Name: Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Aprenda a preparar microtúbulos segmentados com tampas fotoestabilizadoras para estudar movimentos impulsionados pela desmontagem de microtúbulos terminais. Este método permite controlar a despolimerização com alta resolução temporal e espacial.

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Os autores gostariam de agradecer a FI Ataullakhanov para ajudar a projetar e fabricar câmaras de fluxo reutilizáveis, N. Dashkevich, N. e A. Gudimchuk Korbalev para fornecer imagens para figuras, N. Gudimchuk e P. Zakharov para o desenvolvimento de um protocolo e fornecendo reagentes para preparar sementes de microtúbulos marcadas com digoxigenina, A. Potapenko ajuda com edição de texto e outros membros da Grishchuk laboratório para dicas e discussões. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH conceder GM R01-098389 e uma concessão piloto da Pensilvânia Muscle Instituto ELG, que é um Kimmel Scholar, por RFBR concede 12-04-00111-a, 13-04-40190-H e 13 -04-40188-H, da Academia Russa de Ciências Presidium Grants (Mecanismos do Sistema de Integração Molecular e Biologia Celular Molecular programas e Molecular) para FI Ataullakhanov, NIH conceder GM R01 GM033787 para JR McIntosh, e um pós-doutorado bolsa da Fundação Dmitry Dynasty Zimin para VAV

Os autores não têm nada a revelar.

Muitos ensaios única molécula hoje em dia usam rotineiramente lamelas especialmente tratadas para reduzir drasticamente a aderência proteína inespecífica. O procedimento que descrevemos aqui é uma modificação do protocolo original desenvolvido no laboratório de Howard 32, e nós achamos que silanizar as lamelas vale bem a pena o esforço, mesmo com ensaios de contas baseadas em DIC, que não utilizam a fluorescência. Câmaras montadas com tais lamelas mostram superfícies muito mais limpas, e os resultados obtidos...

