Name: Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprenda a estudar infecções por Neisseria meningitidis em vasos sanguíneos humanos usando modelo de camundongo humanizado com enxerto de pele. Este método permite observar patologia clínica in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Dumenil, particularmente Silke Silva para a leitura crítica do manuscrito. O departamento de cirurgia no Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin e Dr. Patrick Bruneval, Patologia Departamento de HEGP. O biotério em PARCC, liderada por Elizabeth Huc. Este trabalho foi financiado pelas seguintes agências de subsídios: Marie Curie IEF comunhão não. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant do INSERM, equipamentos CODDIM concessão (Ile de France Região), FRM (Fondation pour la recherche médicale) concessão de equipamentos, o Laboratório IBEID de excelência consórcio, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) concessão &quot; Erros-em-fluxo &quot;. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

1. Riscos e Permissões <ol><li> Comitês de ética locais devem aprovar todos os protocolos de animais. Este protocolo foi conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela legislação francesa e europeia para o cuidado e uso de animais de laboratório (Decrets 87-848, 2001-464, 2001-486 e 2001-131 e Directiva Europeia 2010/63/UE) e aprovado pelo comitê de ética local Comité d&#39;Ethique em Matéria de Experimentação Animale, Universite Paris Descartes, Paris, França. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Para a pele humana, consentimento informado do doente escrito foi obtido e todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais franceses e aprovado pelo comitê de ética local, Comité d&#39;Evaluation de l&#39;INSERM Ethique IRB 00003888 00005881 FWA, Paris, França Opinião: 11-048 . </li><li> N. meningitidis é um patógeno humano potencialmente prejudiciais e todas as precauções necessárias devem ser tomadas ao manusear a organismo. Essas precauções incluem vacinação e trabalhando sob nível de Biossegurança 2 condições. </li></ol> 2. Enxerto de pele <ol><li> Colete de pele humana como perto de enxertia tempo possível. A maioria de pele neste trabalho vem de operações de cirurgia plástica, envolvendo a área abdominal. Outras fontes, como peito, perna e até mesmo o rosto têm sido utilizados com sucesso. </li><li> Preparar a amostra de pele humana com a limpeza da superfície da pele com etanol 70% e deitado-o deitado sobre uma superfície bem limpa, de preferência em uma capela de fluxo. </li><li> Fatia 200-400 mM fatias a partir do topo da pele utilizando uma dermatoma com espessura predefinida. </li><li> Verificar as fatias de pele para a integridade e cortou-las em 2 cm x 2 cm quadrados, em seguida, colocar em PBS (sem catiões divalentes), se enxertando imediatamente ou a 4 ° C em DMEM com 10% de soro durante o armazenamento a curto prazo (3-12 hr ). </li><li> Anestesiar 6-8 semanas de idade, ratinhos SCID.bg (aproximadamente 20 g) com cetamina (100 mg / kg) e Xilazina (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Uma vez que os ratos são anestesiados, para verificar a resposta à dor através da realização de uma pitada do dedo do pé, um método padrão para estabelecer reflexo dor. Aplique gel para os olhos para evitar a secagem da córnea e raspar o lado esquerdo do animal por trás do ombro, em que o enxerto vai ser posicionado. Manter o aquecimento do mouse sobre uma almofada de calor durante todo o procedimento. </li><li> Depois de preparar o mouse para a cirurgia, limpe a área depilada com etanol 70%. </li><li> Aplicar anestésico local topicamente para o local do enxerto (Tronothane) e preparar o local do enxerto, retirando cuidadosamente a camada superficial da pele do rato com um par de tesouras curvas. Tenha cuidado para não interromper a vascularização subjacente. </li><li> Remover a pele numa zona um pouco menor do que a área da fatia de pele humana. </li><li> Retire pele fatia de PBS (ou DMEM) e coloque sobre a cama de enxerto, garantindo lado epidérmico é voltado para cima. Passos 2,8-2,10 deve ser realizado tão rapidamente quanto possível, garantindo o leito de enxerto não seca. </li><li> Alinhe um cantoou borda e correção com cola de tecido. Ajustar cuidadosamente o resto da fatia de pele para a cama de enxerto, a colocação de pequenas quantidades de cola para tecido em torno das bordas. Sempre cortar a pele humana para o tamanho, em vez de fazer a cama enxerto maior. </li><li> Não puxe a pele muito apertado sobre o leito do enxerto, pois a pele do rato é muito flexível. </li><li> Certifique-se que o enxerto é fixado com cola de tecido em cada canto. </li><li> Limpar a área com uma solução de iodo. </li><li> Aplique um Band-Aid com a área da almofada sobre o enxerto. Certifique-se que o Band-Aid é firme, mas não apertado e que a respiração do animal não é afetado. </li><li> Fixe o Band-Aid com fita de vestir. </li><li> Permitir que o animal se recuperar em uma superfície quente. </li><li> Uma vez acordado, devolver o animal para sua gaiola. Os animais são alojados 2-3 por gaiola. </li><li> Verifique regularmente os ratos durante a recuperação para sinais de dor ou sofrimento. 