para as plantas com pecíolos e hastes muito frágeis ou altamente lignificado. 3) stylectomy pulgão permite pulgões para inserir seu estilete para os elementos crivados an removendo o pulgão com um laser. Floema seiva é exalava através do restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. Em teoria, qualquer planta que pode ser infectada pelos pulgões podem ser usadas para esta abordagem. No entanto, a maioria estufa ou gerentes câmara de crescimento não vai apoiar o uso de um patógeno. Além disso, os pulgões introduzir várias proteínas no floema com a saliva 19, 33. Isto conduz a uma transcrição limitado reprogramação 30 e tem o potencial de alterar a composição do floema 26. 4) O método descrito aqui é o EDTA-exsudação facilitada de seiva floema. Este método emprega EDTA para impedir a selagem do floema 20. Quelatos de EDTA de Ca 2 + que os iões que participam nos processos de outro modo que o selo do floema. Embora o EDTA pode levar a danos nas células 30, vários grupos têm utilizado este método e observou qualquer efeito adverso de concentrações de EDTA 10 mM a 20 mM na ultra-estrutura celular, ou na phloem carregamento e transporte 5, 24. Para reduzir o efeito prejudicial assim como interferências de EDTA, com cromatografia e electroforese em gel, as plantas são movidas para a água depois de 1 h, e apenas a parte posterior do exsudado é usada 14. Assim, em vez de exsudação em EDTA, floema é exsudado em água (EDTA facilitada exsudação). É um método simples e direta, de baixo custo e baixa tecnologia para a coleta de exsudato do floema. Seiva floema obtido desta forma pode ser utilizado para analisar as proteínas, moléculas pequenas, lípidos, e RNAs e tem sido utilizado com sucesso em muitas plantas. Embora uma quantidade limitada de experiências foi realizado em 11 de monocotiledóneas, o método parece ser mais adequado para dicots Perilla (17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Álamo 7). Coleção de exsudato tem que ocorrer em um ambiente úmido para evitar a perda de exsudato através da transpiração. Consoante a planta, a incubação em EDTA para uma a duas horas ésuficiente para prevenir a vedação dos elementos de floema / peneira. A coleção pode ocorrer na água. Isto tem a vantagem de evitar o efeito negativo sobre o EDTA tem a estrutura celular e estabilidade. Também elimina a interferência de EDTA, com métodos como HPLC ou SDS-PAGE. Ele é mostrado como ele se aplica a Arabidopsis. Para plantas maiores, incubação em EDTA e exsudato colecções tem que ser aumentado e é realizado em provetas em vez de tubos de reacção de 1,7 ml.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de Vidro Raso ou Plástico (7-15cm)</td><td>PYREX ou Corning</td><td></td><td>Qualquer prato limpo e raso funcionará</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Apenas recipientes abertos na capela de fumaça</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos com tampa de rosca</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de tampa de rosca</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

coleta e análise de<em&gt; arabidopsis</em&gt; floema exsudados usando o método edta facilitada

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

O floema da planta é essencial para o transporte de longa distância de (foto-) assimila, bem como de transmissão de sinais de estresse biótico ou abiótico. Ele contém açúcares, aminoácidos, proteínas, lípidos, RNA e outros metabolitos. Enquanto existe um grande interesse no entendimento da composição e função do floema, o papel de muitas destas moléculas e, assim, a sua importância no desenvolvimento das plantas e de resposta ao estresse ainda tem de ser determinado. Um obstáculo para a análise floema reside no facto de que as vedações floema ferindo-se sobre. Como resultado, o número de plantas a partir de seiva floema que podem ser obtidos é limitada. Um método que permite a recolha de floema exsudados de várias espécies de plantas sem equipamento adicional é a recolha de exsudado floema EDTA facilitada descrito aqui. Embora seja fácil de utilizar, embora promova o ferimento de células e cuidado deve ser tomado para remover o conteúdo das células danificadas. Além disso, os vários controlos para comprovar a pureza do exsudadosão necessárias. Porque é uma exsudação ao invés de uma recolha directa de seiva do floema (não é possível em muitas espécies) só quantificação relativa de seus conteúdos podem ocorrer. A vantagem deste método é que, sobre os outros, pode ser usada em muitas espécies de plantas herbáceas ou lenhosas (Perilla, Arabidopsis, choupo, etc), e requer equipamento e formação mínima. Isso leva a uma razoavelmente grandes quantidades de exsudados que podem ser utilizados para a análise subsequente das proteínas, açúcares, lípidos, RNA, vírus e metabolitos. É suficientemente simples que pode ser usado tanto em uma investigação, bem como num laboratório de ensino.

