Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar Chlamydia Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a dinâmica de crescimento da inclusão de clamídia em células vivas. Isso é feito primeiro gerando células hospedeiras fluorescentes que expressam de forma estável uma proteína fluorescente como a GFP em seu citoplasma. Em seguida, as células hospedeiras são infectadas com clamídia e podem incubar.

Em seguida, as células infectadas são visualizadas por microscopia de fluorescência ao vivo. Finalmente, as características de inclusão de clamídia são quantificadas por meio de software de análise microscópica, em última análise, a microscopia de fluorescência ao vivo é usada para visualizar inclusões de clamídia dentro da célula hospedeira e para medir parâmetros biológicos de inclusões para resultados quantitativos. As principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a enumeração baseada em anticorpos, são que essa estratégia de imagem reversa pode ser usada em células vivas e também em colaboração com outros marcadores fluorescentes para quantificar a dinâmica de inclusão de todas as espécies de clamídia.

Além disso, ao contrário dos métodos rotineiros que rotulam bactérias nas células, essa abordagem ilumina a membrana de inclusão nas células vivas e pode, portanto, revelar importantes propriedades dinâmicas desse compartimento contendo patógenos. Depois de gerar células helicoidais fluorescentes, de acordo com a placa de protocolo de texto, as células GFP Hela em um vaso de cultura desejado, como placas de fundo de vidro para imagens de alta resolução 4 placas de 24 poços para determinação de IFU e triagem de vários poços, descongelam um tubo congelado contendo crich cotus ou qualquer outra cepa de clamídia desejada no gelo e diluem em HBSS até a multiplicidade desejada de infecção. Para realizar uma infecção estática com Crich Cotus, LGV zero VL dois aspiram o meio dos poços e usam HBSS para lavar as células GFP hela.

Adicione bactérias diluídas aos poços e incube a 25 graus Celsius por duas horas, aspire as células e lave com HBSS. Em seguida, depois de adicionar o meio de crescimento, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono para realizar uma infecção auxiliada por centrifugação com crich ao sorovar D ou qualquer outra cepa de clamídia. Use HBSS para lavar as células GFP hela e adicionar bactérias diluídas às células.

Em seguida, coloque o prato de células infectadas em um suporte de placa de vários poços de um rotor de balde oscilante em uma centrífuga de bancada. Centrifugue as células a 900 vezes G e 25 graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque os vasos de cultura em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora em um gabinete de biossegurança, aspire as células, lave duas vezes com HBSS e adicione meio de crescimento.

Incube o prato de células infectadas a 37 graus Celsius. Para visualizar inclusões de clamídia, remova as células GFP hela infectadas com clamídia da incubadora de dióxido de carbono e use RPMI sem vermelho de fenol e 5% FBS Para substituir o meio, coloque o prato ou placa de vários poços em um microscópio de fluorescência invertida com uma objetiva de óleo de 20 x ou superior. Usando um software de imagem, identifique células GFP hela infectadas por clamídia que aparecem como células verdes contendo grandes buracos negros.

Na caixa de diálogo de configuração de aquisição, configure o software para adquirir o canal verde e qualquer outro canal adicionado na amostra. Use o botão de gravação de barra de captura para adquirir a imagem nos momentos desejados. Pós-infecção. Remova as células GFP hela infectadas com clamídia da incubadora e coloque o prato em um microscópio de fluorescência inverter.

Concentre-se nas planícies médias das células, onde as inclusões estão em seu diâmetro e rendimento máximos. As bordas nítidas adquirem imagens em pelo menos 10 campos por poço. Os poços normalmente representam réplicas ou variáveis experimentais.

Para localizar células GFP hela na guia de medidas, use o comando localizar objetos e selecione o canal verde. Ajuste a intensidade do limite com base nas intensidades relativas das células. Conte manualmente o número de inclusões ou compartimentos pretos e células GFP hela a olho nu ou use algoritmos de software de imagem para identificar e contar automaticamente as inclusões.

Filtre os objetos selecionados mantendo apenas aqueles com mais de cinco micrômetros quadrados. Refira-se a isso como população um. Usando essa população, aplique o comando preencher buracos em objetos como a entrada que esta etapa gera a população dois.

Subtraia a população um da população dois para produzir inclusões de clamídia marcadas positivamente, designadas como população três. Use o comando filter population para aplicar um filtro de tamanho à população três. Por exemplo, manter objetos maiores que 25 micrômetros quadrados para inclusões em células, infectados por 24 horas ou mais para tempos de infecção precoces, defina o filtro de tamanho para manter objetos maiores que quatro micrômetros quadrados.

Como essas inclusões são muito menores, o filtro de tamanho resulta em uma população de objetos designados como inclusões. Use o software de imagem para calcular dados quantitativos das imagens, como número de inclusão, inclusão, tamanho e inclusão. A circunferência após a infecção com inclusões de clamídia é facilmente visível como manchas pretas e as células hospedeiras ou proteína fluorescente que expressam clamídia dentro das células hospedeiras, e sua clareza pode ser explorada para identificação automatizada em vários campos de visão e/ou tratamentos.

Conforme demonstrado neste gráfico, uma das principais aplicações é a determinação de unidades formadoras de inclusão de clamídia em células vivas infectadas, o que evita a necessidade de procedimentos de imunofluorescência, que são demorados e caros. Outra característica importante dessa abordagem de imagem é que ela pode ser facilmente aplicada a qualquer espécie ou cepa de clamídia. Neste exemplo, uma análise de curso de tempo de células GFP hela infectadas com uma das quatro espécies ou cepas de clamídia foi realizada para cada uma dessas espécies e cepas.

As inclusões foram marcadas e analisadas para calcular sua área média, comprimento do perímetro e número por célula nos horários indicados. Esses atributos fornecem informações importantes sobre a biologia das inclusões de clamídia, incluindo como elas interagem com a célula hospedeira. Aqui é mostrado um vídeo de células m cherry hela infectadas com GFPC, Tracom L dois composto de imagens de lapso de tempo tiradas em intervalos de cinco minutos por 125 minutos, começando em 48 horas após a infecção.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar essa técnica de imagem reversa não apenas para visualizar inclusões de clamídia, mas também para quantificar a dinâmica de inclusão, como perímetro da área de inclusão e número de inclusões por célula. Essa técnica é econômica em comparação com as técnicas de visualização mais tradicionais e funciona com todas as espécies e cepas de clamídia.