Name: Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar Chlamydia Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar a dinâmica de crescimento de inclusões de Chlamydia em células vivas usando proteínas fluorescentes. Este método permite análise em tempo real da infectividade bacteriana.

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Os autores agradecem a Ian Clarke e P. Scott Hefty pelos plasmídeos pGFP-SW2 e pASK-GFP-mKate2-L2, respectivamente. Agradecemos a Paul Miller pela assistência técnica e a Richard Stephens por outros recursos. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant AI095603 (KH).

1. Geração de linhas celulares hospedeiras fluorescente <ol><li> Dia 1. Placa células 293T (ou outra linha de empacotamento retroviral) em placas de 6 poços a 2 x 10 6 células / poço, para ser ~ 75% confluentes no dia seguinte. Se desejado, placa de poços duplicados para cada um retrovírus para ser utilizado. </li><li> Dia 2. células Aspirar e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina). Transfectar células com 5-8 ug de cada vector retroviral (contendo GFP) e vector de embalagem (por exemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 ou reagente semelhante, e seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Incubar as células com ADN de 4-6 h num banho a 37 ° C incubadora de CO 2, e subsequentemente substituir meio com 1 ml de meio de crescimento. </li><li> Incubar as células durante 48 h em 37 ° C incubadora de CO 2. </li><li> Dia 3. Placa células alvo (por exemplo., HeLa) em placas de 6 poços a uma densidade aproximada de 5 a 10 células / poço, para ser ~ 50% confluentes apróximo dia. Verifique transfecção positiva em células 293T por monitorização de fluorescência de GFP em um microscópio invertido. </li><li> Dia 4. Recolher as células sobrenadantes 293T usando uma pipeta e filtrar o sobrenadante através de um filtro de celulose de 0,45 um seringa de etilo contendo retrovírus. </li><li> Remova o meio a partir de células HeLa e adicionar 0,5 ml de meio de crescimento contendo 16 ug / ml de polibreno. Adicionar ~ 0,5 ml de retrovírus filtrado às células gota a gota, e incuba-se as células num banho a 37 ° C incubadora de CO 2 durante 24 horas. Armazenar quaisquer retrovírus restantes (isto é, a partir do duplicar poço) a 4 ° C. </li><li> Dia 5. Se poços duplicados foram feitas para gerar retrovírus extra, repita o passo 1.7 para infectar em série com os restantes partículas retrovirais. </li><li> Dia 6. Passagem transfectadas células HeLa 1: 1 num prato contendo selecção de antibiótico 10 cm (por exemplo, 500 ug / ml de neomicina). </li><li> Aguarde tempo suficiente para que as células transduzidas para voltar a crescer na presença de selecção antibiotlc, após o qual as células podem ser propagadas por técnicas padrão com uma concentração mais baixa de antibiótico de selecção (por exemplo., 200 ug / ml de neomicina). Nota: As células podem também ser seleccionadas por clonagem de brilho ideal neste momento, se necessário. </li></ol> 2. Geração de-expressando GFP Chlamydia trachomatis <ol><li> Prepare 2x tampão de CaCl2 (20 mM de Tris pH 7,4, 100 mM CaCl2) e tampão 4SP (0,4 M de sacarose, 16 mM de Na 2 HPO 4). </li><li> Dia 1. Descongele congelados C. estoque trachomatis no gelo e diluir imediatamente 10 bactérias ul em 50 ul 2x CaCl2 buffer. Adiciona-se 3 ug de ADN de plasmídeo (por exemplo., PASK-GFP-mKate2-L2), misturar bem e incubar durante 30 min a 25 ° C. </li><li> Durante esta etapa, preparar células hospedeiras por trypsinizing um frasco T-75 de células McCoy em um tubo de centrífuga. Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Resuspend sedimento de células num volume apropriado de tampão 1x CaCl 2 para dar uma concentração final de 4 x 10 7 células / ml. </li><li> Após a incubação de 30 minutos (a partir do passo 2.2), adicionar 100 ul de células McCoy preparadas para transformação tubo de mistura (volume total de 200 uL) e incubar 20 min a 25 ° C. Adicionar 100 ul desta mistura de células transformadas para um único poço de uma placa de 6 poços e sobreposição com 2 ml de meio de crescimento. Incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 2 dias. </li><li> Dia 3. lise de células infectadas com C. McCoy trachomatis, substituindo meio com 1 ml de dH2O e raspar as células com uma inclinação de 1.000 ul pipeta de ponta. Adicione 1 ml de tampão 4SP e passar a suspensão através de uma agulha de 27,5 G ~ 5 vezes para a lise celular eficiente e liberação de C. trachomatis. </li><li> Transferir 2 ml do lisado celular contendo C. trachomatis para um frasco T-75 contendo uma monocamada confluente de recém-banhado McCcélulas oy; adicionar 8 mL de DMEM (sem FBS) e incubar durante 2 horas a 25 ° C para permitir C. trachomatis para aderir às células. </li><li> Aspirar as células e adicionar meio de crescimento fresco, suplementado com 10 U / ml de penicilina G e 1 ug / ml de ciclo-heximida. Incubar o balão durante 48 h numa incubadora a 37 ° C, CO 2. </li><li> Dia 4. Verifique por microscopia de luz que as células são infectadas e inclusões contêm Chlamydia aberrante. Identificar inclusões como vacúolos brilhantes em um microscópio de luz padrão e organismos Chlamydia aberrantes como objetos em forma de anel dentro inclusões que são maiores que 2 mm de diâmetro. </li><li> Dia 5. Lise de cultura por meio de substituição com 2 ml de dH2O e raspar as células numa suspensão. Adicionar 2 ml de tampão 4SP e passar a suspensão através de uma agulha de 27,5 G ~ 5 vezes. </li><li> Utilizar 2 ml de lisado celular para infectar uma monocamada fresca de células McCoy em um único poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células com lisado durante 2 horas a 25 ° C, aspirado e adicionar crescimento frescomeio contendo penicilina G e ciclo-heximida. </li><li> Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C de CO2 durante 3-5 dias, dependendo do estado de saúde geral das células. </li><li> Repita os passos 2.9-2.10 uma ou mais vezes, conforme necessário, culturas Passaging em poços frescas em uma placa de 6 poços até inclusões normais que procuram (desprovidos de corpos aberrantes) têm surgido. Neste momento usar um microscópio de fluorescência invertido para verificar se C. trachomatis expressar mKate2 (vermelho). </li><li> Intensificar as culturas infectadas para geração de stocks por clamídia título elevado, por exemplo colhendo transformantes Chlamydia partir de células de McCoy ou HeLa infectadas cultivadas em frascos T-150. </li></ol> 3. infectar as células com Chlamydia <ol><li> Placa células GFP-HeLa no recipiente de cultura desejada, por exemplo pratos com fundo de vidro ou lâminas de câmara para a imagem latente de alta resolução, ou placas de 24 poços para determinação IFU e triagem com vários poços. </li><li> Descongele frozen tubo contendo C. trachomatis, C. muridarum, ou C. pneumoniae em gelo e diluído em HBSS a desejada multiplicidade de infecção (MOI), por exemplo MOI = 1. </li><li> Realizar infecções estáticos ou auxiliado por centrifugação, com base na estirpe de Chlamydia em particular que irá ser utilizado. <ol><li> Para as infecções com C. trachomatis serovar L2 LGV ou C. muridarum, lavar as células GFP-HeLa com HBSS e incubar com bactérias diluídas durante 2 horas a 25 ° C. Aspirar e lavar as células com HBSS, e incuba-se as células em meio de crescimento com 37 ° C incubadora de CO 2. </li><li> Para as infecções com C. trachomatis serovar D ou C. pneumoniae, lavar as células GFP-HeLa com HBSS e adicionar bactérias diluídas para as células. Coloque placa com múltiplas cavidades ou prato fundo de vidro (fixo por fita em uma placa da tampa com vários poços) em um suporte de placa com múltiplas cavidades de um anexo de rotor de caçamba móvel em uma centrífuga de bancada. </li><li> Células