Name: Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a montar embriões de zebrafish para microscopia de folha de luz de longo prazo usando tubos FEP e agarose. Este método permite observar o desenvolvimento embrionário in vivo por vários dias com alta resolução.

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Agradecemos a Sociedade Max Planck, o Human Frontier Science Program (HFSP) eo Boehringer Ingelheim Fonds para financiamento e apoio.

1. Preparação do material <ol><li> Preparação de tubos de FEP <ol><li> Limpar o tubo FEP (Figura 2A), através de lavagem líquidos (nas etapas descritas a seguir), através do tubo e, utilizando uma seringa ligada com uma extremidade da cânula romba (Figura 2B) Nota 1:.. Utilizar luvas durante o procedimento Nota 2: Recomendamos cortar o tubo em pedaços de ca. 1 m de comprimento e limpeza aqueles em paralelo. <ol><li> Lavar o primeiro tubo com NaOH 1 M repetidamente. Em seguida, transferir o tubo para um tubo de centrífuga de 50 ml cheio com NaOH 0,5 M e ultrasonicate lo por 10 minutos. </li><li> Transferir o tubo de polímero para uma pequena bacia com DDH 2 O. Lavar o tubo pela primeira vez com ddH2O e, em seguida, com 70% de EtOH. </li><li> Subsequentemente transferir o tubo FEP para um novo tubo de centrífuga com 70% de EtOH. Novamente ultrasonicate este tubo de centrifugação durante 10 min. </li></ol></li><li> Corte o tubo FEP limpas em pedaçosde cerca de 3 cm (um tamanho típico para uso em montagem de peixe-zebra e de imagem) e endireitá-los, se necessário. Armazenar os tubos de FEP limpos em um 50 ml novo tubo de centrífuga preenchido com ddH2O (Figura 2C). </li></ol></li><li> Preparação da solução estoque tricaina <ol><li> Preparar a solução estoque tricaina 0,4% dissolvendo 400 mg tricaina (MS-222) em 97,9 ml DDH 2 O. Após o pó estar completamente dissolvido, ajustar o pH a 7.0 usando 2,1 mL de Tris 1M (pH 9,0). Proteger a solução da luz. Armazenar aliquotas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de 3% de metilcelulose <ol><li> Preparar solução de metilcelulose a 3% para o revestimento interior dos tubos de FEP, como descrito abaixo. Aquecer E3 11 em um frasco de vidro a cerca de 60-70 ° C e adicionar a quantidade adequada de metilcelulose em pó. Adicionar uma barra de agitação e agita-se a 4 ° C. Assim que a solução é arrefecida até abaixo de 30 ° C, adicionar solução tricaina para um final concentration de 100 mg / L. Manter agitação a 4 ° C durante a noite. </li></ol></li><li> Preparação de 1,5% e 0,1% de agarose em E3 <ol><li> Dissolve-se a quantidade apropriada de agarose de baixo ponto de fusão do pó, num volume definido de E3, em um frasco de vidro. Aqueça a mistura em um forno de microondas e agite-o de vez em quando, até que a solução de agarose aparece homogênea, sem cristais restantes. </li><li> Prepare a aliquotas de 1 mL de solução de agarose a 0,1% em 1,5 ml de tubos de reacção. As aliquotas podem ser guardadas a 4 ° C. </li><li> Usar a solução de 1,5% para o revestimento de um prato Petri de plástico. A espessura da camada de agarose devem ser ca. 2 milímetros. Após a agarose é solidificado, adicionar meio E3 no topo da camada para evitar que sequem. O prato revestido pode ser armazenado a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação de peixe-zebra <ol><li> Mantenha peixe-zebra (Danio rerio) adultos e embriões de 28,5 ° C e tratá-los de acordo com os protocolos estabelecidos 11,12. </li><li> Configure peixe macho e fêmea no período da tarde e separá-los usando um divisor. Remover o divisor na manhã seguinte para cronometrar o acasalamento dos peixes. </li><li> Coletar os embriões em um prato cheio de E3 e examiná-las usando um microscópio estereoscópico. </li><li> Aos 24 hpf (ou do estágio de desenvolvimento