Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP

O objetivo geral deste procedimento é criar, testar e validar fatores de transcrição artificiais geneticamente codificados e indutíveis, ou ATF, com especificidade desejada. Isso é realizado primeiramente criando o ATF por meio de uma simples transformação em levedura, na qual a inclusão de um produto de PCR do domínio de ligação ao DNA resulta em uma fusão em quadro de leitura com um receptor de estrogênio humano e VP16. O segundo passo do procedimento consiste em criar um plasmídeo repórter GFP para o ATF substituindo os sítios de ligação no plasmídeo PMN8 por sequências-alvo do fator de transcrição.

O terceiro passo do procedimento é testar a capacidade dos ATF de ativar o repórter GFP e também avaliar seu efeito na fisiologia da levedura mediante a medição da taxa de crescimento. O passo final do procedimento é utilizar um TF validado para expressar condicionalmente um alvo genômico nativo. Em última instância, qualquer gene de interesse pode ser tornado condicionalmente ativo.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a indução mediada por galactose da expressão gênica, é que a indução seletiva pode ser alcançada sob diversas condições nutricionais e fisiológicas, sem efeitos pleiotrópicos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia de leveduras por meio da introdução rápida e reversível de produtos gênicos desejados, permitindo o estudo tanto de ganho quanto de perda de função. Para começar, amplifique por PCR o domínio de ligação ao DNA ou DVD de interesse utilizando uma polimerase de alta fidelidade.

Transforme mais de um micrograma do produto de PCR purificado em levedura utilizando o método de acetato de lítio. Após a transformação, centrifugue as células em velocidade máxima por 15 segundos em uma microcentrífuga, remova a mistura de transformação e reconstitua as células em aproximadamente 200 microlitros de água estéril antes de semear em extrato de levedura. No dia seguinte, plaque em meio peptona-dextrose ou YPD e, em seguida, replique de YPD para cinco placas de ácido fluororacético.

Após o crescimento por dois a quatro dias, replique pelo menos cinco a 10 colônias em YPD. Em seguida, realize uma PCR de colônia utilizando os iniciadores descritos no protocolo e faça o sequenciamento para verificar a inclusão. Dilua os oligonucleotídeos da região de ligação desejada para concentrações equimolares.

Fosforile a região de ligação utilizando a cinase de polinucleotídeo T4 e, em seguida, um termociclador neo de acordo com as condições da reação descritas no protocolo. Em seguida, digira aproximadamente um a dois microgramas de PMN8 com NotI-HF e XbaI por uma hora a 37 graus Celsius em gel.

Limpe a faixa do esqueleto e dilua o esqueleto purificado para 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, dilua o sítio de ligação fosforilado de dupla fita para cinco vezes a concentração molar do esqueleto por microlitro. Usando a ligase de DNA T4, ligue os sítios de ligação ao esqueleto digerido à temperatura ambiente por 30 minutos.

Realize a transformação adicionando metade da reação de ligação a 50 microlitros de células de EIA coli quimicamente competentes padrão e siga o procedimento descrito no protocolo textual. Após recuperar as células, adicione de 100 a 200 microlitros das células por placa luria berti ou lb mais ampicilina e incube durante a noite. No dia seguinte, cultive o e coli em meio líquido lb mais ampicilina e extraia o DNA plasmidial conforme descrito no protocolo textual.

Em seguida, faça a verificação por sequenciamento do novo plasmídeo repórter a partir de colônias de ligação. Por fim, transforme o novo plasmídeo repórter na linhagem E contendo o Fator de Transcrição (A TF) utilizando transformação com acetato de lítio. Para iniciar, cultive uma linhagem contendo o Fator de Transcrição mais o repórter durante a noite em cinco mililitros de meio sintético completo desprovido de uracila.

Obtenha 9 frascos agitadores de 250 mililitros e adicione 25 mililitros de SC sem URA a cada um. Em seguida, prepare sete dos frascos com diferentes diluições de beta-estradiol conforme listado no protocolo descrito no texto, a partir de diluições seriadas de dez vezes de um estoque de beta-estradiol 25 milimolar, adicionando 125 microlitros das culturas de crescimento noturno a esses sete frascos. Para os dois frascos restantes, inocular com uma linhagem produtora constitutiva de GFP e uma linhagem que não possui GFP. Essas são necessárias para calibrar o citômetro de fluxo.