Os microtúbulos são estruturas altamente conservadas do citoesqueleto, que são importantes para a arquitectura celular, motilidade celular, divisão celular e o transporte intracelular 1. Estes polímeros dinâmicas montar a partir de tubulina na presença de GTP, e que exibir espontaneamente entre crescimento e encurtamento 2. Os microtúbulos são muito finas (apenas 25 nm de diâmetro), portanto, técnicas ópticas especiais para melhorar o contraste deve ser usada para observar microtúbulos com um microscópio de luz. Trabalhos anteriores com esses polímeros examinado seu comportamento dinâmico usando contraste de interferência diferencial (DIC) 3. Este e outros estudos in vitro mostraram que em condições experimentais típicas, os microtúbulos sofrer catástrofe e mude para a despolimerização apenas raramente, uma vez a cada 5-15 min (esta freqüência é de 7-15 mM concentração tubulina solúvel examinado em 28-32 ° C ) 4. Diferentes técnicas têm sido, assim, propôs a induçãoe despolimerização de microtúbulos de maneira controlada. Microtúbulos encurtamento pode ser desencadeada por lavagem para retirar tubulina solúvel 5,6, cortando microtúbulos com um feixe de laser 7, ou usando microtúbulos segmentados 8, tal como descrito aqui. Trabalhos anteriores utilizando microtúbulos segmentados, bem como polímeros estocasticamente de comutação, tem encontrado que as pequenas cargas intracelulares, tais como os cromossomas, vesículas, e pérolas revestidas com proteína, pode mover-se nas extremidades dos microtúbulos encurtamento 9-13. Este fenômeno é pensado para ter uma implicação direta para movimentos cromossômicas em células mitóticas, e os mecanismos subjacentes estão atualmente sob investigação ativa 14-16. Recentemente, técnicas fluorescentes à base, incluindo o total de fluorescência reflexão interna (TIRF) microscopia, foram utilizados para estudar a motilidade com microtúbulos dinâmica termina 17-24. A vantagem desta abordagem é que ela permite o exame de interacçãos entre os microtúbulos e proteínas de ligação de microtúbulos em tempo real, utilizando as proteínas marcadas com fluoróforos diferentes. Vários complexos de proteínas foram encontradas para mover processively com alongamento e / ou encurtar extremidades dos microtúbulos. Elas incluem as proteínas associadas a microtúbulos Dam1 10,12,18, Ska1 19, e XMAP215 20, bem como motores de cinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 e CENP-E 24. Estas proteínas apresentam processive ponta-tracking, que é fundamentalmente diferente daquele das proteínas de rastreamento de ponta clássicos como EB1 25. Embora as moléculas EB1 e os parceiros associados parecem permanecer estavelmente associada com microtúbulos dinâmica termina, as moléculas individuais permanecem ligados à extremidade do microtúbulo para apenas ~ 0,8 seg, rapidamente trocar com a piscina solúvel 26. Em contraste, processive ponta dos trackers, como Dam1, viajar com microtúbulos termina para muitos microns, e sua associação com dicas de microtúbulos pode durar mquaisquer segundos. A ponta do tempo de associação, bem como a taxa resultante de acompanhamento, depende fortemente o número de moléculas que formam o complexo de localização da ponta 27. Maiores conjuntos de proteínas são geralmente muito melhores ponta-trackers. Por exemplo, esses conjuntos complexos como os isolados de levedura cinetócoros pode permanecer acoplada a microtúbulos termina por 28 horas. Algumas proteínas de ligação de microtúbulos, por exemplo, complexo de proteínas kinetochore Ndc80, foram encontrados para ser incapaz de acompanhar com microtúbulos termina no mesmo nível molécula, ainda Ndc80 é muito eficiente em acoplar o movimento de cargas talão 19,29-31. Assim, para compreender o mecanismo de ponta de rastreamento por diferentes complexos de proteínas, bem como os seus papéis biológicos, é importante examinar ponta-rastreamento como uma função do número de moléculas do complexo de rastreamento de ponta, bem como para determinar a capacidade destes complexos para expor motilidade colectivo sobre a superfície de carga do grânulo. (Figura 1A). Em primeiro lugar, as lâminas de vidro disponíveis no mercado são modificados para fixar tubos de polietileno curto (Protocolo 1). A câmara de fluxo de microscopia reutilizável é, então, montado a partir de tal slide eo limpa-plasma e lamela silanizada (protocolo 2) 32-34 química ou. O volume da câmara resultante é apenas de 20-25 ul (ou tão pequenos quanto 15 ul, ver Nota 3 de protocolo 1), incluindo o volume do tubo de entrada. Câmaras de fluxo comercialmente disponíveis também podem ser utilizados, mas o seu volume é geralmente maior, o que leva ao desperdício desnecessário de proteínas. Se uma câmara maior é empregue, o volume de todas as soluções nos protocolos abaixo deve ser dimensionado proporcionalmente. Sementes de microtúbulos são então preparados, por exemplo, utilizando-se lentamente hidrolisável GTP analógico, GMPCPP (guanosina-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (protocolo 3, ver também Hyman &lt;in&gt; et al. 35). As sementes são imobilizadas sobre uma lamela de limpeza e a superfície é bloqueada posteriormente para impedir a absorção não específica de outras proteínas de 32 (protocolo de 4 descreve sementes imobilização utilizando digoxigenina). Os microtúbulos segmentado pode, então, ser preparado utilizando o Protocolo 5. A principal razão para esta abordagem é que os polímeros de microtúbulos dinâmicos, que formam na presença de GTP, podem ser estabilizadas pela adição temporariamente as curtas &quot;tampões&quot; de segmentos de tubulina estáveis, que contêm GMPCPP. Estas cápsulas contêm também tubulina Rodamina marcado, de modo que pode ser removido simplesmente através da iluminação do campo de visão com um laser de 530-550 nm, ou uma lâmpada de arco de mercúrio (Protocolo 6) 36. A intensidade de fluorescência do sinal de ponta-de controlo pode então ser utilizada para estimar o número de moléculas que se deslocam com as extremidades desmontagem de microtúbulos, tendo em conta a irregularidade da iluminação de campo do microscópio (Protocolo 7). Uma abordagem semelhante pode ser usadapara estudar as interacções entre os microtúbulos Despolimerização e pérolas revestidas com proteína, preparado como descrito em 27 (Protocolo 8). Algumas proteínas irão ligar-se facilmente às paredes dos microtúbulos segmentadas, mas pinças a laser também pode ser utilizado para segurar o cordão perto da parede de microtúbulos, promovendo assim a sua ligação.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 1. Microscopia e outros equipamentos.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>outros modelos de microscópio capazes de DIC e imagens de epifluorescência podem ser usados</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Aquecedor de objetiva</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro fluorescente</td><td>Chroma</td><td>49004 ou 49008 41017 ou 49020</td><td>otimizado para fluorescência de rodamina&nbsp; otimizado para software de aquisição de fluorescência GFP</td></tr><tr><td></td><td>freeware MicroManager Molecular Devices</td><td>não aplicável MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ outro software pode ser usado para adquirir imagens e para um rastreamento de partículas</td></tr><tr><td>Câmera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Câmera EMCCD altamente sensível</td></tr><tr><td>Laser de captura</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>Laser de 1.064 nm, lasers</td></tr><tr><td>de excitação de fluorescência</td> de 10 W <td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP</td><td>excitação de fluoróforos verdes excitação de fluoróforos vermelhos</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de fluxo comercial</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 ou RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão</td><td>Cole Palmer Harvard Apparatus</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Ambas as bombas fornecem a taxa necessária de fluxo de líquido, mas uma bomba peristáltica pode pulsar em velocidade muito lenta. O fluxo com uma bomba de seringa é mais consistente para uma ampla gama de taxas, mas esta bomba tem inércia.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Preparação da câmara de microscopia.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio modificadas para câmaras reutilizáveis</td><td>Sopro de vidro de precisão do Colorado</td><td>Pedido personalizado www.precisionglassblowing.com</td><td>Slots sônicos em lâminas usando esquemas em Figura 1</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>I.D. 0,58 mm, O.D. 0,965 mm; use esses tubos para conectar a câmara montada à bomba e ao recipiente de resíduos</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>I.D. 0,28 mm, O.D. 0,61 mm; use estes tubos para fazer a câmara reutilizável</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio regulares</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Outras lâminas semelhantes podem ser usadas</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>Outras lamínulas semelhantes podem ser usadas</td></tr><tr><td>Selante de silicone</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, SELANTE DE SILICONE 5 MIN CURA</td><td></td></tr><tr><td>Cola epóxi</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de cianoacrilato</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>Ou adesivo de cianoacrilato de outros fabricantes</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Limpeza e revestimento de lamínulas.</peneiras moleculares>fortes</td></tr><tr><td>, grau 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de coloração de lamínula</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Cerâmica para Lamínula</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigenina AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Preparação de sementes e microtúbulos segmentados.</td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>purificada de cérebros de vaca Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Para protocolos de purificação, consulte 49&ndash; 51 Tubulina suína não marcada</td></tr><tr><td>Citoesqueleto de tubulina marcada</td><td>com citoesqueleto, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoxigenina)</td><td>Tubulina suína marcada com rodamina A tubulina pode ser rotulada com qualquer corante reativo à amina como na referência52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Alíquota e loja em -70 &deg; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Vaselina, lanolina e parafina a 1:1:2 em massa</td><td></td>, <td>consulte a referência9</td></tr></tbody></table>