de seu interesse), selecione o embrião de peixe-zebra para a expressão de fluorescência e transferir os positivos para um novo prato com E3 fresco. </li><li> Dechorionate cuidadosamente os embriões utilizando duas pinças afiadas (Figuras 2D e 2E). Use a primeira pinça para agarrar e segurar o córion ea segunda pinça para rasgá-la aberta e retirá-lo Nota 1:. Execute esta etapa com a ajuda de um microscópio estereoscópico. </li></ol></li></ol> 2. Multicamadas de montagem <ol><li> O revestimento do tubo FEP <ol><li> Anexar uma cânula fim brusco de uma seringa. Inserir a cânula cuidadosamente durante cerca de 3 mm na extremidade de um corte limpo e pedaço de. Tubo FEP (Figuras 2F e 2G) Nota 1: Usar luvas e evitar qualquer flexão ou compressão do tubo. </li><li> Mergulhar a extremidade livre do tubo de FEP em 3% de metilcelulose e encher o tubo com a solução. </li><li> Libertam lentamente o metilcelulose, empurrando a seringa. Descartar a solução. </li><li> Repita os passos 2.1.2 e 2.1.3 utilizando E3 Nota 1:. Os tubos revestidos precisam de ser usados ​​para a montagem imediatamente. </li></ol></li><li> Transferir o peixe-zebra para o agarose <ol><li> Aquece-se uma alíquota de 0,1% de agarose a 70 ° C num bloco de aquecimento. Vortex brevemente o tubo de reacção e transferi-lo para um bloco de calor definida a 38 ° C (Figura 2H). </li><li> Pegue o tubo de reacção para fora do bloco de calor e deixe esfriar por alguns instantes. Adicionar tricaina para uma concentração final de 133-200 mg / L e de vórtice de novo (Figura 2I). </li><li> Selecione um dos embriões de peixe-zebra dechorionated e transfe. r-o para o tubo de reacção com o pré-aquecido de agarose a 0,1%, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro (Figuras 2K e 2J) Nota 1: tentar transferir tão pouco quanto possível E3 adicional. </li></ol></li><li> Montagem do peixe-zebra <ol><li> Tome-se o embrião com o tubo FEP anexado à seringa (Figura 2L). . O tubo deve ser preenchido completamente com 0,1% de agarose, com o embrião posicionado perto de uma das extremidades do tubo e com a cabeça apontando para a abertura do tubo Nota 1: Certifique-se de tomar um pouco de agarose antes de assumir o peixe. Nota 2: Puxe muito suavemente na seringa para evitar bolhas Nota 3:. Manter o tubo em uma orientação horizontal para evitar o vazamento de seu conteúdo (Figuras 2M e 2N). </li></ol></li><li> Ligar o tubo <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Multicamadas de montagem para embriões de peixe-zebra. A) Etileno Propileno (FEP fluorados) tubos em um tambor de cabo antes da preparação. B) uma seringa com uma cânula de ponta romba anexado. C) A limpos e cortados tubo FEP. D, E) Dechorionation de 24 hpf embriões de peixes-zebra. F) Colocação do tubo a montante da cânula de extremidade embotada. G) ​​A seringa com a cânula e o tubo ligado. H) Uma alíquota de 0,1% de agarose dentro de um tubo de reacção, enquanto o transferir para um bloco de aquecimento. eu) vórtex do fundido de agarose. J) A absorção de um embrião dechorionated utilizando uma pipeta de vidro. K) transferência do embrião para a agarose fundida. G) ​​de admissão do embrião com áreas de agarose para o tubo FEP. M, N) O embrião do peixe-zebra por dentro do tubo FEP . <strong&gt; ó) de corte do tubo entre o espécime e cânula. P) Tapar o tubo através da utilização de um prato revestido com agarose. Q) O embrião dentro do tubo ligado. R) A preparação final de amostra num suporte de metal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <ol><li> Use uma lâmina de barbear para cortar o tubo para fora da cânula (Figura 2O). </li><li> Lentamente furar a extremidade do tubo contendo o peixe através de toda a camada de agarose a 1,5% no prato de plástico para ligar o tubo (Figura 2P) Nota 