10-14 dias após a enxertia, remova o Band-Aid, tomando cuidado para não perturbar o enxerto. Em nossa experiência de dor pós-operatória é mini-mal. No entanto os animais devem ser monitorados a cada dia, em especial, nos poucos dias seguintes operação. Critérios para a dor ou aflição são os seguintes. <ul><li> Perda de peso mais de 10% </li><li> A aparência física, pele, posição corcunda, olhos </li><li> Taxas de respiração ou cardíacos aumentados </li><li> Movimentos diminuídos ou incomuns. </li><li> Aumento da temperatura corporal </li><li> Paracetamole No caso de serem detectados sinais de dor é administrado por via oral (300 mg / kg, a cada 4 horas). Endpoints Humane são rigorosamente respeitados se a dor persistir. </li></ul></li><li> Se o enxerto parece seca aplicar óleo de bebê a cada 2-3 dias para manter a pele macia. </li><li> O enxerto está pronto para a experimentação 21 dias após enxerto. </li></ol> 3. Infecção <ol><li> O dia antes da infecção, preparar estirpe bacteriana por estrias em ágar GCB com antibióticos apropriados. Crescer durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Preparação Bactérias <ol&gt; <li> Reinoculate bactérias em 5 ml de meio SFM endotélio humano com 10% de soro a uma OD 600 de 0,05. </li><li> Incubar, agitando durante 2 horas na incubadora (37 ° C em 5% de CO 2) com a tampa solta, até que uma densidade bacteriana de cerca de DO600 de 0,1. </li><li> Centrifugar as bactérias por 3 min 15.000 rpm. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender em PBS, depois centrifugar novamente. </li><li> Repita o passo de lavagem (2.2.4-2.2.5) duas vezes. </li><li> Ressuspender sedimento de bactérias em PBS. </li><li> Medida OD600. </li><li> Fazer a cultura de qualquer uma das DO600 de 0,1 (10 8 UFC / ml), ou 1,0 OD 600 (10 9 CFU / ml). Deste concentração conhecida, diluir a 10 7 CFU / mL. Tente preparar bactérias tão perto quanto possível do tempo de injecção. </li></ol></li><li> Ratos <ol><li> Pesar ratinhos. </li><li> Anestesiar os ratos com cetamina (100 mg / kg) e Xilazina (10 mg / kg) injectada ip </li><li> Uma vez adormecido, cParreira que a resposta a dor está ausente por um toe-pitada, manter os ratos quente com uma almofada de calor e colocar pomada para evitar a secagem. </li><li> Dar a cada rato 8 mg de transferrina humana, suspensas em solução salina ou PBS, injectado ip </li><li> Tomar uma pequena gota de sangue a partir da cauda e espalhada sobre uma placa de ágar de sangue para verificar é esterilizada antes da infecção. </li><li> Injetar 100 l 10 7 UFC / ml de cultura bacteriana (10 6 UFC total) por via intravenosa através da veia retro-orbital ou cauda. Medidas de CFU tomadas 5 min pós-injeção são consistentes independentemente do local da injeção. </li><li> Depois de alguns minutos, cortar a extremidade da cauda e espalhar amostra de sangue em placas de agar com antibióticos apropriados, com uma diluição de 10 vezes para estabelecer CFU no sangue imediatamente após a infecção. </li><li> Selar a cauda com cola de tecido. </li><li> Após a injeção, diluir o inóculo bacteriano e espalhada em placas de ágar com os antibióticos apropriados para estabelecer UFC. </li><li> Permitir que os camundongospara se recuperar em uma almofada de calor até que eles estão em alta e em movimento </li><li> Às 6 horas após a infecção consumir uma pequena quantidade de sangue a partir da cauda, ​​diluir e placa para estabelecer CFU em 6 horas. </li><li> Incubar todas as placas de agar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite. </li></ol></li></ol> 4. Sacrifício <ol><li> No momento escolhido de infecção, anestesiar os ratos com cetamina (100 mg / kg) e Xilazina (10 mg / kg) injectada ip </li><li> Uma vez dormindo, manter o aquecimento do mouse com uma almofada de calor. </li><li> Quando o reflexo de dor passou (toe-pitada), corte final de cauda e tirar sangue. </li><li> Espalhe sangue em ágar com antibióticos adequados; diluição 5 mL e 10 mL direta 1:10 a estabelecer UFC. </li><li> Sacrifique o mouse por deslocamento cervical. </li><li> Depois de sacrificar o mouse de acordo com todas as diretrizes institucionais e éticos relevantes, confirmar a morte por falta de batimentos cardíacos. Faça uma incisão na linha média, cortar costelas, e fazer uma incisão no ouvirt. </li><li> Colete o máximo de sangue possível do coração cavidade / caixa e coloque em um tubo estéril. </li><li> Retirar os órgãos (por exemplo, fígado, baço, cérebro) em uma placa estéril. </li><li> Retire o enxerto de pele e uma seção de pele do rato na placa estéril. </li><li> Eliminar o corpo do rato. </li><li> Depois que o sangue coletado foi autorizado a coagular por 15 minutos, centrifugar ele 15 min a 3.000 rpm. </li><li> Remover o plasma do sangue, e armazenar a -80 ° C para análise posterior, por exemplo para a detecção de citocinas por métodos de ELISA ou FACS com base. </li></ol> 5. Counts Órgão UFC <ol><li> Pesar homogeneização tubos contendo 500 mL de PBS antes de cada colheita de amostras de biópsia. </li><li> Tome 4 amostras de biópsia mm de cada tecido, utilizando um soco biópsia estéril. </li><li> Colocar em tubos de homogeneização biópsias pré-pesado, contendo 500 ul de PBS. Homogeneizar amostras de pele com 2 contas mm, use contas menores para outros órgãos. </li><li> Coloque o restante tquestões em 4% de paraformaldeído (PFA) e armazenar a 4 ° C durante a microscopia (ver abaixo). </li><li> Pesar homogeneização tubos contendo as biópsias para estabelecer peso biópsia (para posterior cálculo de UFC / mg de tecido). </li><li> Homogeneizar amostras. <ol><li> Homogeneizar fígado, baço e cérebro, a 6.000 rpm durante 30 segundos. </li><li> Homogeneizar amostras de pele a 6.000 rpm por 30 segundos e repita se necessário. </li></ol></li><li> Espalhe diluições de cada tubo de homogeneização em placas de agar e