preparação de segmentadas microtubules para estudar moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos termina

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule despolimerização pode fornecer força para o transporte de diferentes complexos de proteínas e pérolas revestidas de proteínas in vitro. Os mecanismos subjacentes são pensados ​​para jogar um papel vital nos movimentos do cromossoma dependente de microtúbulos durante a divisão celular, mas as proteínas relevantes e suas funções exatas são mal definido. Assim, existe uma necessidade crescente de desenvolver ensaios com a qual para estudar tal motilidade in vitro, utilizando os componentes purificados e meio bioquímico definido. Os microtúbulos, no entanto, são intrinsecamente instáveis ​​polímeros, a sua comutação entre crescimento e encurtamento é estocástica e difícil de controlar. Os protocolos que descrevemos aqui aproveitar os microtúbulos segmentados que são feitos com o photoablatable estabilização caps. Despolimerização desses microtúbulos segmentados podem ser acionados com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim os estudos de mobilidade nas extremidades desmontagem dos microtúbulos. Esta técnica pode ser usada para carry a uma análise quantitativa do número de moléculas em complexos de proteína fluorescente marcado, que se movem com processively dinâmica dos microtúbulos termina. Para optimizar a relação de sinal-para-ruído neste e em outros ensaios fluorescentes quantitativos, lamelas devem ser tratadas para reduzir a absorção não específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solúveis. Protocolos detalhados são fornecidos para ter em conta as irregularidades de iluminação fluorescente, e determinar a intensidade de um único fluoróforo usando ajuste de Gauss equidistante. Finalmente, descreve-se o uso de microtúbulos segmentadas para estudar movimentos das microesferas revestidas com proteínas dependentes de microtúbulos, fornecendo insights sobre a capacidade de diferentes proteínas do motor e não motores a par de microtúbulos despolimerização ao movimento de carga processiva.