1:. Evitar a formação de bolhas e tentar obter uma ficha de superfície recta, mantendo o . tubo exatamente perpendicular à superfície agarose Nota 2: Rode o tubo ligeiramente para obter um encaixe legal. </li><li> Manter as amostras montadas em um tubo de reacção de 1,5 ml com o E3, para evitar a secagem. A amostra é now pronta para ser trabalhada. Antes de imagem, verificar se o peixe está sentado à direita no topo da ficha (Figuras 2T e 2R). Certifique-se também adicionar ao meio tricaina dentro da câmara de imagem na mesma concentração que no meio de suporte. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Técnicas avançadas de microscopia, como a microscopia folha de luz nos permitem gravar dados de imagem com alta resolução temporal e espacial ao longo de vários dias, mas também exigem técnicas de montagem de amostras para melhorar. Nós apresentamos um protocolo detalhado de montagem para microscopia folha de luz do desenvolvimento do peixe-zebra multicamadas. O método é simples de implementar e podemos usá-lo em nosso laboratório em uma base diária. Os tubos de FEP Os principais componentes de nossa estratégia de montagem são tubos feitos de polímero de etileno propileno fluorado (FEP). Decidimos usar FEP principalmente por causa de seu índice de refração de 1,338, que é semelhante à água e, portanto, ideal para microscopia folha de luz com os objetivos de água de imersão e os espécimes que necessitam de meios aquosos. Os tubos, com 0,8 mm de diâmetro interno e 0,4 mm de espessura de parede encaixam o desenvolvimento do peixe-zebra muito bem, pode ser usado com os suportes de amostras típicas adequadas para 1,6 milímetroscapilares e são a primeira opção para o método de montagem apresentada. Nós testamos-los completamente em nossas instalações construídos em casa, bem como no sistema comercial &quot;Lightsheet Z.1&quot; por Carl Zeiss Microscopy e descobriu que os tubos de FEP oferecer estabilidade a longo prazo, têm apenas um impacto mínimo no desempenho óptico e não fluorescente são 10. Eles são, no entanto, não é adequado para aplicações com amostras que requerem um índice de refracção diferente, por exemplo, afastada espécime. Os tubos, assim como películas feitas de FEP estão disponíveis numa variedade de diâmetros e espessuras. Além disso, o FEP pode ser derretido a 260 ° C e, portanto, oferece possibilidades quase infinitas para suportes de montagem de amostras feitos sob medida. Os tubos de polímeros tendem a ser fornecido não estéril, razão pela qual o protocolo de limpeza incorpora várias medidas para assegurar a melhor qualidade óptica. O revestimento com metilcelulose assegura que nenhuma parte do crescimento de embriões de peixe-zebra adere ao polímero. A decisão para 0,1% de agarose baseia-se extensos testes de taxa de crescimento e de imobilidade em diferentes concentrações de agarose e metil-celulose 10. Concentrações de agarose 0,1% acima já mostrou um grave impacto sobre a taxa de crescimento de 24 hpf peixe-zebra. Além disso, usamos baixas doses da droga tricaina anestesiante. Potenciais blocos tricaina de ação, portanto, inibe a transmissão de sinais entre o cérebro e os músculos e suprime as contrações musculares 16. Uma concentração de 133-200 mg / L garante a imobilização suficiente de peixe-zebra 24-72 hpf. No entanto, tricaina e outras drogas anestesia de nós testamos show de efeitos colaterais de doses dependentes, tais como edema cardíaco. Além disso, a dose necessária de tricaina varia de acordo com o estádio de desenvolvimento do embrião. Recomendamos, portanto, reduzindo a concentração tricaina ao montante necessário para as fases de desenvolvimento que têm imagem. Para garantir a melhor performance e evitar a formação de subprodutos tóxicos, deve ser utilizado