Tornou-se claro nos últimos anos que a complexidade do floema a seiva pode ser a resposta para a pergunta de como as plantas enviar vários sinais de desenvolvimento e estresse para a resposta ideal. Usando EDTA facilitada floema exsudação pode fornecer a oportunidade de analisar exsudato do floema de plantas que não são adequados para outras abordagens, mas pode ser de interesse económico ou fisiológicos. Este método permite a colheita de floema suficiente exsudados para identificar proteínas floema-localizadas e detectar alterações no seu nível em resposta ao desenvolvimento ou stress (Figura 3). Como mostra a figura, as proteínas são de muito baixa abundância, ainda, o seu nível é alto o suficiente para experimentos de proteômica subsequentes usando LC-MS/MS ou para análise de Western blot. Constatações cucurbitáceas sugerem que o corte do caule leva a uma perturbação do equilíbrio do potencial hídrico e um influxo de água e subsequentepossíveis contaminantes no apoplasto 41. No entanto, para os tempos de recolha que variam de um a oito horas não afecta o perfil de floema de proteína / composição em Arabidopsis (. Apenas a quantidade absoluta varia Guelette et ai), a quantidade de proteína recolhidas e o padrão de proteínas encontradas varia entre espécies (Arabidopsis: Na; Perilla, pista I e NI) e tratamentos (Perilla crescido em diferentes comprimentos de dia, pista I e NI). Como sinais proteicas resultado pode ser visualizado, identificados e seguidos. mRNA e micro RNAs também podem ser identificados no floema exsudados por este método. No entanto, é necessária para impedir a degradação do ARNm durante o tempo prolongado de tratamento com exsudação inibidor de RNAse. Uma vez que os elementos de peneira não contêm cloroplastos funcionais, Rubisco pequena ou grande subunidade (rbcS ou RbCl, respectivamente), os mRNAs podem ser utilizados como controlos negativos, enquanto conhecido floemaLocalizada mRNA de enzima do tipo de conjugação de ubiquitina pode ser utilizado como um controlo positivo (Figura 4). Do mesmo modo, açúcares ou de pequenos metabolitos, podem ser analisados ​​utilizando GC-MS ou LC-MS. Aqui deve-se mencionar que as exsudações do floema contêm um grande número de enzimas funcionais, incluindo quase toda a via glicolítica 12. Assim, usando vários pontos de tempo pode revelar processos metabólicos durante a coleta de exsudato. Um exemplo é mostrado na Figura 5: Em todos os exsudados, a sacarose é o metabólito mais abundante, o que é mais evidente depois de um conjunto durante 1 hora. No entanto, depois de cinco horas a sacarose em relação a frutose é ligeiramente reduzida. Se a mesma exsudado é recolhido durante uma hora e deixado na bancada durante as quatro horas seguintes, a sacarose, a frutose razão é reduzida a uma amplitude muito maior, o que sugere que as enzimas activas do floema exsudados levam a uma degradação da sacarose na sala tempetura (para mais interpretações pico ver 14). Isto é consistente com os resultados que floema carregamento e transporte de moléculas a partir de células de companhia para os elementos crivados podem continuar durante a exsudação até que o sistema perde sua vitalidade 34. Lipídios no exsudato do floema e, por extensão, a sinalização de lipídios