crescer durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2 para estabelecer contagens de UFC de órgãos. </li></ol> 6. Histologia / imuno-histoquímica <ol><li> Fixação <ol><li> Fixar os tecidos em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C. O passo de fixação pode ser mais longo, se o armazenamento por períodos mais longos colocar os tecidos em 0,25% de PFA. </li><li> Lavar os tecidos em PBS e, em seguida, colocar em solução de sacarose a 20% e regresso a 4 ° C durante a noite ou até que os tecidos se afundaram na solução. </li><li> Lave os tecidos em PBS, cortados e coloque em solução outubro (seja em um molde de tecido ou adere a uma placa de base). </li><li> Congelar rapidamente os tecidos em uma placa de Petri flutuante em nitrogênio líquido. </li><li> Após o congelamento, coloque os tecidos em gelo seco antes da transferência para -80 ° C para armazenamento. </li></ol></li><li> Fatiar <ol><li> Retirar tecidos de -80 ° C e deixar equilibrar a -20 ° C num criostato. </li><li> Tecidos da fatia com uma espessura de cerca de 10-15 mM e colocar em lâminas de microscopia revestidos. </li><li> Loja desliza a -20 ° C até ser necessário. </li></ol></li><li> Coloração <ol><li> Deixar as lâminas voltar à temperatura ambiente. </li><li> Desenhe em torno da fatia no slide com uma caneta hidrofóbica. Espere 5-10 min. </li><li> Rehidratar fatia / lavagem em PBS por 5 min, repetir duas vezes. </li><li> Permeabilizar fatia em 0,1% de Triton em PBS durante 10 min. </li><li> Lavar com PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Bloco em PBS0,1% de Triton a 1% de BSA durante entre 10-60 minutos, dependendo do anticorpo ou mancha a ser utilizado. </li><li> Remover o tampão de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído, conforme necessário, em tampão de bloqueio. Incubar por determinado tempo. (Muitas vezes 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C). </li><li> Lavar com PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Aplicar anticorpo secundário diluído conforme apropriado em tampão Bock; DAPI é normalmente incluído nesta etapa. Incubar por tempo determinado, geralmente 1-2 horas à temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Lavar com PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Monte em desaparecer proteger mídia montagem com uma tampa de vidro e selar com verniz de unhas. </li><li> Imagem lâminas coradas imediatamente ou armazenar a 4 ° C. </li><li> Realize imagem com um microscópio confocal ou fluorescente configurado com filtros / lasers apropriados para fluoróforos usados. </li></ol></li><li> Histologia <ol><li> Deixar as lâminas a serem utilizados para a histologia para voltar à temperatura ambiente. </li><li> Lâminas Mancha usando comotandard protocolo de coloração com hematoxilina / eosina. <ol><li> Colocar as lâminas em porta-lâminas. </li><li> Rack de Transferência com slides entre as soluções na seguinte ordem: </li><li> 2 segundos em água corrente. </li><li> 3 min em solução de hematoxilina filtrada. </li><li> 10 seg em água corrente. </li><li> 10 seg em água destilada. </li><li> 10 seg em etanol a 100%. </li><li> 2 s em eosina filtrada. </li><li> 10 seg em água corrente. </li><li> 10 seg em etanol a 100% </li><li> 2 min em xileno x 3 (banho de I, II, III). </li><li> Transfira imediatamente e adicione algumas gotas de cola de fixação para cada slides, lugar tampa de deslizamento em cima, remova as bolhas de ar, deixe secar por algumas horas. </li><li> Imagem desliza sob um padrão de microscópio de luz branca. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Davis, C. E., Arnold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+meningococcal+endotoxin+in+Meningococcal+purpura%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura.</a> J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).</li>
<li>Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMairey%2C+E+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Brandtzaeg, P., van Deuren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+pathogenesis+of+meningococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification and pathogenesis of meningococcal infections.</a> Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).</li>
<li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).</li>
<li>Hill, W. R., Kinney, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutaneous+lesions+in+acute+meningococcemia%3B+a+clinical+and+pathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study.</a> J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).</li>
<li>Capecchi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+NadA+is+a+new+invasin+which+promotes+bacterial+adhesion+to+and+penetration+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).</li>
<li>Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+of+pathogenic+Neisseriae+elicit+cortical+plaque+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).</li>
<li>Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+property+of+the+type+IV+pilus-associated+component+PilC1+of+pathogenic+Neisseria+is+supported+by+the+conformational+structure+of+the+N-terminal+part+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule.</a> Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).</li>
<li>Taha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+induces+the+expression+of+the+TNF-alpha+gene+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells.</a> Cytokine. 12, 21-25 (2000).</li>