de solução stock recém-preparada ou descongelado tricaina, protegido da luz e não aquecida acima de 30 ° C. A incorporação em tubos de FEP também permite a fácil modificação do meio de montagem para contabilizar as necessidades específicas. Por lapso de tempo de imagem do coração, recomendamos o uso de 3% de metilcelulose e 100 mg / L tricaina em vez de 0,1% de agarose e 200 mg / L para a montagem. A metilcelulose é mais viscoso do que 0,1% de agarose proporcionando assim maior imobilidade no seu próprio e menos tricaina precisa de ser usado para assegurar o confinamento do embrião. Tricaina é sensível a temperaturas acima de 30 ° C, e também pode ser diluído com o meio na câmara de imagem, o que leva a uma diminuição do desempenho e possível espasmos do embrião. Portanto, certifique-se de usar tricaina também no meio de imagem em que o espécime montado está imerso. Se seus experimentos requerem o uso de maiortemperaturas, recomendamos a troca do meio na câmara de imagem seja constantemente por meio de um sistema de perfusão, ou manualmente, com um tubo e uma seringa entre dois pontos de tempo. As etapas críticas Os passos críticos durante o processo de montagem da amostra são a ingestão do espécime para dentro do tubo e a inserção do tampão de agarose. A ingestão define a posição inicial do embrião, o que é incómodo para mudar depois. Várias amostras devem estar disponíveis para a montagem ea qualidade de montagem deve ser monitorizada com um microscópio estereoscópico. Se a orientação da amostra não é satisfatório, alterando a velocidade de elaboração da amostra e evitando movimentos subsequentes do êmbolo pode ajudar como isso muitas vezes torce o embrião. A ficha de agarose a 1,5% é necessário para evitar a fuga de agarose 0,1%. A superfície do tampão no interior do tubo deve ser plana para não influenciar a orientação da amostra durante o desenvolvimento. Para conseguir um bom surfeás, diferentes espessuras das camadas de agarose precisa ser testado e o tubo precisa de ser colocado na agarose normal à superfície. Girar o tubo um pouco e puxar o tubo libera cuidadosamente a ficha do prato. A qualidade da montagem deve ser verificada com um microscópio estereoscópico antes de imagem. Imaging Multiview Uma grande vantagem da microscopia folha de luz é a imagem multiview, a capacidade de girar a amostra, adquirir z-stacks de múltiplos ângulos e, posteriormente, registrar e fundi-las. Um método criado para registrar os z-stacks no espaço 3D é o registro baseado em talão usando partículas fluorescentes em torno da amostra como marcadores fiduciários 17. Este método, porém, depende de um meio de montagem sólida como 1,5% de agarose e, portanto, parece ser incompatível com a multicamada montagem aqui apresentada. Mas várias soluções alternativas funcionar, dependendo da aplicação. Em primeiro lugar, as pérolas fluorescentes podeser incorporado no tampão de agarose, o qual tem de ser, no campo de visão durante a aquisição. Em segundo lugar, as posições de fase pode ser calibrado antes das experiências reais, utilizando uma coluna de agarose a 1,5% com partículas fluorescentes. Em terceiro lugar, marcadores alternativos, tais como os núcleos fluorescentes pode ser utilizada para identificar a posição das pilhas z em relação ao outro. Evaporação Típicas configurações de microscopia folha de luz usar uma câmara de amostra aberto, o que leva inevitavelmente à evaporação do meio. Uma vez que o meio é essencial para a sobrevivência da amostra, para limitar a evaporação do meio de montagem e para o índice de refração correcto entre a óptica e da amostra, é recomendável tendo uma ou mais das seguintes medidas para evitar a evaporação. Em primeiro lugar, o meio na câmara possa ser sempre trocados por um sistema de perfusão. Em segundo lugar, o meio pode ser recarregado manualmente. Em terceiro lugar, a câmara pode ser coberta com uma tampa ou uma película flexível. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; fornecimento de oxigênio O polímero de FEP foi desenvolvida para resistir a uma grande variedade de produtos químicos e é, portanto, robusto, quimicamente inerte e não permeável a gases. No caso da montagem de múltiplas camadas de oxigênio só pode penetrar através da ficha de agarose ea interface de agarose a ar, mas continua a ser apresentado, se o suprimento de oxigênio na montagem de múltiplas camadas é severamente menor quando comparado ao de montagem em 1,5% de agarose, sem apoio tubo de polímero. No entanto, tal como montagem em agarose a 1,5% só pode ser utilizada durante cerca de duas horas antes da morfologia do peixe-zebra é afectada montagem multicamadas parece ser a solução superior geral para geração de imagens de longo prazo. Imagiologia estágios iniciais de desenvolvimento Multilayer montagem tornou-se agora a nossa técnica de incorporação padrão para microscopia folha de luz lapso de tempo de peixe-zebra com mais de 24 hpf. Além disso, também usamos os tubos de polímero para imagens de embriões em estágio anteriores. O embryos permanecem nas suas córions e são montados num tubo FEP com um diâmetro interior de 1 mm e cheio com E3. O peixe-zebra pode desenvolver livremente dentro do córion e ainda pode ser trabalhada também por microscopia folha de luz. Perspectiva A montagem da amostra multicamadas apresentado desencadeia o potencial de microscopia folha de luz para a biologia do desenvolvimento em tempo real com peixes-zebra. Ele pode ser facilmente adoptado para outras técnicas de microscopia, tais como a tomografia óptica de projecção (OPT) e outros organismos. Acreditamos que os tubos de FEP tamanho padrão são apenas os primeiros passos para técnicas de montagem da amostra sob medida para necessidades específicas.

Para entender os eventos complexos e interações durante a embriogênese, a pesquisa em biologia do desenvolvimento é cada vez mais se deslocam de microscopia de células e órgãos individuais a imagem in vivo de organismos inteiros. As técnicas tradicionais de microscopia geralmente não oferecem a resolução espacial e temporal para acompanhar os acontecimentos rápidos ao longo de um longo período de tempo e muitas vezes causam efeitos de branqueamento ou phototoxic na amostra 1. Nós e outros encontrados microscopia folha de luz (Figura 1) para ser a técnica ideal para imagem in vivo de peixe-zebra 2-4. A iluminação da amostra, com uma folha fina de luz laser, ortogonal ao eixo de detecção, oferece corte óptico rápido com alta resolução espacial, bem como foto-toxicidade minimizado 5. Ao mesmo tempo, devido a esta disposição óptica única, as técnicas de montagem de amostra tradicionais usando pratos de Petri ou câmaras de cultura não são adequados. Em uma luz típicafolha microscópio três motores de translação e de rotação de um motor de manter a amostra, de tal modo que ele pode ser posicionado com precisão, virou-se e visto a partir de qualquer direcção. Nos últimos espécimes para microscopia folha de luz, muitas vezes têm sido incorporados em 1-2% agarose dentro de um capilar de vidro 6,7. Neste caso, o cilindro de agarose solidificada com o espécime embutidos é extrudido para fora do capilar de vidro para a câmara de amostra preenchida com meio, como a água para a imagiologia. Agarose tem um índice de refração próximo à água e é, portanto, perfeitamente adequado para in vivo microscopia folha de luz que facilita a iluminação e detecção óptica corrigida pela água. A amostra é confinado na agarose rígida e pode ser trabalhada bem durante um curto período de tempo, mas as