de longa distância é um campo relativamente recente de interesse na ciência das plantas. Devido à sua natureza hidrofóbica lípidos só estão presentes em baixas concentrações e pode ser ligado a outras moléculas para solubilização. No entanto, a exsudação EDTA facilitada permite a recolha de material suficiente para visualizar (TLC; Figura 6) e identificação (LC-MS, a Figura 7) floema lípidos partir de várias espécies de plantas. Como a figura mostra que é possível identificar e separar várias espécies de lípidos. LC-MS permite identificar diferentes espécies de lipídios e monitorar as alterações no perfil lipídico dos diferegenótipos NT ou tratamentos. Isto permite o estudo da função dos lípidos durante o desenvolvimento da planta e a resposta ao estresse. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Fluxograma da coleta de exsudato do floema de Arabidopsis ou Perilla. Caminhos diferentes levam a diferentes produtos finais, que são indicados em azul. Para a preparação de RNA, inibidor de RNAse (100 U / mL, Roche), é adicionado à água em que o exsudado é recolhido floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Instalação de materiais para floema exsudato recolheríons. A instalação exibe todos os materiais necessários para o protocolo passos 3,1-3,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 proteínas encontradas no floema exsudados de duas espécies diferentes de plantas, de Arabidopsis (a) e (Perilla I e NI; diferentes comprimentos de dia); MW: marcador de peso molecular (pista 2). As proteínas foram separadas utilizando um gradiente de 10-20% de SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Análiseda presença de ARNm de Rubisco pequeno e grande subunidade (rbcS e rbcL, respectivamente) e de enzima de conjugação de ubiquitina (UBC). mRNA foram coletados a partir de folhas de Arabidopsis (L), pecíolos (P), e exsudados do floema (Ph), reverter transcrições transcritas e específicas visualizadas usando PCR. A figura foi modificado a partir do Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura GC-MS perfil de floema 5. Exsudatos recolhidos para uma quantidade diferente de vezes. Note-se como a quantidade relativa de modificações de sacarose a partir de uma colecção horas (A) e 5 horas de tempo de colheita (B). Exsudato perfil após a coleta por 1 hora, seguido de &quot;incubação&quot; no quarto<html> temperatura ambiente (RT) durante quatro horas (C). Folha perfil metabólito (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Camada fina cromatograma comparando lipídios de Perilla (esquerda) e folhas de Arabidopsis (direita) e exsudados do floema. Os asteriscos indicam os lipídios específicos para floema exsudato. DGDG: digalactosildiacilglicerol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, a parte da figura exibindo lipídios Arabidopsis tenha sido modificado a partir Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Perfil lipídico de floema exsudatos de Arabidopsis (fase de clorofórmio) usando o modo de íons negativos LC-MS /. Os gráficos da parte superior (mutante, A) e inferior (de tipo selvagem, B) mostram as diferenças nos perfis lipídicos entre dois genótipos diferentes (indicado pelas setas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada.