<li>Kirchner, M., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PilC+adhesin+of+the+Neisseria+type+IV+pilus-binding+specificities+and+new+insights+into+the+nature+of+the+host+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor.</a> Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).</li>
<li>Mikaty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li>
<li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46+in+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li>
<li>Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46-independent+binding+of+Neisserial+type+IV+pili+and+the+major+pilus+adhesin%2C+PilC%2C+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+for+transferrin+in+pathogenic+bacteria+are+specific+for+the+host%27s+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein.</a> Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).</li>
<li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).</li>
<li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).</li>
<li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Murray, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cell-mediated+destruction+of+allogeneic+dermal+microvessels+in+a+severe+combined+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).</li>
<li>Nassif, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+of+pilin+regulates+adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).</li>
<li>Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption%3A+resistance+to+complement-mediated+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li>
<li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHo%2C+M+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 192, 1205-1211 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os modelos animais são extremamente importantes para a pesquisa patogênese bacteriana. É impossível imitar totalmente o ambiente in vivo em cultura de células e está se tornando evidente que a interação patógeno-hospedeiro é influenciado por muitos fatores dinâmicos. A especificidade humana de alguns agentes patogénicos clinicamente importantes, tais como N. meningitidis, HIV, HCV, o Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi e tem limitado a utilização de modelos in vivo para estas infecções. No entanto, quando começamos a compreender que medidas infecciosos estão envolvidos na especificidade, modelos humanizados estão sendo desenvolvidos. O protocolo aqui descrito é uma demonstração deste com a introdução de microvasos humanos em ratos, permitindo extensa infecção in vivo com N. meningitidis, resultando em dano vascular e, ocasionalmente, o desenvolvimento de erupções purpúricas. Usando esse modelo,temos sido capazes de definir que as propriedades adesivas da Tfp estão envolvidos na colonização vascular in vivo usando mutantes bacterianos e que a lesão vascular é reduzido na ausência de aderência 18. Anteriormente, circulam produtos bacterianos foram implicados neste danos, mas os nossos resultados sugerem um papel decisivo para a aderência vascular local e colonização. Isso abre novas possibilidades para o desenvolvimento de metas romance de tratamento. Se a adesão de bactérias patogênicas pode ser bloqueada farmacêutico que poderia prevenir o desenvolvimento de lesões dérmicas e levar a melhores resultados para os sobreviventes meningocócica em termos de necrose tecidual, debridamento e amputações. O trabalho demonstrou também a complexidade da infecção e com o envolvimento da resposta imune e da cascata de coagulação. Identificamos sinalização de citocina humana no soro dos camundongos infectados apesar da quantidade relativamente pequena de endotélio humano presente 18.Isto indicou uma resposta significativa de citocinas, juntamente com a infiltração de populações de células imunes de ratinho na área. Os modelos animais pode, naturalmente, nunca replicar totalmente a doença humana e todos os resultados obtida a partir deles deve ser considerada com isso em mente. Por exemplo, neste modelo, o sangue e as células circulantes são de origem em ratinho e não podemos excluir que podem comportar-se de maneira diferente para as células humanas. Uma vantagem desta entanto, como demonstrado na nossa recente publicação 18, é a capacidade de diferenciar de sinalização provenientes do endotélio humano a partir de que as células circulantes rato. O fundo imunocomprometidos dos ratos utilizados neste modelo também permite a transferência alogênico de populações de células do sistema imunológico humano, acrescentando mais um &#39;humanização&#39; aspecto. O fundo dos ratinhos imunocomprometidos podem no entanto mascarar um papel para as células NK, T e B, os quais são todos falta ou defeito neste modelo. O relativamente short prazo (24 horas) utilizado neste modelo refere-se, principalmente, a resposta inata, mas para infecções de longo prazo eo desenvolvimento de imunidade outras opções podem precisar de ser explorado. A pele é um site de infecção importante para N. meningitidis, mas ter uma quantidade relativamente pequena de vasos humanos significa também que extrapolar os dados para uma infecção sistêmica, envolvendo vários órgãos é difícil. Embora este modelo permite o estudo de desenvolvimento da lesão cutânea, passos importantes de infecção meningocócica, tais como epiteliais e sangue-cérebro atravessamento não estão incluídos. O desenvolvimento destes modelos humanizados é necessário endereçar esses outros aspectos da infecção. No entanto, este modelo oferece um grande potencial para vários patógenos específicos humanos, particularmente aquelas voltadas para os vasos sanguíneos.