centrifugar a 900 xg a 25 ° C durante 1 h. </li&gt; <li> Remover os recipientes de cultura a partir de centrifugação e colocar numa incubadora a 37 ° C de CO2 durante 1 hora. </li><li> Aspirar células em uma cabine de segurança biológica, lave as células duas vezes com HBSS, e adicionar meio de crescimento fresco. Células lugar em um C incubadora de CO 2 37 °. </li></ol></li></ol> 4. Ao vivo Visualization celular de clamídia Inclusões <ol><li> Remover Chlamydia infectadas células GFP-HeLa de incubadora de CO 2 e substituir meio com RPMI sem vermelho de fenol + 5% FBS. </li><li> Células montar em um microscópio de fluorescência invertido (Nikon Eclipse Ti-E ou similar) usando uma objectiva 20X ou superior petróleo. </li><li> Usando o software de imagem (Volocity 6 ou similar), o foco em identificar e Chlamydia infectados células GFP-HeLa: verde células que contêm grandes buracos negros (inclusões de clamídia). </li><li> Marque os locais xyz de regiões que contêm células infectados por clamídia de interesse usando software de imagem (Volocity 6 ou semelhante). Realizar isso manualmente &quot;Adicionando Points &#39;enquanto no modo de exibição XY Stage. Deste modo, as coordenadas XYZ são guardadas para cada local marcado. </li><li> Na caixa de diálogo Configuração de Aquisição, configurar o software para adquirir verde (GFP, HeLa citosol) e vermelho (mKate2, C. trachomatis) canais, e em uma taxa de novos quadros por canal a cada 5 min. </li><li> Adquirir a sequência de imagens utilizando a aquisição protocolo estabelecido acima, clicando no botão &quot;Capture / Record&quot;. </li></ol> 5. A quantificação da inclusão parâmetros de crescimento em células vivas <ol><li> Às vezes desejadas pós-infecção (ex., 24, 48 hpi) Chlamydia remover células infectadas GFP-HeLa da incubadora e montar em um microscópio de fluorescência invertido. Nota: Um dos objectivos 20X ou 40X ar com uma NA elevada é melhor adequada para placas de 24 poços, e uma objectiva de 40X óleo é recomendado para lâminas de câmara. Cultivar células em qualquer substrato para este burroay. </li><li> Concentre-se em midplanes de células, onde inclusões estão em seu diâmetro máximo e produzir bordas nítidas. </li><li> Aquisição de imagens para muitos campos em cada poço (pelo menos 10 por poço); poços normalmente representam repetições ou variáveis ​​experimentais. </li><li> Enumerar o número de inclusões manualmente, por olho (inclusões são compartimentos negros em células HeLa-GFP) ou usar algoritmos de software de imagem para identificar e contar automaticamente inclusões. <ol><li> Encontre células GFP-HeLa por intensidade de fluorescência (&#39;encontrar&#39; Objetos de comando) e ajustar a intensidade limiar de fluorescência baseada em intensidades relativas de células. </li><li> Filtro de objetos selecionados usando diretrizes de tamanho de manter somente aqueles superior a 5 m 2. Esta é a população 1 &#39;. </li><li> Aplicar &#39;tapar buracos em objetos&#39; de comando usando &quot;população 1 &#39;como a entrada. Esta etapa gera &#39;população 2&#39;. </li><li> Subtrair &#39;população 1&#39; de &#39;pOPULAÇÃO 2 &#39;para produzir marcado positivamente inclusões de clamídia, designadas por &quot;população 3&#39;. </li><li> Aplicar filtro de tamanho de &#39;população 3&#39; (&#39;Filtro População&#39; comando), por exemplo, tratar de objectos maiores do que 25 um para 2 inclusões nas células infectadas durante 24 horas ou mais. Para tempos de início da infecção, tais como antes de 18 horas, conjunto de filtros de tamanho para manter objectos maiores do que 4 mm 2, uma vez que estas inclusões são muito menores. Tamanho de filtragem resulta numa população de objectos designados como inclusões &#39;&#39;. </li><li> Calcular dados quantitativas de imagens, por exemplo, o número de inclusão, inclusão tamanho e circunferência inclusão, usando software de imagem. </li></ol></li></ol>

