Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar os movimentos de moléculas de proteína e grânulos revestidos de proteína com as extremidades dos microtúbulos despolimerizantes. Isso é obtido montando uma câmara de fluxo reutilizável com uma lamínula de tamanho limpo. Em seguida, as sementes de microtúbulos são preparadas presas à lamínula e usadas para nuclear os microtúbulos, que são então estabilizados temporariamente com tampas fotodestrutíveis.

Em seguida, proteínas marcadas com GFP ou grânulos revestidos de proteínas são introduzidos na câmara de fluxo e se ligam a microtúbulos segmentados. A despolimerização da micro banheira é então desencadeada pela remoção das tampas por fotoablação. As imagens são analisadas com CH para determinar se as proteínas marcadas exibem comportamento de rastreamento de ponta, que é o movimento com as extremidades dos microtúbulos despolimerizados.

A principal vantagem desta técnica é que ela permite desencadear a microtúbulos com alta resolução temporal e especial. A demonstração visual deste método é crítica. O protocolo começa com a preparação e montagem da câmara de fluxo usando fresagem ultrassônica.

Modifique as lâminas de microscópio regulares para ter duas ranhuras. Faça as ranhuras separadas por 14 milímetros. Mais ou menos um milímetro, o que é ideal para câmaras montadas usando lamínulas quadradas de 22 milímetros.

Em seguida, coloque um tubo de polietileno de 100 milímetros de comprimento em cada ranhura da lâmina, deixando cerca de cinco milímetros de saliências nas extremidades internas das ranhuras. Fixe os tubos dentro das ranhuras com cola de cianoacrilato, incorporando os tubos completamente dentro das ranhuras. Preencha cuidadosamente as ranhuras com cola epóxi sem derramar.

Deixe secar por um dia. No dia seguinte. Use uma lâmina de barbear afiada para cortar a cola solidificada, a três a quatro milímetros da extremidade distal de cada local de fixação.

Removendo as partes proximais ao centro do slide. Os tubos devem permanecer em suas ranhuras e os cortes devem fazer superfícies planas com aberturas de tubos. Em seguida, encha uma seringa com água e teste se os tubos estão funcionando corretamente.

Se o líquido fluir livremente, coloque uma gota de cola epóxi com cerca de cinco milímetros de diâmetro nas extremidades externas das ranhuras e deixe secar por cerca de um dia. As câmaras de fluxo concluídas são, portanto, duráveis e podem ser usadas repetidamente por muitos meses. Este protocolo de três horas prepara 12 lamínulas.

Requer uma hotte, um porta-lamínulas de cerâmica, três frascos de coloração de 15 mililitros e 1 frasco de vidro de 250 mililitros com tampa. Os frascos de coloração devem caber quatro lamínulas de número 1 de 22 milímetros em uma pilha. Comece com uma pilha de 12 lamínulas pré-limpas e secas no suporte de cerâmica.

Encha o frasco com mais uma solução repelente de sileno e abaixe lentamente as lâminas. Feche o frasco e incube-o por cinco minutos em temperatura ambiente. O passo mais crítico para garantir uma civilização uniforme da lamínula é evitar vestígios de água durante a incubação das lamínulas na solução de Selene.

Esta etapa é essencial para a fixação firme de sementes microtubárias. Mais tarde em um protocolo, Quando as lamínulas estiverem prontas, remova o suporte de cerâmica do frasco. Em seguida, transfira as lamínulas individualmente usando uma pinça revestida de Teflon do suporte de cerâmica para frascos de coloração carregados com metanol.

Agora coloque os três potes no reservatório de água de um banho sônico com um pedestal de metal ou vidro. O nível da água deve estar em dois terços da altura dos frascos sonicar os frascos a 70 watts por 20 minutos. Durante a sonicação, troque a solução de metanol a cada cinco minutos.

Quando a sonicação estiver completa, enxágue, a tampa limpa 10 vezes com água deionizada. Se a silização funcionou corretamente, as lamínulas parecerão secas Quando removidas da água, independentemente da aparência, remova completamente qualquer água residual. Usando a transferência de gás nitrogênio, a tampa seca desliza para um recipiente selável seco com nitrogênio.

Interlay Kim limpa entre as lamínulas. Eles podem ser armazenados dessa maneira por várias semanas em temperatura ambiente. Este protocolo requer uma a duas horas, uma câmara de fluxo e sementes microtubiais estabilizadas G-M-P-C-P-P preparadas.

Primeiro, monte a câmara de fluxo. Prenda dois pedaços de fita dupla-face ao longo da área central de cinco milímetros de largura da lâmina preparada e pressione firmemente a lamínula na fita. Usando uma seringa de um mililitro, encha a câmara com 100 microlitros de solução B rrb 80 por meio de um tubo.

Em seguida, esprema uma pequena gota de selante de fundição rápida de duas cores em cima de uma pequena placa de Petri de plástico. Misture rápida e completamente com um palito. Ele ficará verde.

Aplique o selante imediatamente ao longo de todas as bordas da lamínula. Verifique se o selante penetra muito profundamente sob a lamínula. Se um tubo estiver bloqueado, desconecte a seringa e levante o tubo para aplicar uma leve pressão para evitar que o selante vaze Após 10 minutos, certifique-se de que o fluxo da solução não seja restrito.