Sepsis meningocócica é uma infecção do sangue nascido frequentemente fatal, causada pelo patógeno bacteriano Neisseria meningitidis. Pacientes com sepse meningocócica freqüentemente presente com uma erupção petequial ou purpúrica em sua pele que tenha sido previamente associado com a destruição vascular causada por bactérias que circulam e produtos bacterianos 1. Biópsias de pele de pacientes clínicos mostram bactérias associadas com microvasos, muitas vezes preenchendo os vasos 2. Para além da bactéria, trombose extensa, coagulação, e congestão vascular vazamento é visto nas regiões purpúricos 3-5. Este dano vascular pode conduzir a uma extensa necrose da pele e dos tecidos envolventes, resultando em desbridamento e até amputação em sobreviventes de meningococos. Entender como infecção provoca este dano vascular é importante para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento. A maioria das pesquisas sobre sepsis meningocócica foi realizada in vitro emlinhas de células humanas devido à especificidade humana de N. meningitidis. Muitos aspectos da infecção foram estudadas in vitro, incluindo a adesão bacteriana, a resposta da célula hospedeira, assim como a resposta citocina 6-9. Pili de tipo IV (PTF) têm sido implicadas como a principal organelo aderência for N. meningitidis em ambas as células epiteliais e endoteliais 10. Tem também sido demonstrado que a adesão de N. meningitidis às células hospedeiras é tensão de cisalhamento dependente e, portanto, é pensado para ser relacionado com as taxas de fluxo de sangue na microcirculação 11. Isso sugere que as tensões dinâmicas as bactérias enfrentam in vivo são essenciais para a patogênese. No entanto, é muito difícil de modelar o microambiente de pequenos vasos in vitro. O receptor de adesão para Neisseria Tfp é ainda desconhecido e, por conseguinte, as estratégias knock-in para conseguir a aderência bacteriana em um modelo animal não pode ser previsto neste momento. CD46 foi sugerida para ser o receptor Tfp e animais transgénicos foram produzidas para agir como modelos de ratos. No entanto, a infecção nestes animais não leva à infecção extensa ou a erupção desenvolvimento 12,13. Outros modelos animais, que foram descritas para o aspecto de bacteremia de infecção por Neisseria ter em conta a preferência de bactérias para a transferrina humana como fonte de ferro 14,15. Quer completando a transferrina humana ou expressá-lo a partir de um transgene que resulta num aumento da carga bacteriana no fluxo de sangue ao longo de um período de tempo prolongado, mas este modelo não mostra nenhuma aderência bacteriana ou desenvolvimento erupção 16,17. Neste protocolo, descrevemos um modelo humanizado rato em que a pele humana, incluindo a microcirculação cutânea, é transplantado em ratos imunocomprometidos 18,19. Isto resulta em vasos humanos funcionais, perfundidos com a circulação do rato. Combinado com a suplementação da transferrina humana, este modelo responsável por, pelo menos, dois dos aspectos específicos humanos de N. meningitidis, ie endotélio humano e transferrina humana, em um ambiente in vivo. N. meningitidis introduzido por via intravenosa neste modelo aderem especificamente ao endotélio humano, a produção de uma patologia que é semelhante ao que é relatado em pacientes clínicos, incluindo os danos vasculares e desenvolvimento erupção purpúrica 18.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina 500</td><td>Virbac França</td><td></td><td>lote no. VAL4243</td></tr><tr><td>xilazina</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N&deg; FR/8146715 2/1980</td><td>lote nº. KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>Medicamento Autoris&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC base de ágar</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Endotélio humano SFM media</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA lectina - rodamina</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Dermátomo de Mão Sóbria</td><td>Humeca BV, Holanda</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Alojamento de animais</td><td>Innovive</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de lise de preparação rápida M tubos</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD mídia de montagem</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Cola de</td></tr><tr><td>tecido</td> <td>OCTSakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

humanizado mouse modelo para estudar infecções bacterianas segmentação microvasculatura

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis provoca uma sepse grave, freqüentemente fatal quando ele entra na corrente sanguínea humana. A infecção leva a danos dos vasos sanguíneos, resultando em vazamento vascular, o desenvolvimento de erupções purpúricas e eventual necrose tecidual. Estudando a patogénese da infecção foi previamente limitada pela especificidade humana das bactérias, o que torna difícil em modelos in vivo. Neste protocolo, descrevemos um modelo humanizado para esta infecção em que a pele humana, contendo microvasos dérmicas, é enxertado em ratos imunocomprometidos. Estes vasos anastomosam com a circulação do mouse, mantendo suas características humanas. Uma vez introduzida neste modelo, N. meningitidis aderir exclusivamente para os vasos humanos, resultando em grande dano vascular, inflamação e, em alguns casos, o desenvolvimento de erupção purpúrica. Este protocolo descreve os passos do miocárdio, infecção e avaliação deste modelo no context de N. infecção meningitidis. A técnica pode ser aplicada a vários patógenos específicos humanos que infectam a corrente sanguínea.

