Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish
27 de fevereiro de 2014
O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.
O objetivo geral deste procedimento é montar um embrião de peixe-zebra para microscopia de folha de luz in vivo de longa duração. Isso é realizado primeiramente limpando um tubo de politetrafluoroetileno, etileno propileno ou FEP e revestindo-o com Metilcelulose. Em seguida, um embrião de peixe-zebra de interesse é revestido.
Em seguida, o embrião é transferido primeiro para agarose fundida e depois para o tubo FEP revestido. Por fim, a extremidade inferior do tubo é fechada com uma tampa de aros e a orientação do embrião montado é cuidadosamente verificada. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram o desenvolvimento não perturbado de embriões de peixe-zebra ao longo de vários dias, com alta resolução espacial e temporal, por meio de microscopia de folha de luz in vivo.
Bem, a principal vantagem em relação às técnicas existentes é que agora podemos observar embriões de peixes superiores por vários dias, e não apenas por algumas horas. Este método pode fornecer informações valiosas sobre a embriogênese de longo prazo do peixe-zebra utilizando microscopia de folha de luz. Também pode ser aplicado a outros organismos pequenos, como organismos marinhos menores.
Ele também pode ser utilizado com outras técnicas de microscopia, como tomografia por projeção óptica, microscopia de campo amplo ou microscopia confocal. Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois o protocolo envolve etapas críticas no tempo e a avaliação da posição final do embrião exige alguma experiência. Para preparar um tubo de FEP, primeiro limpe-o lavando repetidamente com hidróxido de sódio um molar. Em seguida, transfira o tubo para um tubo cônico de 50 mililitros contendo hidróxido de sódio 0,5 molar e submeta-o à ultrassonicação por 10 minutos.
Transfira o tubo de polímero para uma pequena bacia com água destilada desionizada e enxágue-o. Em seguida, realize uma lavagem com etanol 70% antes de transferi-lo para um tubo de centrífuga novo. Com etanol ultras.
Sonicar o tubo durante 10 minutos antes de transferi-lo para uma pequena bacia com água destilada desionizada e lavá-lo novamente. Corte o tubo FEB limpo em pedaços de três centímetros de comprimento e endireite-os, se necessário. Armazene os tubos limpos em um tubo novo de 50 mililitros contendo água destilada desionizada.
Prepare a solução estoque de Trica. 3% de Metilcelulose e ambos os Aros 1,5% e 0,1% conforme o protocolo descrito no texto. Derreta o ágar a 1,5% e despeje em uma placa de Petri para formar uma camada com espessura de cerca de dois milímetros.
Colete embriões de peixe-zebra no estágio desejado que expressaram positivamente o gene fluorescente de escolha e transfira-os para um novo recipiente com E três sob um estereoscópio. Usando duas pinças finas, recubra cuidadosamente os embriões usando uma pinça para segurar a coriona e a segunda pinça para rasgá-la e removê-la, a fim de realizar o montagem em múltiplas camadas. Com as mãos enluvadas, fixe uma cânula de extremidade romba a uma seringa.
Insira cuidadosamente a cânula cerca de três milímetros em uma das extremidades de um pedaço de tubo FEP limpo. Em seguida, mergulhe a extremidade livre do tubo FEP em metilcelulose a 3% e encha o tubo com a solução. Depois, empurre lentamente a seringa para liberar a metilcelulose usando o meio E três, repita os passos de mergulhar e expelir.
Enquanto isso, em um bloco térmico, aqueça uma alíquota de 0,1% de aros a 70 graus Celsius. Vortexe o tubo de reação brevemente antes de transferi-lo para um bloco térmico ajustado a 38 graus Celsius. Após o aquecimento, deixe o tubo esfriar brevemente e adicione trica até uma concentração final de 133 a 200 miligramas por litro e vortexe.
Novamente, utilizando uma pipeta de vidro de Pasteur, transfira um embrião revestido para o tubo de reação com o aros pré-aquecido, transferindo o mínimo possível de E3. Com o tubo FEP e a seringa acoplada, aspire suavemente uma pequena quantidade de aros antes de aspirar o embrião e preencha completamente o tubo com aros.
O embrião deve ser posicionado em uma das extremidades do tubo, com a cabeça voltada para a abertura. Para evitar vazamento do conteúdo, mantenha o tubo em posição horizontal para tampá-lo. Use uma lâmina de barbear para cortá-lo da cânula.
Em seguida, mantendo o tubo perpendicular, insira lentamente sua extremidade através de toda a camada de agarose 1,5% e gire-o levemente. Para evitar secagem, mantenha a lâmina montada em um tubo de reação de 1,5 mililitro cheio com meio E3 antes da aquisição de imagens. Verifique se o peixe dentro do tubo FEP está posicionado reto e se sua cabeça está diretamente sobre o tampão para aquisição de imagens.
Adicione trica ao meio dentro da câmara de imagem. É mostrado aqui um embrião de peixe-zebra transgênico K-G-R-L-G-F-P, um dia após a fertilização, filmado ao longo de dois dias para observar o desenvolvimento da vasculatura.
O peixe-zebra não é restrito pelo meio de montagem e pode se desenvolver normalmente. Por exemplo, sua cabeça se levanta. A cauda se estende e a brotação vascular aparece sem impedimentos.
