Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a dinâmica do crescimento de inclusões clamidiais em células vivas. Isso é realizado primeiramente gerando células hospedeiras fluorescentes que expressem de forma estável uma proteína fluorescente, como GFP, em seu citoplasma. Em seguida, as células hospedeiras são infectadas com clamídia e incubadas.

Em seguida, as células infectadas são visualizadas por microscopia de fluorescência em tempo real. Por fim, as características das inclusões de clamídia são quantificadas por meio de software de análise microscópica; a microscopia de fluorescência em tempo real é utilizada, em última instância, para visualizar inclusões clamidiais dentro da célula hospedeira e para medir parâmetros biológicos das inclusões, obtendo-se resultados quantitativos. As principais vantagens dessa técnica em relação a métodos existentes, como a enumeração baseada em anticorpos, são que essa estratégia de imagem reversa pode ser usada em células vivas e também em conjunto com outras marcas fluorescentes para quantificar a dinâmica de inclusões de todas as espécies de clamídia.

Além disso, ao contrário dos métodos convencionais que rotulam bactérias dentro das células, esta abordagem ilumina a membrana do inclusão em células vivas e, portanto, pode revelar importantes propriedades dinâmicas deste compartimento que contém o patógeno. Após gerar células HeLa fluorescentes, de acordo com o protocolo descrito, plaque as células HeLa GFP em um recipiente de cultura desejado, como placas com fundo de vidro para imagens de alta resolução, placas de 4 a 24 poços para determinação de IFU e triagem em múltiplos poços. Descongele um tubo congelado contendo C. trachomatis, ou qualquer outra linhagem de clamídia desejada, em gelo e dilua em HBSS na multiplicidade de infecção desejada. Para realizar uma infecção estática com C. trachomatis, LGV L2 434/Bu, aspire o meio dos poços e use HBSS para lavar as células HeLa GFP.

Adicione bactérias diluídas aos poços e incube a 25 graus Celsius por duas horas, aspire as células e lave com HBSS. Em seguida, após adicionar o meio de crescimento, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono para realizar uma infecção auxiliada por centrifugação com crich ao sorovar D ou qualquer outra linhagem de clamídia. Use HBSS para lavar as células GFP hela e adicione bactérias diluídas às células.

Em seguida, coloque a placa de células infectadas em um suporte de placa multipoços de um rotor de balde oscilante em uma centrífuga de bancada. Centrifugue as células a 900 vezes G e 25 graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque os frascos de cultura em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora dentro de uma cabine de segurança biológica, aspire o meio, lave as células duas vezes com HBSS e adicione o meio de crescimento.

Incube o recipiente com células infectadas a 37 graus Celsius. Para visualizar inclusões de clamídia, remova as células HeLa GFP infectadas com clamídia do incubador de dióxido de carbono e use RPMI sem vermelho de fenol e 5% de FBS para substituir o meio. Coloque o recipiente ou placa de múltiplos poços em um microscópio de fluorescência invertido com uma objetiva de imersão em óleo de 20x ou maior. Utilizando um software de imagem, identifique as células HeLa GFP infectadas com clamídia que aparecem como células verdes contendo grandes buracos pretos.

Na caixa de diálogo de configuração da aquisição, configure o software para adquirir o canal verde e qualquer outro canal adicionado na amostra. Use o botão capturar/gravar para adquirir a imagem nos momentos desejados após a infecção. Remova as células HeLa GFP infectadas com clamídia do incubador e coloque a placa em um microscópio de fluorescência invertido.

Foque nas regiões médias dos planos das células, onde as inclusões apresentam diâmetro e rendimento máximos. Adquira imagens com bordas nítidas em pelo menos 10 campos por poço. Normalmente, os poços representam réplicas ou variáveis experimentais.

Para localizar as células GFP hela na guia de medições, utilize o comando encontrar objetos e selecione o canal verde. Ajuste a intensidade de limiar com base nas intensidades relativas das células. Conte manualmente o número de inclusões ou compartimentos escuros e as células GFP hela a olho nu ou utilize algoritmos de software de imagem para identificar e contar automaticamente as inclusões.

Filtre os objetos selecionados mantendo apenas aqueles maiores que cinco micrômetros quadrados. Refira-se a esta como população um. Usando esta população, aplique o comando preencher os orifícios nos objetos como entrada; esta etapa gera a população dois.

Subtraia a população um da população dois para obter inclusões positivas para clamídia designadas como população três. Use o comando filtrar população para aplicar um filtro de tamanho à população três. Por exemplo, para manter objetos maiores que 25 micrômetros quadrados em inclusões em células infectadas por 24 horas ou mais, em tempos precoces de infecção, defina o filtro de tamanho para manter objetos maiores que quatro micrômetros quadrados.

Como essas inclusões são muito menores, o filtro de tamanho resulta em uma população de objetos designados como inclusões. Utilize o software de imagem para calcular dados quantitativos a partir das imagens, como número de inclusões, tamanho da inclusão e circunferência da inclusão. Após infecção com clamídia, as inclusões são facilmente visíveis como pontos pretos e as células hospedeiras ou a proteína fluorescente expressa pela clamídia dentro das células hospedeiras, e sua nitidez pode ser explorada para identificação automatizada em diversos campos de visão e/ou tratamentos.

Como demonstrado neste gráfico, uma das principais aplicações é a determinação de unidades formadoras de inclusão de clamídia em células vivas infectadas, o que elimina a necessidade de procedimentos de imunofluorescência, que são demorados e onerosos. Outro aspecto fundamental desta abordagem de imagem é que ela pode ser facilmente aplicada a qualquer espécie ou linhagem de clamídia. Neste exemplo, foi realizada uma análise de curso temporal de células HeLa GFP infectadas com uma das quatro espécies ou linhagens de clamídia, para cada uma dessas espécies e linhagens.

As inclusões foram marcadas e analisadas para calcular sua área média, comprimento do perímetro e número por célula nos momentos indicados. Esses atributos fornecem informações importantes sobre a biologia das inclusões clamidiais, incluindo como elas interagem com a célula hospedeira. É apresentado aqui um vídeo de células HeLa mCherry infectadas com GFPC, Tracom L dois, composto por imagens de lapso de tempo obtidas em intervalos de cinco minutos durante 125 minutos, iniciando 48 horas após a infecção.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar esta técnica de imagem reversa não apenas para visualizar inclusões clamidiais, mas também para quantificar a dinâmica das inclusões, como área da inclusão, perímetro e número de inclusões por célula. Esta técnica é economicamente eficaz em comparação com técnicas de visualização mais tradicionais e funciona com todas as espécies e cepas de Chlamydia.