Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

O objetivo geral deste procedimento é rotular proteínas na superfície de neurônios vivos e, posteriormente, distinguir proteínas de superfície de proteínas internalizadas usando marcação diferencial de anticorpos secundários. Para fazer isso, os neurônios primários cultivados em vidro de cobertura são incubados com um anticorpo direcionado contra um epítopo de superfície e incubados para permitir a internalização. Após a incubação, um anticorpo secundário marcado com fluorescência é aplicado para identificar proteínas expostas à superfície.

Em seguida, o excesso de anticorpo secundário não marcado é aplicado para bloquear quaisquer complexos de anticorpos primários de proteína de superfície restantes. Os neurônios cultivados são então permanentes e um anticorpo secundário de uma cor diferente é aplicado para detectar a proteína internalizada. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os níveis relativos de proteína internalizada versus proteína de superfície por meio de microscopia de imunofluorescência.

Seguindo este procedimento, um curso de tempo de internalização da proteína de superfície da fonte pode ser obtido, fornecendo informações sobre as taxas de tráfego de proteínas sob manjericão e condições estimuladas. Comece este procedimento preparando lamínulas para lavagem de cultura de células lamínulas de vidro bólico de 18 milímetros revestidas com polilisina preparadas um dia antes, mergulhando-as em três pratos de enxágue separados contendo PBS Adicione 500 microlitros de solução laminada aos poços de uma placa de 12 poços e, em seguida, usando uma pinça, coloque as lamínulas em cada um. Bem, pressione cada lamínula para se certificar de que ela está plana na base do poço incubar por duas horas a 37 graus Celsius, este protocolo pode ser realizado usando córtices de camundongo E 15 ou hipopótamo de rato E 18 Campi.

Nesta demonstração, córtices de camundongo são usados. Coloque os córtices de meia ninhada ou uma ninhada de embriões no gelo em um einor de um mililitro contendo PBS com cálcio e magnésio e coloque no gelo. Em seguida, usando uma micropipeta de um mililitro, remova o PBS do tecido cortical.

Em seguida, adicione 500 microlitros de uma solução de DNA Pappa ao tecido cortical de meia ninhada de embriões. Incube a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Duas vezes durante o período de incubação, agite suavemente o tubo para misturar o conteúdo após a incubação, use uma pipeta de pastel siliconizado polido por chama para reavaliar suavemente o tecido 10 a 15 vezes até que a dispersão celular seja obtida.

Poucos, se houver, pedaços de tecido não dissociado devem permanecer, evitam a geração de bolhas. Coloque cuidadosamente a suspensão de células dissociadas sobre uma almofada de três mililitros de 4% BS, A em Hank's BSS com aditivos. Em seguida, em uma centrífuga de bancada com uma centrífuga de rotor basculante a 100 vezes G por sete minutos.

Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, tomando cuidado para não aspirar o pellet celular. Em seguida, adicione um mililitro de meio neurobasal completo, pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células peletizadas. Em seguida, use um hemocitômetro para determinar a concentração de células vivas.

Apenas as células brilhantes de fase devem ser consideradas vivas imediatamente antes do reforço. Aspirar o excesso de solução de soro laminado das lamínulas nos alvéolos e substituí-lo por meio de cultura de neurónios primários. Em seguida, adicione 75.000 a 100.000 neurônios primários a cada poço.

Cultive os neurônios por até 21 dias em meio neurobasal a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono no sétimo dia e, a cada semana, adicione flúor antimitótico, uridina desoxi uridina para evitar o crescimento excessivo da glia e realizar uma mudança de meio meio. Durante a primeira semana em cultura, os neurônios desenvolveram árvores dendríticas, como mostrado nesta imagem de uma cultura de dois dias. Na segunda à terceira semana, eles amadureceram e estarão passando por sinaptogênese.

Uma extensa rede de projeções é ilustrada nesta figura tomada em 14 dias in vitro para rotular proteínas expostas à superfície de interesse, adicionar o anticorpo primário diretamente ao meio condicionado na concentração apropriada. Cada condição deve ser testada em triplicata Quatro controles, soro pré-imune ou anticorpos que reconhecem regiões intracelulares da proteína que não são expostas durante a exocitose podem ser usados na mesma diluição que o anticorpo primário de teste. Retorne as células à incubadora de cultura por uma, duas ou quatro horas após a incubação, aspire o meio contendo anticorpo, lave os poços uma vez, suavemente, mas rapidamente com PBS.