Essa técnica pode ser realizada em 10 minutos se for executada corretamente e todos os materiais estiverem prontamente disponíveis. Lembre-se de realizar todas as etapas principais sem qualquer atraso. Mantenha todas as soluções limpas, pois a sujeira pode prejudicar a qualidade final da imagem.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para montagem de embriões de peixe-zebra para microscopia de folha de luz in vivo de longa duração. A técnica permite a observação do desenvolvimento de peixe-zebra ao longo de vários dias com alta resolução espacial e temporal.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- O peixe-zebra é um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento vertebrado.
- Técnicas tradicionais de imagem são limitadas a períodos curtos de observação.
- A microscopia de folha de luz fornece uma maneira não invasiva de observar embriões vivos.
- Imbuir embriões em um meio apropriado é essencial para um imageamento bem-sucedido.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para a imagem de longa duração de embriões de peixe-zebra.
- Aprimorar a compreensão da embriogênese por meio da observação contínua.
- Fornecer informações aplicáveis a outros organismos pequenos.
Métodos Utilizados
- Limpeza e preparação de tubos de FEP para montagem de embriões.
- Revestimento de embriões com metilcelulose e inclusão em agarose.
- Uso de microscopia de folha de luz para capturar processos de desenvolvimento.
- Garantia do posicionamento adequado dos embriões para imagem ideal.
Resultados Principais
- Imagem de longo prazo bem-sucedida de embriões de peixe-zebra ao longo de vários dias.
- Observação de processos de desenvolvimento normais sem perturbação.
- Demonstração do desenvolvimento vascular em peixes-zebra transgênicos.
- O método pode ser adaptado para uso com outras técnicas de microscopia.
Conclusões
- O método desenvolvido permite a observação sem precedentes da embriogênese de peixe-zebra.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam biologia do desenvolvimento.
- Aplicações futuras podem estender-se a outros organismos aquáticos pequenos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem in vivo de longa duração de embriões de peixe-zebra permite a desmistificação mecanicista de vias de desenvolvimento e apoia a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Essa técnica de montagem multicamada fornece um sistema relevante para doenças na observação da embriogênese normal com mínima perturbação, aumentando a confiança preditiva em triagens fenotípicas. Ela posiciona a microscopia de folha de luz como uma ferramenta escalável e reprodutível para avaliação de modelos pré-clínicos e alinhamento de biomarcadores translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da observação em tempo real do desenvolvimento vascular e morfológico em peixes-zebra transgênicos.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a embriogênese ininterrupta por vários dias, reduzindo falsos positivos na análise de vias.
- Valor Preditivo: Aprimora a identificação de compostos promissores ao fornecer leituras quantitativas e longitudinais dos processos de desenvolvimento sob exposição a compostos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Prepara sistemas biológicos validados em tubos FEP opticamente claros para triagem de compostos posteriores, com posicionamento consistente de embriões.
- Reprodutibilidade: Padroniza a preparação das amostras utilizando agarose de baixa concentração e revestimento de metilcelulose, minimizando a variabilidade entre réplicas.
- Escalabilidade: Permite configurações de imagem multiplexadas devido ao protocolo rápido de montagem em 10 minutos e compatibilidade com fluxos de trabalho de microscopia automatizados.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para Doenças: Fornece um modelo baseado em peixe-zebra para estudar vias de desenvolvimento conservadas aplicáveis aos mecanismos de doenças humanas.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas e pesquisas pré-clínicas ao permitir a observação da organogênese normal, apoiando a validação de biomarcadores in vivo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Facilita critérios de avançar/não avançar ao revelar toxicidade no desenvolvimento ou interrupção de vias por meio de imagens longitudinais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, apoiando ciclos iterativos de projetar-fabricar-testar-analisar na pesquisa de estágio inicial.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre função gênica e atividade de vias por meio de imagem temporal de alta resolução, não invasiva, de embriões em desenvolvimento.
- Triagem: Fornece dados fenotípicos quantitativos e com resolução espacial adequados para campanhas de triagem de alto conteúdo que exigem pontos finais relacionados ao desenvolvimento.
- Análises: Gera resultados temporais e morfológicos que permitem comparação estatística entre condições controle e tratadas ao longo de diferentes pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao manter o desenvolvimento fisiológico, permitindo a extrapolação dos achados para modelos de vertebrados superiores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de montagem reutilizável, adaptável a múltiplas modalidades de microscopia e sistemas modelo, reduzindo o esforço de revalidação entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da observação direta de fenótipos de desenvolvimento.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade entre laboratórios por meio de etapas definidas de preparação, revestimento e inclusão de tubos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de comprometimentos no desenvolvimento, reduzindo o risco de falhas em fases avançadas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis longitudinais de desenvolvimento em um contexto de organismo inteiro.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manejo de peixes-zebra, estadiamento de embriões e microscopia de fluorescência para garantir o posicionamento e a orientação adequados.
- Depende do acesso a sistemas de microscopia de folha de luz e equipamentos auxiliares para limpeza de tubos, sonicação e preparação de soluções.
- Necessita padronização entre equipes quanto às concentrações das soluções (por exemplo, metilcelulose, agarose, Aros) e aos protocolos de preparação dos tubos, a fim de manter a consistência das imagens.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o método para outros organismos pequenos, incluindo ajustes no diâmetro dos tubos e na viscosidade da matriz de inclusão.
- É limitado pelos requisitos de transparência óptica do tubo de montagem e pela necessidade de evitar contaminação por partículas, que poderia comprometer a qualidade da imagem em aquisições prolongadas.