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<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós descrevemos a estratégia experimental para a geração de células hospedeiras fluorescentes para visualização em tempo real e análise de inclusões de clamídia. Esta abordagem visualização vacúolo confere a poderosa capacidade de iluminar, controlar e medir quantitativamente as propriedades dinâmicas de inclusões por clamídia entre as populações de células ou em células isoladas ao longo do tempo. Inclusões de clamídia em células proteína marcada fluorescentes são notavelmente bem definido, de ta...

Doenças infecciosas causadas por espécies da bactéria intracelular Chlamydia provocar um grande fardo para a saúde global, incluindo doença sexualmente transmissível, doença inflamatória pélvica, cegueira, pneumonia e possivelmente aterosclerose 1-4. A capacidade de Chlamydia para interagir com a célula hospedeira, a partir de dentro de um vacúolo (denominado a inclusão), constitui um factor determinante para a sua infecção bem sucedida de células e o hospedeiro. A inclusão de um compartimento é patogénico romance que permite o crescimento e clamídia é dinamicamente modificada ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento de 2-3 dias de Chlamydia 5. A natureza intracelular obrigatório de clamídias apresenta inúmeros desafios para a comunidade de pesquisa, em especial para estudar diretamente a biologia única da inclusão. A grande desvantagem tem sido a incapacidade de visualizar de forma eficiente, quer intracelular Chlamydia ou a sua inclusão pela abordagem fluorescentees em células vivas. Uma descoberta recente revelou finalmente os meios de produção de GFP expressando C. trachomatis 6; no entanto, esta constatação não conduziu ainda a rotulagem específica da inclusão. Algumas técnicas têm sido descritas para a rotulagem de bactérias e inclusões de 7,8, mas eles sofrem de deficiências, como a não-especificidade, transitoriedade e susceptibilidade à fotodegradação. Uma descoberta chave do nosso grupo estabeleceu uma nova estratégia para iluminar a inclusão usando GFP expressando células hospedeiras 9. Esta estratégia explora a impermeabilidade racionalmente intrínseca da membrana inclusão a moléculas maiores do que 520 Da 10. Quando as células são manipuladas para expressar estavelmente uma proteína fluorescente cytosolic particular (por exemplo, ou GFP mCherry), inclusões de clamídia são visíveis com uma nitidez notável por sua exclusão completa de fluorescência. Esta estratégia de imagem inversa permite a visualização imediata das inclusões para todos Chlespécies amydia e pode ser facilmente adaptado para a maioria das células hospedeiras de interesse. Como uma demonstração da sua utilidade, este método foi utilizado anteriormente para revelar e definir as vias celulares de saída para Chlamydia spp 9. Aqui, nós ainda demonstrar como esse método é realizado, e pode ser explorado para obter dados quantitativos chave sobre dinâmica de crescimento inclusão. Além disso, pode substituir de forma eficaz para a enumeração métodos baseados em anticorpos dispendiosos e pode ser usado em conjunto com outros marcadores fluorescentes, tais como mKate2-11 expressando Chlamydia. Esta poderosa combinação de ferramentas permite a exploração das propriedades físicas da membrana de clamídia inclusão dentro das células hospedeiras de estar.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m filtros</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 sem vermelho de fenol</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de câmara, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

usando proteínas fluorescentes para visualizar e quantificar<em&gt; chlamydia</em&gt; vacúolo crescimento dynamics em células vivas

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A bactéria intracelular obrigatória Chlamydia provoca um grande fardo para a saúde pública global. C. trachomatis é a principal causa bacteriana de infecção sexualmente transmissível e também a principal causa de cegueira evitável no mundo. Um determinante essencial para a infecção bem-sucedida de células hospedeiras por clamídia é a capacidade da bactéria de manipular a sinalização da célula hospedeira de dentro de um novo compartimento vacuolar chamado inclusão. De dentro da inclusão, a clamídia adquire os nutrientes necessários para seu crescimento de desenvolvimento de 2-3 dias e, além disso, secreta um painel de proteínas efetoras na face citosólica da membrana do vacúolo e no citosol do hospedeiro. Lacunas em nossa compreensão da biologia da clamídia, no entanto, apresentam desafios significativos para visualizar e analisar esse compartimento intracelular. Recentemente, foi descrita uma estratégia de imagem reversa para visualizar a inclusão usando células hospedeiras que expressam GFP. Essa abordagem explora racionalmente a impermeabilidade intrínseca da membrana de inclusão a moléculas grandes, como GFP. Neste trabalho, descrevemos como as células hospedeiras que expressam GFP ou mCherry são geradas para visualização subsequente de inclusões de clamídia. Além disso, este método demonstrou substituir efetivamente os dispendiosos métodos de enumeração baseados em anticorpos, pode ser usado em conjunto com outros rótulos fluorescentes, como a clamídia que expressa GFP, e pode ser explorado para derivar dados quantitativos importantes sobre o crescimento da membrana de inclusão de uma variedade de espécies e cepas de clamídia.