Agite o frasco a 200 RPM e 30 graus Celsius por 12 a 18 horas. Em seguida, retire 500 microlitros de cada cultura e centrifugue em tubos einor separados de 1,7 mililitro. Após a aspiração do sobrenadante, lave as células sedimentadas uma vez com tampão de citometria de fluxo, depois reconstitua as células em um mililitro do mesmo tampão.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão para citometria de fluxo a nove tubos Falcon dois. Adicione as células ressuspendidas aos tubos Falcon contendo o tampão, para um volume final igual a dois mililitros. Por fim, realize a citometria de fluxo.

Utilize dispersão frontal e dispersão lateral para identificar células de levedura. Ajuste a taxa de fluxo para aproximadamente 3000 células por segundo. Meça a GFP através do canal 50 e prossiga conforme o protocolo descrito no texto: a partir de estoques congelados, plaque separadamente uma linhagem contendo o fator de transcrição A e uma linhagem que não possui o fator de transcrição A em meio YPD. Após dois dias de crescimento, inocular tubos de cultura separados contendo cinco mililitros de meio líquido YPD e cultivar cada linhagem durante a noite a 30 graus Celsius.

Realize diluições seriadas de dez vezes de uma solução estoque de beta-estradiol 0,25 milimolar até 10.000 vezes em etanol 100%. Adicione 40 microlitros de cada cultura mantida durante a noite a 10 mililitros de meio líquido YPD. Para cada linhagem, adicione 96 microlitros das células diluídas a 18 poços de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione quatro microlitros de beta-estradiol às células. Um ponto essencial é garantir que cada poço tenha a mesma quantidade total de etanol. Realize uma triplicata com três poços para cada linhagem, utilizando apenas etanol.

Controles cobrem a placa de 96 poços com uma membrana permeável a gases. Monitore o crescimento em uma densidade óptica de 600 nanômetros em um leitor de placas. Quantifique as taxas de crescimento usando qualquer um dos diversos métodos, como determinar a inclinação máxima.

Após preparar o plasmídeo conforme instruído no protocolo textual de PCR, amplifique o cassete do promotor can MX. Transforme o produto de PCR em uma linhagem que expressa A TF utilizando o método de acetato de lítio, plaque as células transformadas em YPD e replique o plaqueamento em YPD acrescido do antibiótico G418 no dia seguinte. Por fim, confirme a inserção apropriada do promotor utilizando uma ponta marcadora (primer) direta e uma ponta marcadora reversa localizada internamente ao gene cujo promotor foi substituído.

O produto final da PCR tem aproximadamente 1,2 KB. Aqui é mostrada a indução de GFP por três pares diferentes de promotores de TF: Z four EVZ, three EV ou GEV ao longo do tempo em resposta a um micromolar de beta-estradiol. Observe o aumento na produção de GFP em resposta aos ATF contendo domínios de ligação ao DNA não derivados de levedura. Isso pode resultar do fato desses fatores alcançarem especificidade para um único gene no genoma de levedura.

A indução por GEV isoladamente leva à ativação ou repressão de centenas de genes, enquanto Z três EV e Z quatro EV apenas ativam a expressão de um gene alvo posicionado a jusante de um promotor sintético contendo sítios de ligação apropriados. Aqui, é mostrada a indução de GFP por Z três EV em resposta a zero nanomolar de beta-estradiol e a um micromolar de beta-estradiol após 18 horas de indução. A fluorescência também foi medida em células que não possuem GFP para ilustrar a regulação rigorosa do sistema Z três EV. A capacidade de Z três EV de induzir GFP ao longo de uma faixa de concentrações de beta-estradiol é mostrada aqui.

A fluorescência média das distribuições revela que a relação entre a concentração do indutor e a saída de expressão é graduada, com um coeficiente de Hill de aproximadamente um, indicando ligação independente do Z três EV. Após este procedimento, outros métodos, como microarranjos de expressão gênica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como a alteração da expressão de um único gene afeta os padrões genômicos de expressão gênica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar, testar e validar a eficácia de fatores de transcrição artificiais. Esses fatores de transcrição artificiais controlam condicionalmente a expressão de genes posicionados a jusante de sequências-alvo de DNA apropriadas.