Rastreamento com despolimerizando microtúbulos Protein termina. Yeast kinetochore componente Dam1 é de longe o melhor ponta-tracker do microtúbulos despolimerizando termina 14. O complexo de 10-subunidade marcada com GFP podem ser facilmente expressas e purificadas a partir de células bacterianas 18,38, portanto, recomendado usá-lo como um controlo positivo para o ensaio de localização da ponta. Uma proteína fluorescente que controla o fim da despolimerização de microtúbulos é vist...

Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar os movimentos de moléculas de proteína e grânulos revestidos de proteína com as extremidades dos microtúbulos despolimerizantes. Isso é obtido montando uma câmara de fluxo reutilizável com uma lamínula de tamanho limpo. Em seguida, as sementes de microtúbulos são preparadas presas à lamínula e usadas para nuclear os microtúbulos, que são então estabilizados temporariamente com tampas fotodestrutíveis.Em seguida, proteínas marcadas com GFP ou grânulos revestidos de proteínas são introduzidos na câmara de fluxo e se ligam a microtúbulos segmentados. A despolimerização da micro banheira é então desencadeada pela remoção das tampas por fotoablação. As imagens são analisadas com CH para determinar se as proteínas marcadas exibem comportamento de rastreamento de ponta, que é o movimento com as extremidades dos microtúbulos despolimerizados.A principal vantagem desta técnica é que ela permite desencadear a microtúbulos com alta resolução temporal e especial. A demonstração visual deste método é crítica. O protocolo começa com a preparação e montagem da câmara de fluxo usando fresagem ultrassônica.Modifique as lâminas de microscópio regula

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o TIRF, uma técnica baseada em microscopia de reflexão interna total para visualizar a dinâmica de polimerização de actina e microtúbulos. O método permite a imagem de alta resolução da dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos em tempo real, o que é essencial para a compreensão das diafonias celulares.

Microscopia TIRF para visualizar a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbulos

Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.

Técnica quantitativa de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

Este artigo apresenta um protocolo para a formação de conjuntos de microtúbulos na forma de tatoides usando MAP65, um interlinker de microtúbulos à base de plantas, e PEG como um agente de aglomeração.

Auto-montagem de Tactóides microtúbulos

Este trabalho apresenta protocolos para engenharia e caracterização de redes compostas tridimensionais sintonizáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos. Os compósitos sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados pelos motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos.

Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

Apresentamos aqui métodos para a preparação de nemática ativa a partir de microtúbulos e motores de cinesina, incluindo a preparação e construção de proteínas e o uso de poços para confinamento nemático ativo.

Formando, Confinando e Observando Nemática Ativa Baseada em Microtúbulos

Aqui, descrevemos um protocolo para extrair tubulina endógena de células de mamíferos, que podem não possuir ou conter enzimas modificadoras de microtúbulos específicas, para obter microtúbulos enriquecidos para uma modificação específica. Em seguida, descrevemos como os microtúbulos extraídos podem ser decorados com proteínas purificadas de ligação a microtúbulos para preparar grades para microscopia crio-eletrônica.

Extração de Microtúbulos Modificados de Células de Mamíferos para Estudo de Complexos Microtúbulo-Proteína por Microscopia Crio-Eletrônica

Este protocolo detalha o projeto e a fabricação de um dispositivo microfluídico adequado para investigar a mecânica do polímero de microtúbulos. A síntese de técnicas de microfabricação, controle de fluxo automatizado e modelagem computacional permite um sistema flexível ideal para sondar o citoesqueleto celular in vitro.

Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Aprenda a preparar microtúbulos segmentados com tampas fotoestabilizadoras para estudar movimentos impulsionados pela desmontagem de microtúbulos terminais. Este método permite controlar a despolimerização com alta resolução temporal e espacial.

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