Contagem de CFU O N. meningitidis tensão usada nesses resultados representativos é N. meningitidis 8013 clone 12, um isolado clínico sorogrupo C, expressando uma classe I SB pilin, Opa -, Opc -, PilC1 + / PilC2 + 20. A cepa foi projetado para expressar a proteína fluorescente verde (GFP) de uma inserção cromossômica 18. Formadoras de colónias contagem de unidades bacterianas são estabelecidas por contagem do número de colónias nas placas de agar e o cálculo ou UFC / ml de sangue ou de CFU / mg de tecido a partir de volumes conhecidos plaqueadas. Contagens de sangue mostraram que 5 minutos após a injecção intravenosa de 10 6 CFU de bactérias, houve uma média de 1,5 x 10 5 CFU / ml em circulação no sangue (Figura 1A). Após 6 horas a contagem média de 4,8 x 10 4 CFU / mL. Por 24 horas as contagens médias foram de 2,4 x 10 4 CFU / ml, mas neste grupo de 10 ratinhos, 5 tinhamnão detectável bactérias circulantes, enquanto os restantes 5 tinham contagens relativamente elevadas (Figura 1A). Contagens de UFC tomadas a partir das amostras de pele demonstram que a maioria dos ratinhos possuindo contagens consideráveis ​​na pele humana, em média 2,1 x 10 4 CFU / mg de tecido em 6 horas e 4,4 x 10 2 CFU / mg de tecido em 24 horas (Figura 1B) . As amostras de pele de rato contralateral não mostrou contagens bacterianas às 24 horas e apenas um número muito baixo de 6 horas, o que demonstra a forte preferência por N. meningitidis aos vasos humanos na pele enxertada (Figura 1B). Em geral, as contagens bacterianas foram muito baixas para não detectáveis ​​em outros órgãos amostrados embora dois animais mostrou que as contagens podem ser atribuídas a contaminação a partir do sangue, como se correlacionam com elevado número de bactérias em circulação (Figura 1C). O modelo pode também ser utilizado para determinar o papel dos factores de virulência in vivo, por exemplo, o tipo IV pili. As estirpes bacterianas com mutações definidas no gene pilD 21, resultando numa estirpe sem Tfp, bem como o gene pilC1 8, em que o proposto Tfp &#39;adesina&#39; foram introduzidas no modelo. Estas mutações resultou em nenhuma adesão bacteriana no enxerto de pele humana, o que confirma o papel crucial Tfp está a desempenhar na adesão in vivo (Figura 1D). Imunohistoquímica / Histologia Nestas experiências utilizou-se N. cepas meningitidis que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) para permitir a detecção de fluorescência, sem a necessidade de coloração secundário. Vasos humanos foram coradas utilizando um marcador de endotélio humano, ou CD31 (PECAM-1) ou a lectina Ulex europaeus aglutinina (UEA) 18,22. A UEA foi conjugado com rodamina permitindo a coloração de uma etapa (Figuras 2A-C). Núcleos celulares podem ser manchared com DAPI para ajudar a identificar as estruturas de tecidos (Figuras 2A-B). Histologia foi realizada utilizando uma coloração hematoxilina / eosina padrão. A fronteira epiderme / dérmica da pele é claramente identificável. A inflamação, trombose vascular e vazamento foram concentradas para vasos perto deste rebordo 24 horas após a infecção (Figura 2D). Trombose era visível em vários pequenos vasos da derme, muitas vezes acompanhados por congestão e inflamação. O vazamento de células vermelhas do sangue para os tecidos pode ser vista, indicando um extenso grau de dano do vaso. A histopatologia da pele enxertada em camundongos não infectados parecia normal, sem inflamação distinguíveis 18. Em cerca de 30% das infecções aderência bacteriana na pele conduz ao desenvolvimento de púrpura macroscopicamente detectável (figuras 2E e 2F). <img alt="Figura 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Contagens de UFC. (A) a contagem bacteriana UFC por ml de sangue em 5 min, 6 horas e 24 horas após a infecção. (B) em bactérias CFU conta a partir de amostras de pele comparando a pele humana (HS) e da pele do rato (MS) em ambas as 6 horas e 24 horas após a infecção. (C) bacteriana UFC conta de outros órgãos tomada 24 horas após a infecção. (D) Comparando contagens de UFC de bactérias a partir de amostras de pele humana e de rato tomadas na infecção pós 24 horas a partir de camundongos infectados com o tipo selvagem N. meningitidis 2C43 mancha (WT), uma estirpe com uma mutação no gene pilD (pilD) ou uma estirpe com uma mutação no gene pilC1 (pilC1). Todos os gráficos são apresentados como dados brutos, com mediana. A figura é uma modificação de Melican et al. 18&quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopia. (A) Projeção de uma pilha confocal mostrando uma microvasos humano corado com lectina UEA (vermelho) perto do dérmica (d) epidérmico (e) fronteira. O vaso está infectado com N. meningitidis (verde) 2 horas após a infecção. (B) Uma fatia óptica e uma projeção fatia (C) mostrando N. infecção microcolônias meningitidis (verde) um vaso humano (UEA - vermelho) dentro de uma infecção da pele enxerto 2 horas post. (D) Hematoxilina / eosina de enxerto de pele humano infectado por 24 horas com N. meningitidis. A epiderme (e), dérmico (d) fronteira é claramente trombose e congestionamento de microvess visível e extensaels (setas) é visto na derme. Inflamação e algum vazamento vascular (ponta de seta) pode também ser identificado. (E) enxerto de pele humana antes da infecção. (F) O mesmo enxerto de pele como (E) 24 horas após a infecção com N. meningitidis mostrando regiões purpúricas (setas). Figuras 2B, 2D, 2E, 2F e são modificadas a partir de Melican et al. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Neisseria meningitidis é um patógeno específico humano que infecta os vasos sanguíneos. Neste protocolo microvasos humanos são introduzidos em um rato por enxertia de pele humana em ratos imunocomprometidos. As bactérias aderem extensivamente para os vasos humanos, levando a danos vasculares e desenvolvimento da erupção purpúrica normalmente observada em casos em humanos.