Coleta e análise de Arabidopsis Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada
23 de outubro de 2013
O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada.
O objetivo geral deste procedimento é coletar exsudato de floração de Arabidopsis ou outras plantas para analisar seu conteúdo ou confirmar a presença de compostos dentro do fluxo de flor. Isso é feito primeiro cortando e incubando a pétala em EDTA de potássio para evitar a vedação do elemento marinho. O segundo passo é lavar bem a pétala para remover qualquer EDTA restante que possa interferir na análise subsequente e também danificar as células durante a exposição a longo prazo.
Em seguida, os exsudatos EM de fluxo são coletados na água. Sua etapa final é preparar amostras para análise subsequente por gel L-C-M-S-G-C-M-S, eletroforese e cromatografia em camada fina. Em última análise, a exsudação de phem facilitada por EDTA pode ser usada para analisar e confirmar o conteúdo de phem como metabólitos e lipídios, proteínas ou RNAs.
As plantas não podem escapar de condições adversas. Como resultado, eles exigem sistemas muito eficientes e rápidos para transmitir sinais ambientais por todas as plantas e responder alterando o desenvolvimento. Uma dessas vias de sinalização é o fluxo da planta, que é bastante complexo para entender sua composição.
Utilizamos a sedação de fluxo facilitada por EDTA para a coleta e análise do conteúdo do fluxo. Foi originalmente desenvolvido em Perilla pelo rei e pode ser facilmente modificado para outras espécies. Demonstrando o procedimento estarão Elena e nós, ambos alunos de graduação do meu laboratório antes de iniciar este procedimento.
Cultive Arabidopsis planeja quatro a seis semanas em câmaras de crescimento com um período fotográfico de 12 horas no dia da coleta. Solução diluída de EDTA de potássio a 100 milimolares previamente preparada com água para obter uma concentração final de 20 milimolares. Em seguida, encha dois pratos de vidro de sete a 15 centímetros de diâmetro até a metade com a solução de EDTA de potássio 20 milimolares.
Quando terminar, encha os tubos de reação de 1,7 mililitro com 1,4 mililitros da solução de EDTA de potássio 20 milimolar. Em seguida, encha um número igual de tubos de reação com 1,4 mililitros de água milipore. Depois de remover as plantas de quatro a seis semanas das câmaras de crescimento, colha as folhas da roseta cortando-as com uma lâmina de barbear na base da pétala, perto do centro da roseta.
Coloque imediatamente as folhas nos pratos contendo 20 milimolares de potássio EDTA com a extremidade cortada da pérola submersa na solução. Depois que 15 folhas forem coletadas de três a quatro plantas, empilhe-as suavemente umas sobre as outras, de modo que as pétalas cortadas fiquem alinhadas umas com as outras. Corte novamente a base das pétalas e role suavemente as folhas.
Em seguida, insira suavemente as folhas enroladas em um dos tubos de reação contendo 20 EDTA de potássio milimolar para coleta de exsudato. No escuro, forre o fundo de um prato grande e raso com toalhas de papel molhadas. Posicione o rack com os tubos de reação cheios de folhas no prato e coloque-o em um saco plástico preto com fendas para aeração.
Em seguida, coloque toda a configuração em um gabinete para coleta de exsudato. Na linha de luz o fundo de um recipiente de plexiglass transparente com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reação cheios de folhas no recipiente e feche-o.
Depois de retirar a grelha do recipiente, uma hora depois, retire as folhas dos tubos de reação. Lave bem as folhas com água destilada para remover todo o EDTA. Transfira imediatamente as folhas para os tubos de reação contendo água milipore e devolva-as aos recipientes umidificados para a coleta de exsudatos após a remoção da prateleira do recipiente umidificado.
Cinco a oito horas depois, retire as folhas dos tubos, congele os exsudatos de fluxo em nitrogênio líquido e armazene-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos. Para análise posterior no dia seguinte, descongele as amostras em preparação para análise lipídica. Em seguida, retire duas a três amostras e adicione uma quantidade igual de clorofórmio e metanol à solução combinada.
Vortex a mistura por alguns segundos. Em seguida, centrifugue a amostra por quatro minutos a 400 gs. Quando terminar, coletar a fase orgânica inferior em um tubo de vidro após repetir a partição com a fase superior, mais três vezes, secar as fases orgânicas combinadas sob uma corrente de nitrogênio e submeter à cromatografia em camada delgada e análise LCMS.
Este método permite a colheita de exsudatos de phem suficientes para identificar proteínas localizadas em phem e as mudanças em seu nível em resposta ao desenvolvimento ou estresse. Em alguns casos, os pesquisadores podem querer usar inibidores de proteinase para evitar a degradação de proteínas. Como mostrado aqui, as proteínas estão em abundância muito baixa, mas seu nível é alto o suficiente para experimentos proteômicos subsequentes.