As células de mamífero que expressam as proteínas citosólicas fluorescentes (por exemplo, GFP) pode ser modificado para permitir a iluminação de inclusões de clamídia em células infectadas, culturas vivas. Após a infecção com clamídia, as inclusões são facilmente visíveis como pontos negros nas células hospedeiras (Figura 1). A clareza das inclusões-falta de fluorescência pode ser explorada para a identificação automática de inclusões em numerosos campos de visão e / ou tratam...

Um método baseado em proteína fluorescente de células vivas para iluminar vacúolos celulares (inclusões) contendo clamídia é descrito. Essa estratégia permite a determinação rápida e automatizada da infectividade da clamídia em amostras e pode ser usada para investigar quantitativamente a dinâmica de crescimento da inclusão.

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a dinâmica do crescimento de inclusões clamidiais em células vivas. Isso é realizado primeiramente gerando células hospedeiras fluorescentes que expressem de forma estável uma proteína fluorescente, como GFP, em seu citoplasma. Em seguida, as células hospedeiras são infectadas com clamídia e incubadas.Em seguida, as células infectadas são visualizadas por microscopia de fluorescência em tempo real. Por fim, as características das inclusões de clamídia são quantificadas por meio de software de análise microscópica; a microscopia de fluorescência em tempo real é utilizada, em última instância, para visualizar inclusões clamidiais dentro da célula hospedeira e para medir parâmetros biológicos das inclusões, obtendo-se resultados quantitativos. As principais vantagens dessa técnica em relação a métodos existentes, como a enumeração baseada em anticorpos, são que essa estratégia de imagem reversa pode ser usada em células vivas e também em conjunto com outras marcas fluorescentes para quantificar a dinâmica de inclusões de todas as espécies de clamídia.Além disso, ao contrário dos métodos convencionais que rotulam bactérias dentro das células, esta abordagem ilumina a membrana do inclusão em células vivas e, portanto, pode revelar importantes propriedades dinâmicas deste compartimento que contém o patógeno. Após gerar células HeLa fluorescentes, de acordo com o protocolo descrito, plaque as células HeLa GFP em um recipiente de cultura desejado, como placas com fundo de vidro para imagens de alta resolução, placas de 4 a 24 poços para determinação de IFU e triagem em múltiplos poços. Descongele um tubo congelado contendo C. trachomatis, ou qualquer outra linhagem de clamídia desejada, em gelo e dilua em HBSS na multiplicidade de infecção desejada. Para realizar uma infecção estática com C. trachomatis, LGV L2 434/Bu, aspire o meio dos poços e use HBSS para lavar as células HeLa GFP.Adicione bactérias diluídas aos poços e incube a 25 graus Celsius por duas horas, aspire as células e lave com HBSS. Em seguida, após adicionar o meio de crescimento, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono para realizar uma infecção auxiliada por centrifugação com crich ao sorovar D ou qualquer outra linhagem de clamídia. Use HBSS para lavar as células GFP hela e adicione bactérias diluídas às células.Em seguida, coloque a placa de células infectadas em um suporte de placa multipoços de um rotor de balde oscilante em uma centrífuga de bancada. Centrifugue as células a 900 vezes G e 25 graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque os frascos de cultura em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora dentro de uma cabine de segurança biológica, aspire o meio, lave as células duas vezes com HBSS e adicione o meio de crescimento.Incube o recipiente com células infectadas a 37 graus Celsius. Para visualizar inclusões de clamídia, remova as células HeLa GFP infectadas com clamídia do incubador de dióxido de carbono e use RPMI sem vermelho de fenol e 5% de FBS para substituir o meio. Coloque o recipiente ou placa de múltiplos poços em um microscópio de fluorescência invertido com uma objetiva de imersão em óleo de 20x ou maior. Utilizando um software de imagem, identifique as células HeLa GFP infectadas com clamídia que aparecem como células verdes contendo grandes buracos pretos.Na caixa de diálogo de configuração da aquisição, configure o software para adquirir o canal verde e qualquer outro canal adicionado na amostra. Use o botão capturar/gravar para adquirir a imagem nos momentos desejados após a infecção. Remova as células HeLa GFP infectadas