Adicione a temperatura ambiente adicionando solução aos poços e, em seguida, aspirando. Em seguida, adicione formaldeído a 4% recém-preparado e incube por cinco minutos. Adicione a temperatura ambiente para fixar as células após a fixação.

Retirar a solução de paraformaldeído dos alvéolos e deitá-la num recipiente de resíduos líquidos na hotte. Em seguida, enxágue rapidamente as células três vezes com PBS como antes. Deixe a terceira lavagem no lugar para que a lamínula possa ser facilmente removida.

Em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente as lamínulas da placa e coloque-as com o lado da célula voltado para cima em uma folha de papel na base ou tampa de uma placa de cultura descartável. O restante do protocolo de coloração será realizado nesta superfície pipeta suavemente a solução de bloqueio de PBS 5% BSA nas células para fazer uma gota arredondada em forma de bolha na lamínula para que não seque. Incube por 30 minutos.

É importante lembrar de não adicionar detergente à solução de bloqueio. Nesta fase, as células não devem ser permeadas quando apenas as proteínas da superfície celular devem ser marcadas. Após o bloqueio, aspire a solução de bloqueio, depois rotule as proteínas expostas à superfície, aplique um anticorpo secundário marcado com fluorescência e, em seguida, incube por duas horas em temperatura ambiente após a incubação, aspire o anticorpo secundário e lave as lamínulas duas vezes com PBS por cinco minutos de cada vez para bloquear qualquer proteína na superfície celular não ligada ao anticorpo secundário marcado.

Incube os neurônios não permeáveis com uma alta concentração de anticorpo secundário não marcado durante a noite. À temperatura ambiente. A incubação durante a noite é crucial.

Períodos de incubação mais curtos não bloquearão completamente nenhum anticorpo primário que não esteja totalmente ligado ao anticorpo secundário marcado. No dia seguinte, lave as lamínulas duas vezes por cinco minutos cada com PBS como antes. Em seguida, fixe as células com 4% de formaldeído em tampão fosfato por cinco minutos em temperatura ambiente após a remoção do fixador.

Enxágue rapidamente as células duas vezes com PBS. Em seguida, para a marcação intracelular, permee e bloqueie as células com PBS contendo 5% BSA e 0,1% Triton X 100 em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a permeação, remova a solução de bloqueio.

Tomando cuidado para que as lamínulas não sequem. Adicione um anticorpo secundário marcado de forma diferente e incube por duas horas em temperatura ambiente. Depois de remover o segundo anticorpo secundário, lave as lamínulas três vezes por cinco minutos com PBS.

Em seguida, lave-os brevemente com suporte de água deionizada. As lamínulas de cobertura em lâminas de vidro com um meio de montagem aquoso contendo um agente antidesbotamento e permitem que elas armazenem as lâminas no escuro a quatro graus Celsius para uma preservação ideal do sinal fluorescente. Visualize as células de coloração imunológica em um microscópio confocal usando os filtros de excitação e emissão apropriados.

Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem para todas as réplicas e condições após a imagem. Use software de análise de imagem padrão, como Fiji Image J ou metamorph, para determinar a densidade integrada de regiões de interesse padrão ou os atributos de Punta, como número e tamanho, para determinar se o gene seis relacionado à convulsão ou seis estava presente e internalizado da superfície do neurônio. A marcação de duas cores de neurônios do hipocampo de ratos cultivados foi realizada conforme descrito neste vídeo.

Nesta imagem, a proteína da superfície celular rotulada é mostrada em ciano e a proteína internalizada é mostrada em verde. A coloração dupla indicada pela ponta da seta foi observada apenas em uma célula que parecia não ser saudável para determinar se a proteína internalizada durante a incubação de alimentação de anticorpos localizada nos endossomos neurônios que expressam o marcador de endossomo de reciclagem precoce transferrina mCherry foram imunocorados após a permeação, como mostrado nesta região da árvore dendrítica, houve extensa sobreposição da coloração pontilhada com a transferrina, confirmando que a proteína internalizada localizada nos endossomos. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que um único anticorpo pode ser usado para distinguir entre a superfície celular e os pools de proteínas internalizadas.