Coleta e análise de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

O objetivo geral deste procedimento é coletar exsudato do floema de Arabidopsis ou outras plantas para analisar seus componentes ou confirmar a presença de compostos dentro do fluxo do floema. Isso é realizado primeiramente cortando e incubando a pétala em EDTA de potássio para impedir o selamento do elemento do tubo crivado. O segundo passo é lavar completamente a pétala para remover qualquer resíduo de EDTA que possa interferir na análise subsequente e também danificar as células durante exposições prolongadas.Em seguida, os exsudatos de fluxo EM são coletados na água. Aqui, a etapa final é preparar as amostras para análises subsequentes por gel L-C-M-S-G-C-M-S, eletroforese e cromatografia em camada delgada. Em última instância, a exsudação de phem facilitada por EDTA pode ser utilizada para analisar e confirmar o conteúdo de phem, como metabólitos e lipídios, proteínas ou RNAs.As plantas não conseguem escapar de condições adversas. Como resultado, precisam de sistemas muito eficientes e rápidos para transmitir sinais ambientais por toda a planta e responder alterando o desenvolvimento. Uma dessas vias de sinalização é o fluxo vegetal, cuja composição é bastante complexa de compreender.Utilizamos a sedação com fluxo facilitado por EDTA para a coleta e análise do conteúdo do fluxo. Foi originalmente desenvolvida em Perilla por King, mas pode ser facilmente modificada para outras espécies. Demonstrarão o procedimento Elena e EU, ambos estudantes de graduação do meu laboratório, antes do início deste procedimento.Cultive plantas de Arabidopsis por quatro a seis semanas em câmaras de crescimento com um período fotoperiódico de 12 horas no dia da coleta. Dilua a solução de EDTA de potássio 100 milimolar previamente preparada com água para obter uma concentração final de 20 milimolar. Em seguida, preencha dois recipientes de vidro com diâmetro de sete a 15 centímetros até a metade com a solução de EDTA de potássio 20 milimolar.Quando terminar, preencha tubos de reação de 1,7 mililitro com 1,4 mililitro da solução de EDTA de potássio 20 milimolar. Em seguida, preencha um número igual de tubos de reação com 1,4 mililitro de água Millipore. Após remover plantas com quatro a seis semanas de idade das câmaras de crescimento, colete as folhas em roseta cortando-as com lâmina de barbear na base da pétala, próxima ao centro da roseta.Coloque imediatamente as folhas nas placas contendo EDTA de potássio 20 milimolar, com a extremidade cortada dos pecíolos submersa na solução. Após coletar 15 folhas de três a quatro plantas, empilhe-as suavemente umas sobre as outras, de modo que os pecíolos cortados fiquem alinhados entre si. Corte novamente a base dos pecíolos e enrole suavemente as folhas.A seguir, insira cuidadosamente as folhas enroladas em um dos tubos de reação contendo EDTA de potássio 20 milimolar para coleta de exsudato. Na escuridão, forre o fundo de um recipiente raso e grande com toalhas de papel úmidas. Posicione a grade com os tubos de reação contendo folhas dentro do recipiente e coloque-o em um saco plástico preto com fendas para ventilação.Em seguida, coloque todo o conjunto em um gabinete para a coleta de exsudato. Na linha de luz, forre a base de um recipiente transparente de plexiglás com toalhas de papel umedecidas. Coloque a grade com os tubos de reação contendo folhas dentro do recipiente e feche-o.Após remover a grade do recipiente, uma hora depois, retire as folhas dos tubos de reação. Lave bem as folhas com água destilada para remover todo o EDTA. Transfira imediatamente as folhas para os tubos de reação contendo água Millipore e devolva-as aos recipientes umidificados para a coleta de exsudatos após a remoção da grade do recipiente umidificado.Cinco a oito horas depois, retire as folhas dos tubos, congele os exsudatos de fluxo em nitrogênio líquido e armazene-os em um congelador a menos 80 graus Celsius. Para análises adicionais no dia seguinte, descongele as amostras em preparação para análise de lipídios. Em seguida, retire duas a três amostras e adicione uma quantidade igual de clorofórmio e metanol à solução combinada.Vortexie a mistura por alguns segundos. Em seguida, centrifugue a amostra por quatro minutos a 400 ×g. Ao finalizar, colete a fase orgânica inferior em um tubo de vidro após repetir a partição com a fase superior mais três vezes, seque as fases orgânicas combinadas sob fluxo de nitrogênio e submeta à cromatografia em camada delgada e análise por CLAE-EM.Este método permite a coleta de exsudatos de floema em quantidade suficiente para identificar proteínas localizadas no floema e as alterações em seus níveis em resposta ao desenvolvimento ou ao estresse. Em