Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

O objetivo geral deste procedimento é estudar os mecanismos pelos quais a bactéria da meningite infecta vasos sanguíneos humanos in vivo. Isso é feito primeiro enxertando pele humana em um camundongo imunodeficiente, introduzindo assim vasos sanguíneos dérmicos humanos. Na segunda etapa, os camundongos humanizados são infectados com a bactéria.

A infecção pode então prosseguir por um período de tempo predeterminado. Na etapa final, são obtidas amostras de sangue e tecido para avaliação do desfecho da infecção. Em última análise, uma combinação de histologia, imunofluorescência e análise de sangue e tecido é usada para estudar a progressão da infecção nos vasos humanos.

A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como modelos de cultura de células ou modelos animais, é que, pela primeira vez, podemos observar a patologia clínica típica que ocorre durante essas infecções. Assim que possível após a coleta, limpe a superfície da pele humana com etanol a 70% e, em seguida, coloque-a sobre uma superfície bem limpa, de preferência sob uma capa de fluxo. Em seguida, use um dermátomo com uma espessura predefinida para cortar fatias de 200 a 400 micrômetros da parte superior da pele.

Verifique a integridade das fatias e, em seguida, corte-as ainda mais em quadrados de dois por dois centímetros. Coloque os quadrados em PBS e, em seguida, limpe a área raspada de um camundongo bege imunodeficiente combinado grave de seis a oito semanas de idade com 70% de etanol. Depois de aplicar anestésico local no local do enxerto, use uma tesoura curva para remover cuidadosamente a camada superficial da pele do camundongo em uma área ligeiramente menor que as peças do enxerto, tomando cuidado para não perturbar a vasculatura subjacente.

Movendo-se rapidamente para evitar o ressecamento do enxerto, coloque uma das fatias de pele humana sobre o leito do enxerto, garantindo que o lado epidérmico esteja voltado para cima. Alinhe a borda do tecido e fixe-o com cola de tecido. Em seguida, encaixe cuidadosamente o resto da pele humana no leito do enxerto, colocando pequenas quantidades de cola de tecido ao redor de cada borda.

Sempre apare a pele humana no tamanho certo, em vez de aumentar o leito do enxerto. Depois de confirmar que cada canto está fixo, limpe a área com uma solução de iodo e aplique um curativo firmemente, mas não firmemente com o lado da almofada sobre o enxerto, tomando cuidado para que a respiração do animal não seja afetada, em seguida, fixe o curativo com fita adesiva e deixe o animal se recuperar em uma superfície quente. Uma vez acordado, retorne o animal à sua gaiola até que a injeção bacteriana reinocular uma cultura noturna em placas em cultura líquida.

Na manhã da infecção, quando a bactéria atinge a concentração desejada, diluir as células para uma vez 10 elevado à sétima colônia formando unidades por mililitro. Então, após a anestesia, confirme a sedação dos camundongos enxertados pelo dedo do pé. Aperte e coloque os animais em uma almofada térmica.

Coloque pomada para os olhos do animal e, em seguida, ip. Injete em cada camundongo oito miligramas de transferência humana em solução salina. Em seguida, para cada animal, corte a ponta da cauda e espalhe uma pequena gota de sangue da cauda em uma placa de ágar para confirmar que o sangue é estéril antes da infecção.

Em seguida, injete 100 microlitros da cultura bacteriana por via intravenosa por injeção retroorbital. Após alguns minutos, corte a ponta da cauda novamente e espalhe essa amostra de sangue em placas de ágar fresco também. Para estabelecer as unidades formadoras de colônias de sangue imediatamente após a infecção, sele a cauda com cola de tecido e, em seguida, dilua o inóculo bacteriano e espalhe-o em placas de ágar com os antibióticos apropriados.

Para estabelecer as unidades formadoras de colônias de inóculo seis horas após a infecção, retire outra pequena quantidade de sangue de cada uma das caudas do camundongo e, em seguida, dilua e coloque as gotas de sangue como acabamos de demonstrar para estabelecer as unidades formadoras de colônias em seis horas. Em seguida, incube todas as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono durante a noite para realizar a formação de colônias de órgãos. Contagem de unidades dos animais infectados.