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar os mecanismos pelos quais a bactéria que causa meningite infecta vasos sanguíneos humanos in vivo. Isso é realizado primeiramente enxertando pele humana em um camundongo imunodeficiente, introduzindo assim vasos sanguíneos dérmicos humanos. Na segunda etapa, os camundongos humanizados são infectados com a bactéria. A infecção é então deixada progredir por um período de tempo predeterminado. Na etapa final, são obtidas amostras de sangue e tecido para avaliar o resultado da infecção. Em última análise, uma combinação de histologia, imunofluorescência e análise de sangue e tecido é utilizada para estudar a progressão da infecção nos vasos humanos.A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como modelos de cultura celular ou modelos animais, é que, pela primeira vez, podemos observar a patologia clínica típica que ocorre durante essas infecções. O mais rapidamente possível após a coleta, limpe a superfície da pele humana com etanol 70%, e em seguida coloque-a plana sobre uma superfície bem limpa, preferencialmente sob uma cabine de fluxo laminar. Em seguida, utilize um dermatomo com espessura pré-ajustada para cortar fatias de 200 a 400 micrômetros a partir da parte superior da pele.Verifique a integridade das fatias e, em seguida, corte-as em quadrados de dois por dois centímetros. Coloque os quadrados em PBS e, então, limpe a área raspada de um camundongo beige imunodeficiente severo combinado, anestesiado e com idade entre seis e oito semanas, previamente preparado cirurgicamente, com etanol 70%. Após aplicar anestésico local no local do enxerto, use tesoura curva para remover cuidadosamente a camada superficial da pele do camundongo em uma área ligeiramente menor que os fragmentos do enxerto, tomando cuidado para não perturbar a vasculatura subjacente.Movendo-se rapidamente para evitar o ressecamento do enxerto, coloque uma das fatias de pele humana sobre o leito do enxerto, garantindo que o lado epidérmico esteja voltado para cima. Alinhe a borda do tecido e fixe-o com cola para tecidos. Em seguida, ajuste cuidadosamente o restante da pele humana ao leito do enxerto, aplicando pequenas quantidades de cola para tecidos ao redor de cada borda.Sempre corte a pele humana no tamanho adequado em vez de aumentar o leito do enxerto. Após confirmar que cada canto está fixado, limpe a área com uma solução de iodo e aplique um curativo firmemente, mas sem apertar, com o lado acolchoado sobre o enxerto, tomando cuidado para que a respiração do animal não seja afetada; em seguida, fixe o curativo com fita adesiva e permita que o animal se recupere sobre uma superfície aquecida. Uma vez acordado, devolva o animal à sua gaiola até a injeção bacteriana re-inocular uma cultura de placa de 24 horas em cultura líquida.Na manhã da infecção, quando as bactérias atingirem a concentração desejada, dilua as células até uma concentração de um vezes 10 à sétima unidades formadoras de colônia por mililitro. Em seguida, após a anestesia, confirme a sedação dos camundongos enxertados pelo aperto do dedo do pé e coloque os animais sobre uma placa aquecida.Coloque pomada oftálmica nos olhos do animal e, em seguida, aplique por via ip. Injete cada camundongo com oito miligramas de transferência humana em solução salina. Em seguida, para cada animal, corte a ponta da cauda e espalhe uma pequena gota de sangue da cauda em uma placa de ágar para confirmar que o sangue está estéril antes da infecção.Em seguida, injete 100 microlitros da cultura bacteriana por via intravenosa por injeção retro-orbital. Após alguns minutos, corte novamente a extremidade da cauda e espalhe essa amostra de sangue em placas de ágar frescas também. Para determinar as unidades formadoras de colônia no sangue imediatamente após a infecção, feche a cauda com cola cirúrgica e, em seguida, dilua o inóculo bacteriano e espalhe-o em placas de ágar com os antibióticos apropriados.Para determinar as unidades formadoras de colônia do inóculo seis horas após a infecção, retire outra pequena quantidade de sangue das caudas de cada camundongo e, em seguida, dilua e plaque as gotas de sangue conforme demonstrado anteriormente para determinar as unidades formadoras de colônia no momento de seis horas. Incube então todas as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono durante a noite para realizar a formação de colônias em órgãos. Contagem de unidades dos animais infectados.Inicie fazendo uma incisão mediana em cada camundongo eutanasiado. Em seguida, para cada animal, corte através da costela e faça uma incisão no coração. Utilize uma seringa estéril para retirar o máximo possível de sangue do coração e da cavidade torácica, e transfira-o para tubos estéreis individuais para cada amostra.Em seguida, remova os órgãos de interesse e, então, transfira os enxertos de pele e as seções correspondentes de pele de camundongo para uma placa estéril por animal. Deixe o sangue coletado coagular por 15 minutos e, em seguida, centrifugue-o. Depois, remova o plasma do sangue e armazene-o a menos 80 graus Celsius para análises posteriores.Em seguida, pese os tubos de homogenização contendo 500 microlitros de PBS cada. Depois, utilize um punch de biópsia estéril para coletar amostras de biópsia de quatro milímetros de cada tecido dissecado. Coloque as biópsias individualmente nos tubos de homogenização, com uma esfera de dois milímetros em cada tubo contendo uma amostra de pele.Armazene os tecidos remanescentes em