Usando LCMS ou para análise de western blot, os achados em cucurbitáceas sugerem que o corte do STEM leva a uma interrupção do equilíbrio potencial da água e a um subsequente influxo de água e possíveis contaminantes do alast. No entanto, a coleta por tempos que variam de uma a oito horas não afeta o perfil e a composição da proteína M de fluxo no OpSys. A quantidade de proteína coletada e o padrão de proteínas encontradas variam entre as espécies e os tratamentos.
Como resultado, os sinais proteicos podem ser visualizados, identificados e seguidos. mRNA e microRNAs também podem ser identificados em exsudatos de flom por este método. No entanto, o tratamento com inibidor de RNAs é necessário para evitar a degradação da RM. NA durante o tempo de exsudação prolongado.
Uma vez que os elementos C não contêm cloroplastos funcionais, rubis, mRNAs de subunidades pequenas ou grandes podem ser usados como controles negativos, enquanto mRNA localizado em pH conhecido como enzima conjugadora de ubiquitina podem ser usados como controle positivo. Da mesma forma, açúcares ou pequenos metabólitos podem ser analisados usando GCMS ou LCMS. Deve-se mencionar que os exsudatos de phem contêm um grande número de enzimas funcionais, incluindo quase toda a via glicolítica.
Portanto, o uso de vários pontos de tempo pode revelar processos metabólicos durante a coleta do exsudato. Em todos os exsudatos, a sacarose é o metabólito mais abundante. Isso é mais óbvio depois de uma coleta de uma hora.
No entanto, após cinco horas, a proporção de sacarose para frutose é ligeiramente reduzida. Se o mesmo exsudato for coletado por uma hora e depois deixado na bancada por mais quatro horas, a proporção de sacarose para frutose é reduzida em uma extensão muito maior. Sugerindo que as enzimas ativas nos exsudatos de phem levam à degradação da sacarose à temperatura ambiente.
Além disso, o fato de a coleta contínua por cinco horas mostrar apenas uma ligeira redução na proporção de sacarose para frutose é consistente com as descobertas de que o carregamento de phem e o transporte de moléculas de células companheiras para os elementos marinhos podem continuar durante a exsudação até que o sistema perca sua vitalidade. Os lipídios nos exsudatos de phem e, por extensão, a sinalização lipídica de longa distância são um campo de interesse bastante recente na ciência das plantas. Devido à sua natureza hidrofóbica, os lipídios estão presentes apenas em baixas concentrações e podem estar ligados a outras moléculas para solubilização.
No entanto, a exsudação facilitada pelo EDTA permite a coleta de material suficiente para visualizar e identificar o fluxo e os lipídios de várias espécies de plantas. Como mostrado aqui, é possível separar várias espécies lipídicas usando cromatografia em camada fina. O LCMS permite identificar diferentes espécies lipídicas e monitorar alterações nos perfis lipídicos de diferentes genótipos ou tratamentos.
Isso permite o estudo do papel dos lipídios durante o desenvolvimento da planta e a resposta ao estresse. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em apenas três horas se for executada corretamente. No entanto, para a maioria das amostras, sugerimos um tempo de coleta de cinco a oito horas.
Nesse caso, recomenda-se o início da colheita das folhas no início da manhã. Este procedimento pode ser modificado para outras plantas e pode levar à descoberta ou confirmação de novos compostos de fluxo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de observar cuidadosamente os PDLs após a primeira hora para remover o EDTA e não apertar as folhas para evitar a contaminação com o conteúdo de outras células.
Além disso, o uso de luvas também protege suas amostras de contaminantes que você pode introduzir de sua pele Para evitar a contaminação, use os controles apropriados para amostras de RNA de proteína ou metabólito. Os controles sugeridos são listados no protocolo de texto. Este método nos permitiu obter novos insights sobre a composição do fluxo da planta.
Conseguimos identificar vários lipídios dentro da forma exsudato, que não eram esperados no ambiente aquoso do piso. Isso nos levou e a outros a introduzir o conceito de sinalização lipídica de longa distância, que agora se desenvolveu em uma nova e empolgante pesquisa de implantes de campo.
Visão Geral
Este estudo descreve um método para coletar exsudatos do floema de plantas, especificamente Arabidopsis, utilizando uma abordagem facilitada por EDTA. Compreender a composição da seiva do floema é essencial para obter insights sobre a sinalização vegetal e as respostas ao estresse ambiental.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Mecanismos de transporte no floema
- Análise de metabólitos
Contexto
- O suco floemático desempenha um papel fundamental na sinalização de longa distância em plantas.
- O transporte eficiente de nutrientes e sinais é essencial para o desenvolvimento da planta.
- O método facilitado por EDTA permite a coleta eficaz de exsudatos floemáticos.
- Compreender a composição do floema auxilia no estudo das respostas das plantas ao estresse e a patógenos.
Objetivo do Estudo
- Coletar e analisar exsudatos do floema de Arabidopsis e outras plantas.
- Confirmar a presença de metabólitos, proteínas e RNAs na seiva do floema.
- Investigar as vias de sinalização envolvidas nas respostas das plantas a condições ambientais.