Em seguida, transfira a câmara para um estágio de microscópio aquecido a 32 graus Celsius. Conecte um dos tubos a uma bomba para remoção da solução. Mergulhe a extremidade livre do tubo de entrada em um frasco de 0,5 milímetro com tampão BRB 80 quente.

Defina a bomba para 100 microlitros por minuto e, conforme necessário, use-a para empurrar suavemente as bolhas de ar. Isso também pode ser feito manualmente. Agora use a bomba para carregar 30 microlitros de anticorpos de antígeno quente.

Desligue a bomba e aguarde cinco minutos. Desligue a bomba durante todas as incubações. Em seguida, lave as câmaras com cerca de 100 microlitros de b rrb 80 quente.

Em seguida, perfunda 50 microlitros de F1 1% onic 27 em BRB 80. Aguarde 10 minutos para que ele bloqueie a superfície hidrofóbica da lamínula siloizada. Agora lave as câmaras com 100 microlitros de tampão de motilidade.

Em seguida, reduza a velocidade da bomba para 15 microlitros por minuto e perfunda a câmara com 30 a 40 microlitros de sementes de microtúbulos diluídas de um a 200 a um a 600 em tampão de motilidade. Incube as sementes por 15 minutos e, em seguida, lave a câmara com 400 microlitros de tampão de motilidade a 100 microlitros por minuto para remover qualquer material não ligado. Em seguida, reduza a velocidade da bomba para 30 microlitros por minuto e perfunda a câmara com solução de tubulina não marcada pré-aquecida.

Os aspectos mais críticos deste protocolo são evitar bolhas de ar. Usar soluções de tubulina recém-preparadas e seguir o tempo exato do protocolo, especialmente durante o capeamento microtubular. Monitore o crescimento microtubial usando a óptica DIC durante a incubação de cinco a sete minutos.

Os microtúbulos geralmente crescem cerca de 10 mícrons, trocam rapidamente a solução com a mistura de tubulina de rubi pré-guerra e permitem de oito a 10 minutos a mais de tempo de incubação. Lave bem a câmara com 100 microlitros de tampão de motilidade a 20 microlitros por minuto para remover turbulência e nucleotídeos, bem como fragmentos de microtúbulos solúveis. Em seguida, perfunda a câmara com uma solução aquecida de proteína marcada com GFP ou grânulos revestidos de proteína e prossiga com a imagem do componente cinético de levedura DAM um marcado com GFP foi purificado de células bacterianas e usado como controle positivo para ensaios de rastreamento de ponta.

Essas proteínas seguem com a extremidade de despolimerização de um microtúbulo e se movem constantemente em direção à semente anexada à lamínula. Essas proteínas aparecem como uma linha oblíqua em um gráfico correspondente, que pode ser analisado para determinar o número de moléculas de proteína no complexo de rastreamento da ponta. Essa análise é detalhada no protocolo de texto.

Em contraste, as proteínas que não conseguem seguir o rastreamento não mostram um enriquecimento no sinal de fluorescência na microextremidade de desmontagem. Isso é visto com a proteína NDC 80 GFP humana. A ligação entre grânulos revestidos de proteínas e microtúbulos é geralmente bastante forte, portanto, quando os grânulos foram adicionados à câmara de microscopia, eles se ligaram prontamente aos microtúbulos segmentados anexados à lamínula.

Quando o rastreamento do cordão é processivo, muitas observações podem ser feitas. As contas que se ligaram a um microtúbulo mostraram um movimento semelhante a um arco, à medida que os microtúbulos giram ligeiramente em torno do local de seu crescimento. Quando a tampa estabilizadora é iluminada, se apenas um segmento vermelho puder ser visto distal da semente e do grânulo, o cordão é preso a um microtúbulo.

A tampa pode ser vista frequentemente seguindo o movimento das contas até que a tampa seja branqueada O movimento da conta logo após o branqueamento parece consistente com a orientação dos microtúbulos. À medida que o microtubário encurta e o cordão se move em direção à semente, a amplitude das oscilações em forma de arco diminui. Se as contas não conseguirem formar ligações duradouras aos microtúbulos estáveis.

O aprisionamento a laser pode ser usado em grânulos com diferentes construções de proteínas de cinesina mais direcionada à extremidade SE E exigiu essa técnica para lançar os grânulos nas paredes microtubiais segmentadas na presença de um TP. Essas contas se moveram rapidamente em direção às extremidades micro tubial mais tampadas em um gráfico. Esse movimento resultou em uma linha oblíqua direcionada para a tampa depois que a tampa foi destruída. As contas revestidas com proteína espiã truncada se separaram do microtúbulo, conforme apontado pela seta verde.

Em contraste, grânulos com proteína B de comprimento total podem sustentar o movimento na direção inversa. Isso é visto como um padrão em zigue-zague no gráfico chm devido ao movimento em direções opostas à extremidade positiva e negativa dos microtúbulos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar câmaras de fluxo e desenvolver microtúbulos segmentados para estudar os movimentos impulsionados pela desmontagem de microtrompas.