paraformaldeído 4% a quatro graus Celsius para microscopia e pese os tubos de homogeneização para determinar o peso da biópsia. Em seguida, homogeneíze as amostras a 6.000 RPM durante 30 segundos, repetindo a homogeneização da pele até que o homogeneizado fique semelhante a fezes. Por fim, espalhe as suspensões celulares de cada tubo em placas de ágar frescas e cultive as amostras durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.Para determinar as contagens de unidades formadoras de colônias em órgãos nestes resultados representativos, foi utilizada uma linhagem positiva para GFP de N. meningitidis do sorogrupo C.As contagens sanguíneas mostraram que cinco minutos após a injeção intravenosa de um vezes 10 à sexta unidade formadora de colônia de bactérias, havia uma média de 1,5 vezes 10 à quinta unidade formadora de colônia por mililitro circulando no sangue. Após seis horas, as contagens médias eram de 4,8 vezes 10 à quarta unidade formadora de colônia por mililitro, chegando a 24 horas. As contagens médias foram de 2,4 vezes 10 à quarta unidade formadora de colônia por mililitro.Mas neste grupo de 10 camundongos, cinco não tinham bactérias circulantes detectáveis, enquanto os outros cinco apresentavam contagens relativamente altas. Essas barras nestes gráficos mostram os valores medianos das contagens de UFC para cada grupo, obtidas a partir da pele. As amostras mostram que a maioria dos camundongos possui contagens consideráveis na pele humana, com média de 2,1 vezes 10 à quarta UFC por miligrama de tecido após seis horas e 4,4 vezes 10 à segunda UFC por miligrama de tecido após 24 horas.As amostras de pele contralateral de camundongo não exibiram contagens bacterianas após 24 horas e apenas um número muito baixo após seis horas, demonstrando a forte preferência da meningite endógena pelos vasos humanos no tecido enxertado. De modo geral, as contagens bacterianas foram muito baixas ou não detectáveis nos demais órgãos analisados, embora dois animais tenham apresentado contagens, o que pode estar correlacionado com altos números bacterianos circulantes. Este modelo também pode ser utilizado para determinar o papel dos fatores de virulência in vivo.Por exemplo, neste experimento, foram utilizadas cepas bacterianas que careciam de pilus funcional do tipo IV; camundongos infectados com essas cepas mutantes não exibiram adesão bacteriana nos enxertos de pele humana, confirmando o papel crucial que o pilus do tipo IV desempenha na adesão in vivo. Nestas imagens de microscopia confocal de um enxerto de pele, duas horas após a infecção, podem ser observados vasos humanos corados com lectina UEA conjugada à romina. A fronteira entre a epiderme e a derme da pele é claramente identificável, e as bactérias infectantes positivas para GFP e a meningite podem ser claramente observadas ao longo dos vasos.Este enxerto de pele humana corado com hematoxilina e eosina demonstra inflamação e extravasamento vascular, bem como trombose concentrada em vasos próximos à junção dérmico-epidérmica. Vinte e quatro horas após a infecção, em cerca de 30% das infecções, adesões bacterianas na pele levaram ao desenvolvimento de púrpura detectável macroscopicamente. Assim, o desenvolvimento desta técnica abre caminho para pesquisadores envolvidos no estudo das interações entre hospedeiro e patógeno, permitindo investigar os mecanismos da doença no contexto de vasos humanos.

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos uma metodologia para entregar cabo de sangue humano derivado do endotélio formadoras de colônias de células (ECFCs) e derivadas da medula óssea de células-tronco mesenquimais (CTMs), incorporado em um gel de colágeno / fibronectina, por via subcutânea em ratos imunodeficientes. Esta combinação de células / gel gera uma rede vascular humano que se conecta com a vasculatura mouse.

Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Este vídeo demonstra imagens in vivo para estudar a dinâmica de recrutamento de neutrófilos em um local de infecção em um camundongo transgênico imunocomprometido com neutrófilos que expressam GFP. Envolve a injeção de bactérias luminescentes para causar uma infecção. Isso leva ao recrutamento de neutrófilos para o local da infecção, cujo rastreamento é feito por imagem.

Monitoramento da dinâmica de recrutamento de neutrófilos e carga bacteriana no local da infecção em um modelo murino

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo murino de infecção de ferida cutânea. Ao infectar camundongos - modificados para expressar uma proteína fluorescente em neutrófilos - com um Staphylococcus aureus bioluminescente geneticamente modificado - uma bactéria patogênica. A carga bacteriana no local da infecção e a dinâmica de recrutamento de neutrófilos podem ser estudadas usando imagens de animais inteiros.

Um modelo de infecção de feridas na pele murina para estudar a resposta imune contra um patógeno bacteriano

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Os modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a definição de acolhimento e de patógenos mecanismos específicos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação crônica. Aqui nós descrevemos um modelo do rato de infecção oral com o patógeno humano Porphyromonas gingivalis e metodologias detalhe para avaliar a progressão da inflamação em sites locais e sistêmicos.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Aprenda a estudar infecções por Neisseria meningitidis em vasos sanguíneos humanos usando modelo de camundongo humanizado com enxerto de pele. Este método permite observar patologia clínica in vivo.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Explorar mais vídeos