Métodos Utilizados
- Incubação de pétalas de plantas em EDTA de potássio para evitar o selamento dos elementos crivados.
- Coleta de exsudatos do floema em tubos de reação para análise.
- Uso de CL-EM, CG-EM e cromatografia em camada delgada para análise de metabólitos.
- Congelamento e descongelamento de amostras para análise adicional de proteínas e RNAs.
Resultados Principais
- Coleta bem-sucedida de exsudatos do floema suficientes para estudos de proteômica e metabolômica.
- Identificação de proteínas e metabólitos, incluindo a sacarose como o metabólito mais abundante.
- Demonstração da aplicabilidade do método em diferentes espécies vegetais.
- Informações sobre a dinâmica da composição do floema em resposta a condições de desenvolvimento e estresse.
Conclusões
- O método facilitado por EDTA é eficaz para o estudo de exsudatos do floema.
- A análise da seiva do floema pode revelar informações importantes sobre sinalização e metabolismo vegetal.
- Essa abordagem pode ser adaptada para diversas espécies vegetais, a fim de aprimorar o entendimento das funções do floema.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O entendimento da composição do floema permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos para aplicações de biofármacos baseados em plantas, particularmente na análise de metabólitos e vias de sinalização. O método de exsudação facilitado por EDTA sustenta a confiança preditiva ao fornecer acesso reprodutível ao conteúdo do floema entre espécies, auxiliando fluxos de trabalho de descoberta precoce. Essa abordagem melhora a continuidade translacional desde a descoberta até a avaliação pré-clínica de compostos derivados de plantas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a análise de metabólitos, proteínas e RNAs localizados no floema envolvidos em vias de sinalização de estresse.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da validação funcional de alvos utilizando perfis de sacarose, lipídios e proteínas como biomarcadores da integridade e atividade do floema.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao associar alterações na composição do floema a condições de desenvolvimento ou estresse, orientando decisões de avançar ou não em triagens de compostos baseados em plantas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, produzindo exsudatos adequados para análise por CL-EM, CG-EM e cromatografia em camada delgada de metabólitos e lipídios.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de tempos controlados de coleta de exsudatos e etapas de remoção de EDTA, reduzindo a variabilidade nos resultados de triagem de compostos.
- Escalabilidade: Permite a avaliação confiável de compostos em espécies herbáceas e lenhosas com equipamentos mínimos, favorecendo a reutilização da plataforma em processos de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças por meio da análise de sinalização lipídica e enzimas glicolíticas em exsudatos do floema, alinhando-se à descoberta translacional de biomarcadores nas respostas ao estresse em plantas.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo o perfilhamento longitudinal de metabólitos e proteínas do floema ao longo de diferentes pontos temporais e tratamentos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões sobre o avanço de compostos derivados de plantas mediante a identificação de biomarcadores estáveis (por exemplo, razões de sacarose) que refletem a vitalidade do carregamento e transporte no floema.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, apoiando a análise de metabólitos, proteínas e lipídios derivados do floema em Arabidopsis e outras espécies.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a análise de compostos localizados no floema envolvidos na sinalização de estresse e no fluxo metabólico.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio por meio de etapas padronizadas de coleta e purificação de exsudatos, garantindo resultados quantitativos reprodutíveis para triagem de metabólitos e lipídios.
- Análises: Destaca a CL-EM, a CG-EM e a cromatografia em camada delgada como técnicas analíticas fundamentais que geram conjuntos de dados comparáveis para avaliar os efeitos de compostos na composição do floema.
- Pesquisa Translacional: Conecta o método à continuidade pré-clínica ao permitir o rastreamento de biomarcadores lipídicos e proteicos ao longo de condições de desenvolvimento e estresse, apoiando o avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Empresarial: Posiciona o método facilitado por EDTA como uma capacidade reutilizável entre espécies vegetais e laboratórios, reduzindo a dependência de equipamentos especializados para análise de floema.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista nas vias de sinalização do floema e descoberta de biomarcadores para resposta ao estresse.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da coleta de exsudatos entre espécies e ambientes laboratoriais.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital mediante redução da desistência em estágios avançados no desenvolvimento de compostos baseados em plantas e redução do risco biológico na seleção de alvos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e tomada de decisões de avanço ajustadas ao risco com base em perfis quantitativos de metabólitos e proteínas do floema.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em fisiologia vegetal e análise de metabólitos para distinguir exsudatos floemáticos verdadeiros de contaminantes celulares.
- Depende do acesso a instrumentação de CL-EM, CG-EM e eletroforese para caracterização abrangente dos exsudatos.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de lavagem com EDTA e do tempo de coleta para garantir reprodutibilidade entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método em espécies lenhosas versus herbáceas, devido às diferenças na cinética de selamento do floema.
- Limitação prática: quantificação relativa apenas, já que o método se baseia na exsudação e não na coleta direta de seiva floemática, exigindo estratégias de normalização para comparações entre amostras.