com clamídia do incubador e coloque a placa em um microscópio de fluorescência invertido.Foque nas regiões médias dos planos das células, onde as inclusões apresentam diâmetro e rendimento máximos. Adquira imagens com bordas nítidas em pelo menos 10 campos por poço. Normalmente, os poços representam réplicas ou variáveis experimentais.Para localizar as células GFP hela na guia de medições, utilize o comando encontrar objetos e selecione o canal verde. Ajuste a intensidade de limiar com base nas intensidades relativas das células. Conte manualmente o número de inclusões ou compartimentos escuros e as células GFP hela a olho nu ou utilize algoritmos de software de imagem para identificar e contar automaticamente as inclusões.Filtre os objetos selecionados mantendo apenas aqueles maiores que cinco micrômetros quadrados. Refira-se a esta como população um. Usando esta população, aplique o comando preencher os orifícios nos objetos como entrada; esta etapa gera a população dois.Subtraia a população um da população dois para obter inclusões positivas para clamídia designadas como população três. Use o comando filtrar população para aplicar um filtro de tamanho à população três. Por exemplo, para manter objetos maiores que 25 micrômetros quadrados em inclusões em células infectadas por 24 horas ou mais, em tempos precoces de infecção, defina o filtro de tamanho para manter objetos maiores que quatro micrômetros quadrados.Como essas inclusões são muito menores, o filtro de tamanho resulta em uma população de objetos designados como inclusões. Utilize o software de imagem para calcular dados quantitativos a partir das imagens, como número de inclusões, tamanho da inclusão e circunferência da inclusão. Após infecção com clamídia, as inclusões são facilmente visíveis como pontos pretos e as células hospedeiras ou a proteína fluorescente expressa pela clamídia dentro das células hospedeiras, e sua nitidez pode ser explorada para identificação automatizada em diversos campos de visão e/ou tratamentos.Como demonstrado neste gráfico, uma das principais aplicações é a determinação de unidades formadoras de inclusão de clamídia em células vivas infectadas, o que elimina a necessidade de procedimentos de imunofluorescência, que são demorados e onerosos. Outro aspecto fundamental desta abordagem de imagem é que ela pode ser facilmente aplicada a qualquer espécie ou linhagem de clamídia. Neste exemplo, foi realizada uma análise de curso temporal de células HeLa GFP infectadas com uma das quatro espécies ou linhagens de clamídia, para cada uma dessas espécies e linhagens.As inclusões foram marcadas e analisadas para calcular sua área média, comprimento do perímetro e número por célula nos momentos indicados. Esses atributos fornecem informações importantes sobre a biologia das inclusões clamidiais, incluindo como elas interagem com a célula hospedeira. É apresentado aqui um vídeo de células HeLa mCherry infectadas com GFPC, Tracom L dois, composto por imagens de lapso de tempo obtidas em intervalos de cinco minutos durante 125 minutos, iniciando 48 horas após a infecção.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar esta técnica de imagem reversa não apenas para visualizar inclusões clamidiais, mas também para quantificar a dinâmica das inclusões, como área da inclusão, perímetro e número de inclusões por célula. Esta técnica é economicamente eficaz em comparação com técnicas de visualização mais tradicionais e funciona com todas as espécies e cepas de Chlamydia.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui demonstramos os protocolos para a realização de uma única molécula de microscopia de fluorescência em células vivas de bactérias para habilitar funcionais complexos moleculares a serem detectados, rastreados e quantificados.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Fonte: Chetrit, D., et al. Aplicação de imagens de células vivas e tomografia crioeletrônica para resolver características espaçotemporais do sistema de secreção Dot/ICM da Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra a preparação e a imagem de bactérias patogênicas marcadas com fluorescência. As almofadas de agarose são primeiro preparadas e posicionadas dentro de uma moldura adesiva. Uma suspensão de bactérias geneticamente modificadas que expressam uma proteína...

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Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

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