Comece fazendo uma incisão na linha média em cada camundongo sacrificado. Em seguida, para cada animal, corte a costela e faça uma incisão no coração. Use uma seringa estéril para retirar o máximo de sangue possível do coração e da cavidade torácica e dispense-o em tubos estéreis individuais para cada amostra.

Em seguida, remova os órgãos de interesse e, em seguida, transfira os enxertos de pele e as seções de pele de camundongo que os acompanham para uma placa estéril por animal. Deixe o sangue coletado coagular por 15 minutos e depois gire-o para baixo. Em seguida, remova o plasma do sangue e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para análise posterior.

Em seguida, pese os tubos homogeneizadores contendo 500 microlitros de PBS cada. Em seguida, use um punção de biópsia estéril para coletar amostras de biópsia de quatro milímetros de cada tecido dissecado. Coloque as biópsias individualmente nos tubos de homogeneização com um cordão de dois milímetros em cada tubo contendo uma amostra de pele.

Armazene os tecidos restantes em formaldeído a 4% a quatro graus Celsius para microscopia e pese os tubos de homogeneização para estabelecer o peso da biópsia. Em seguida, homogeneizar as amostras a 6.000 RPM por 30 segundos, repetindo a homogeneização da pele até que o homogeneizado seja cocô. Finalmente, espalhe as pastas celulares de cada tubo em placas de ágar fresco e cultive as culturas durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Para estabelecer as contagens de unidades formadoras de colônias de órgãos nesses resultados representativos. Uma cepa positiva para GFP de meningite N. O sorogrupo C foi usado.

Os hemogramas mostraram que cinco minutos após a injeção intravenosa de uma vez 10 para as seis unidades formadoras de colônias de bactérias, havia uma média de 1,5 vezes 10 para a quinta colônia formando unidades por mililitro circulando no sangue. Após seis horas, as contagens são em média 4,8 vezes 10 elevado à quarta colônia formando unidades por mililitro em 24 horas. As contagens médias foram de 2,4 vezes 10 elevado à quarta colônia formando unidades por mililitro.

Mas neste grupo de 10 camundongos, cinco não tinham bactérias circulantes detectáveis, enquanto os outros cinco tinham contagens relativamente altas. Essas barras nesses gráficos mostram os valores medianos para cada grupo de contagens de UFC retiradas da pele. As amostras mostram que a maioria dos camundongos tem contagens consideráveis na pele humana, com média de 2,1 vezes 10 elevado a quarta UFC por miligrama de tecido em seis horas e 4,4 vezes 10 elevado a segunda UFC por miligrama de tecido em 24 horas.

As amostras de pele de camundongo contralateral não exibiram contagem bacteriana em 24 horas e apenas um número muito baixo em seis horas, demonstrando a forte preferência pela meningite final aos vasos humanos no tecido enxertado. Em geral, as contagens bacterianas foram muito baixas a não detectáveis nos outros órgãos amostrados, embora dois animais tenham apresentado contagens, o que pode estar correlacionado com altos números de bactérias circulantes. Este modelo também pode ser usado para determinar o papel dos fatores de virulência in vivo.

Por exemplo, neste experimento, cepas bacterianas sem pílula funcional tipo quatro I foram usadas em camundongos infectados com essas cepas mutantes não exibiram adesão bacteriana nos enxertos de pele humana, confirmando o papel crucial que a pílula tipo quatro I desempenha na adesão in vivo. Nessas imagens confocais de um enxerto de pele, duas horas após a infecção, podem ser observados vasos humanos corados com lectina UEA conjugada com romina A borda dérmica epidérmica da pele é claramente identificável e a GFP positiva e a meningite infectante podem ser claramente observadas em todos os vasos.

Este enxerto de pele humana corado com h e e demonstra inflamação e vazamentos vasculares, bem como a trombose concentrada em vasos próximos à borda dérmica epidérmica. 24 horas após a infecção em cerca de 30% das infecções, as aderências bacterianas na pele levaram ao desenvolvimento de púrpura detectável macroscopicamente. Portanto, o desenvolvimento dessa técnica abre caminho para que pesquisadores envolvidos em pesquisas e interações com patógenos hospedeiros estudem os mecanismos da doença no contexto de vasos humanos.