alterações morfogenéticas e crescimento do embrião são fortemente prejudicada na obtenção de imagens por várias horas 7,8. Embora as soluções para outras aplicações foram desenvolvidas 9, a não-invasiva a longo prazo zebrafish time-lapse<html> potencial de imagem de microscopia folha de luz não pode ser explorada usando o 1,5% de agarose incorporação convencional. Por isso, desenvolvemos uma nova estratégia para a montagem in vivo microscopia folha de luz de embriões de peixes-zebra 10. A amostra é montada nas 0,1% de agarose com 200 mg / L tricaina dentro de um tubo feito de polímero fluorado de Etileno Propileno opticamente clara (FEP). O embrião se desenvolve normalmente incorporado devido à baixa viscosidade do meio. Ao mesmo tempo, o tubo FEP confina a médio e a amostra para a duração da experiência. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado da nova técnica de montagem e apresentar dados que reflete suas vantagens sobre o protocolo convencional. Nós demonstramos que o nosso método de desenvolvimento do peixe-zebra pode ser continuamente trabalhada com uma elevada resolução espacial e temporal, durante um período de mais do que dois dias. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. O princípio da folha microscopia de luz. Um peixe-zebra montado num tubo feito de etileno-propileno fluoretizado (FEP), podem ser traduzidos e rodado através do plano focal da objectiva de detecção. Uma folha fina de luz laser (folha de luz) é projetada pelo objectivo de iluminação para o plano focal da objetiva detecção e ilumina apenas uma secção óptica fina do espécime. O sinal de fluorescência emitida é recolhida pelo objectivo de detecção e gravados num chip de câmara.

<table><tbody><tr><td>Tubos de etileno propileno fluorado (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0,8/1,6 mm de diâmetro interno/externo, outros tamanhos disponíveis</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo Seringa de 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Cânula descartável, romba</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0,8 mm x 22 mm, outros tamanhos disponíveis, o diâmetro externo da cânula deve caber no diâmetro interno do tubo</td></tr> <tr><td>FEPTubo de Centrífuga de Polipropileno de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>fornecido como meio E3 em pó</td></tr><tr><td>(para embriões de peixe-zebra)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de reação de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>fornecido como pó</td></tr><tr><td>Placa</td> <td>de PetriGreiner</td><td>633180</td><td>plástico, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>sinônimos:&nbsp; Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato, MS-222, TS 222, Tricaine metanossulfonato&nbsp;</td></tr><tr><td>Lente objetiva para microscópio 10X/0.3 W</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Câmera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multicamadas de montagem para longo prazo microscopia de luz folha de zebrafish

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Microscopia folha de luz é a técnica de imagem ideal para estudar o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Devido à foto-toxicidade e branqueamento mínimo, que é particularmente adequado para a longo prazo de imagens de lapso de tempo ao longo de muitas horas até vários dias. No entanto, uma estratégia adequada de montagem de amostra é necessário que oferece tanto confinamento e desenvolvimento normal da amostra. Multilayer da montagem, uma nova técnica de incorporação usando agarose de baixa concentração em tubos opticamente clara, agora supera esta limitação e desencadeia o potencial de microscopia folha de luz para a biologia do desenvolvimento em tempo real.