alguns casos, os pesquisadores podem desejar usar inibidores de proteinase para prevenir a degradação das proteínas. Como mostrado aqui, as proteínas estão em abundância muito baixa, ainda que seus níveis sejam suficientemente altos para experimentos subsequentes de proteômica.O uso de LCMS ou as descobertas em análises de western blot em cucurbitáceas sugere que o corte do caule leva à interrupção do equilíbrio do potencial hídrico e a uma subsequente entrada de água e possíveis contaminantes do alast. No entanto, a coleta por períodos que variam de uma a oito horas não afeta o perfil e a composição de proteínas M no InOpSys. A quantidade de proteína coletada e o padrão de proteínas encontradas variam entre espécies e tratamentos.Como resultado, os sinais proteicos podem ser visualizados, identificados e acompanhados. O mRNA e os microRNAs também podem ser identificados nos exsudatos flom por este método. No entanto, o tratamento com inibidor de RNAs é necessário para evitar a degradação do MR.NA durante o tempo prolongado de exsudação.Como os elementos C não contêm cloroplastos funcionais, os RNAm da rubisco, subunidade pequena ou grande, podem ser usados como controles negativos, enquanto um RNAm conhecido por estar localizado no fluído do phloema, como o da enzima ubiquitina conjugadora, pode ser usado como controle positivo. Da mesma forma, açúcares ou pequenos metabólitos podem ser analisados utilizando GC-MS ou LC-MS. Deve-se mencionar que os exsudatos do floema contêm um grande número de enzimas funcionais, incluindo praticamente toda a via glicolítica.Portanto, o uso de vários pontos temporais pode revelar processos metabólicos durante a coleta do exsudato. Em todos os exsudatos, a sacarose é o metabólito mais abundante. Isso é mais evidente após uma coleta de uma hora.No entanto, após cinco horas, a razão entre sacarose e frutose é ligeiramente reduzida. Se o mesmo exsudato for coletado por uma hora e depois mantido em bancada por mais quatro horas, a razão entre sacarose e frutose é reduzida em uma extensão muito maior. Isso sugere que enzimas ativas nos exsudatos do floema levam à degradação da sacarose à temperatura ambiente.Além disso, o fato de a coleta contínua durante cinco horas mostrar apenas uma leve redução na razão sacarose para frutose é consistente com as descobertas de que o carregamento do floema e o transporte de moléculas das células companheiras para os elementos do tubo crivado podem continuar durante a exsudação até que o sistema perca sua vitalidade. Os lipídios nos exsudatos do floema, e por extensão a sinalização lipídica de longa distância, representam um campo de interesse relativamente recente na ciência vegetal. Devido à sua natureza hidrofóbica, os lipídios estão presentes apenas em baixas concentrações e podem estar ligados a outras moléculas para solubilização.No entanto, a exsudação facilitada por EDTA permite a coleta de material suficiente para visualizar e identificar o fluxo e os lipídios de diversas espécies vegetais. Como mostrado aqui, é possível separar diversas espécies de lipídios utilizando a cromatografia em camada delgada. A LC-EM permite identificar diferentes espécies de lipídios e monitorar alterações nos perfis lipídicos de diferentes genótipos ou tratamentos.Isso permite o estudo do papel dos lipídios durante o desenvolvimento vegetal e a resposta ao estresse. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em apenas três horas, se executada corretamente. No entanto, para a maioria das amostras, recomendamos um tempo de coleta de cinco a oito horas.Neste caso, recomenda-se iniciar cedo pela manhã a colheita das folhas. Este procedimento pode ser modificado para outras plantas e pode levar à descoberta ou confirmação de novos compostos de fluxo. Ao realizar este procedimento, é importante observar atentamente as LDPs após a primeira hora para remover o EDTA e evitar espremer as folhas, prevenindo contaminação com conteúdo de outras células.Além disso, o uso de luvas também protege suas amostras contra contaminantes que você poderia introduzir a partir da sua pele. Para prevenir contaminação, utilize os controles apropriados para amostras de proteína, RNA ou metabólitos. Os controles sugeridos estão listados no protocolo descrito no texto. Este método nos permitiu obter novas perspectivas sobre a composição do fluxo vegetal.Fomos capazes de identificar vários lipídios no exsudato da forma, os quais não eram esperados no ambiente aquoso do piso. Isso nos levou, assim como a outros pesquisadores, a introduzir o conceito de sinalização lipídica de longa distância, que agora se desenvolveu em um novo e empolgante campo de pesquisa com implantes.

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