Imagem de vários dias de Zebrafish Vasculature Desenvolvimento Usamos um dpf Tg (kdrl: GFP) 13 peixes-zebra para demonstrar as vantagens da estratégia de montagem de multicamadas para a microscopia de folha de luz a longo prazo. O objectivo é a imagem do desenvolvimento da vasculatura em todo o peixe-zebra ao longo de um período de 2 dias. O embrião do peixe-zebra foi montado em 0,1% de agarose dentro de um tubo de polímero de revestimento de metilcelulose. Aqui, o peixe-zebra não é restrito por meio de montagem e pode desenvolver-se normalmente. Sua cabeça levanta, a cauda se estende e surgimento vascular parece desimpedido (Figura 3). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens de vários dias de desenvolvimento vasculatura peixe-zebra. A vasculatura de um multilateraisyer montado 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebrafish desenvolve sem obstáculos em uma folha de microscópio de luz ao longo de dois dias. A 488 nm folha de luz de laser excitou a fluorescência eo sinal foi detectado usando 10X/0.3 W objetiva e uma câmera EMCCD. Z-stacks foram adquiridas em quatro posições adjacentes a cada 10 minutos e, posteriormente, costurado com Fiji 15. Projecções máximos de intensidade de um subconjunto de pontos de tempo são mostrados. Barra de escala:. 500 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Imagem de início Zebrafish embriogênese Aqui, demonstramos a capacidade de tubos de FEP como um suporte de montagem para microscopia folha de luz da embriogênese zebrafish início durante o primeiro dia após a fertilização. A 8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 embrião de peixe-zebra foi montado com o seu córion intacta dentro de um tubo E3-preenchido com um inner diâmetro de 1 mm. Isso resulta em um leve aperto do córion. Todos os processos de desenvolvimento durante a embriogênese não são afetados pela montagem e pode ser perfeitamente visualizado por microscopia folha de luz. Neste exemplo, trabalhada a amostra ao longo de um curso de 12 horas (Figura 4). As mudanças de forma típicas durante a embriogénese precoce, tais como o aumento da elongação da gema e espessamento do tecido ao longo da linha média, seriam oprimido quando utilizando a montagem tradicional sem córion em 1,5% de agarose. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figura 4 Imagem da embriogênese zebrafish precoce A Tg (H2A: GFP). 14 zebrafish passa por embriogênese. Foi detectado um GFP animado 488 nm folha de luz do laser e do sinal de fluorescênciacom um W objetivo 10X/0.3 e uma câmera EMCCD. Z pilhas de dois ângulos foram adquiridos a cada 3 minutos ao longo de um curso de 12 horas. Projeções de intensidade máxima normalizada de um subconjunto do lapso de tempo são mostrados. Motion blur visível em 19 resultados HPF da contração do embrião durante a aquisição, como foram utilizados sem anestesia. Barra de escala:. 150 fim <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

O objetivo geral deste procedimento é montar um embrião de peixe-zebra para microscopia de folha de luz in vivo de longa duração. Isso é realizado primeiramente limpando um tubo de politetrafluoroetileno, etileno propileno ou FEP e revestindo-o com Metilcelulose. Em seguida, um embrião de peixe-zebra de interesse é revestido.Em seguida, o embrião é transferido primeiro para agarose fundida e depois para o tubo FEP revestido. Por fim, a extremidade inferior do tubo é fechada com uma tampa de aros e a orientação do embrião montado é cuidadosamente verificada. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram o desenvolvimento não perturbado de embriões de peixe-zebra ao longo de vários dias, com alta resolução espacial e temporal, por meio de microscopia de folha de luz in vivo.Bem, a principal vantagem em relação às técnicas existentes é que agora podemos observar embriões de peixes superiores por vários dias, e não apenas por algumas horas. Este método pode fornecer informações valiosas sobre a embriogênese de longo prazo do peixe-zebra utilizando microscopia de folha de luz. Também pode ser aplicado a outros organismos pequenos, como organismos marinhos menores.Ele também pode ser utilizado com outras técnicas de microscopia, como tomografia por projeção óptica, microscopia de campo amplo ou microscopia confocal. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois o protocolo envolve etapas críticas no tempo e a avaliação da posição final do embrião exige alguma experiência. Para preparar um tubo de FEP, primeiro limpe-o lavando repetidamente com hidróxido de sódio um molar. Em seguida, transfira o tubo para um tubo cônico de 50 mililitros contendo hidróxido de sódio 0,5 molar e submeta-o à ultrassonicação por 10 minutos.Transfira o tubo de polímero para uma pequena bacia com água destilada desionizada e enxágue-o. Em seguida, realize uma lavagem com etanol 70% antes de transferi-lo para um tubo de centrífuga novo. Com etanol ultras.Sonicar o tubo durante 10 minutos antes de transferi-lo para uma pequena bacia com água destilada desionizada e lavá-lo novamente. Corte o tubo FEB limpo em pedaços de três centímetros de comprimento e endireite-os, se necessário. Armazene os tubos limpos em um tubo novo de 50 mililitros contendo água destilada desionizada.Prepare a solução estoque de Trica. 3% de Metilcelulose e ambos os Aros 1,5% e 0,1% conforme o protocolo descrito no texto. Derreta o ágar a 1,5% e despeje em uma placa de Petri para formar uma camada com espessura de cerca de dois milímetros.Colete embriões de peixe-zebra no estágio desejado que expressaram positivamente o gene fluorescente de escolha e transfira-os para um novo recipiente com E três sob um estereoscópio. Usando duas pinças finas, recubra cuidadosamente os embriões usando uma pinça para segurar a coriona e a segunda pinça para rasgá-la e removê-la, a fim de realizar o montagem em múltiplas camadas. Com as mãos enluvadas, fixe uma cânula de extremidade romba a uma seringa.Insira cuidadosamente a cânula cerca de três milímetros em uma das extremidades de um pedaço de tubo FEP limpo. Em seguida, mergulhe a extremidade livre do tubo FEP em metilcelulose a 3% e encha o tubo com a solução. Depois, empurre lentamente a seringa para liberar a metilcelulose usando o meio E três, repita os passos de mergulhar e expelir.Enquanto isso, em um bloco térmico, aqueça uma alíquota de 0,1% de aros a 70 graus Celsius. Vortexe o tubo de reação brevemente antes de transferi-lo para um bloco térmico ajustado a 38 graus Celsius. Após o aquecimento, deixe o tubo esfriar brevemente e adicione trica até uma concentração final de 133 a 200 miligramas por litro e vortexe.Novamente, utilizando uma pipeta de vidro de Pasteur, transfira um embrião revestido para o tubo de reação com o aros pré-aquecido, transferindo o mínimo possível de E3. Com o tubo FEP e a seringa acoplada, aspire suavemente uma pequena quantidade de aros antes de aspirar o embrião e preencha completamente o tubo com aros.O embrião deve ser posicionado em uma das extremidades do tubo, com a cabeça voltada para a abertura. Para evitar vazamento do conteúdo, mantenha o tubo em posição horizontal para tampá-lo. Use uma lâmina de barbear para cortá-lo da cânula.Em seguida, mantendo o tubo perpendicular, insira lentamente sua extremidade através de toda a camada de agarose 1,5% e gire-o levemente. Para evitar secagem, mantenha a lâmina montada em um tubo de reação de 1,5 mililitro cheio com meio E3 antes da aquisição de imagens. Verifique se o peixe dentro do tubo FEP está posicionado reto e se sua cabeça está diretamente sobre o tampão para aquisição de imagens.Adicione trica ao meio dentro da câmara de imagem. É mostrado aqui um embrião de peixe-zebra transgênico K-G-R-L-G-F-P, um dia após a fertilização, filmado ao longo de dois dias para observar o desenvolvimento da vasculatura.O peixe-zebra não é restrito pelo meio de montagem e pode se desenvolver normalmente. Por exemplo, sua cabeça se levanta. A cauda se estende e a brotação vascular aparece sem impedimentos.Essa técnica pode ser realizada em 10 minutos se for executada corretamente e todos os materiais estiverem prontamente disponíveis. Lembre-se de realizar todas as etapas principais sem qualquer atraso. Mantenha todas as soluções limpas, pois a sujeira pode prejudicar a qualidade final da imagem.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve a preparação de amostras para microscopia de fluorescência de folha de luz. Ele também demonstra um método para montar embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo, o que permite a gravação de filmes de longo lapso de tempo de embriões vivos em condições quase fisiológicas.

Preparação de amostras de microscopia de folha de luz: montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

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