Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP

O objetivo geral deste procedimento é criar, testar e validar fatores de transcrição artificiais induzíveis geneticamente codificados ou ATFs com a especificidade desejada. Isso é feito criando primeiro o A TF por meio de uma transformação simples de levedura na qual a inclusão de um produto de PCR de domínio de ligação ao DNA resulta em uma fusão no quadro com um receptor de estrogênio humano e VP 16. A segunda etapa do procedimento é criar um plasmídeo repórter GFP para o A TF, substituindo os locais de ligação no plasmídeo PMN oito por sequências de direcionamento de TF.

A terceira etapa do procedimento é testar a capacidade dos ATFs de ativar o repórter GFP e também avaliar seu efeito na fisiologia da levedura medindo a taxa de crescimento. A etapa final do procedimento é usar o TF validado para expressar condicionalmente um alvo genômico nativo. Em última análise, qualquer gene alvo de interesse pode ser tornado condicionalmente ativo.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a indução mediada por galactose da expressão gênica, é que a indução seletiva pode ser alcançada sob diversas condições fisiológicas e de nutrientes sem efeitos pleotrópicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia da levedura por meio da introdução rápida e reversível de produtos gênicos desejados, permitindo o estudo de ganho e perda de função. Para começar, a PCR amplifica o domínio de ligação ao DNA ou DVD de interesse usando uma polimerase de alta fidelidade.

Transformar mais de um micrograma do produto de PCR purificado em levedura usando o método de acetato de lítio. Após a transformação, gire as células em velocidade máxima por 15 segundos em uma microcentrífuga, remova a mistura de transformação e ressuspenda as células em aproximadamente 200 microlitros de água estéril antes de aplicar o extrato de levedura. Pepto dextrose ou YPD médio no dia seguinte réplica da placa de YPD em cinco placas de ácido fluorerótico.

Após o crescimento por dois a quatro dias, recoloque pelo menos cinco a 10 colônias no YPD. Em seguida, execute uma PCR de colônia usando os primers no protocolo de texto e sequência para verificar a inclusão. Diluir os oligos da região de ligação desejada em concentrações equimolares.

Fosforilar a região de ligação usando T quatro polinucleotídeo quinase e, em seguida, um neotermociclador de acordo com as condições de reação no protocolo de texto. Em seguida, digerir aproximadamente um a dois microgramas de PMN oito sem um HF e xb. Um por uma hora a 37 graus Celsius gel.

Purifique a banda da espinha dorsal e dilua a espinha dorsal purificada para 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, dilua o local de ligação fosforilada de fita dupla para cinco vezes a concentração molar de esqueleto por microlitro. Usando T quatro DNA Ligase, ligue os locais de ligação na estrutura digerida à temperatura ambiente por 30 minutos.

Realize a transformação adicionando metade da reação de ligação a 50 microlitros de células EIA coli quimicamente competentes padrão e seguindo o procedimento listado no protocolo de texto. Depois de recuperar as células, adicione 100 a 200 microlitros de células por luria berti ou lb mais placa de ampicilina, e incube durante a noite. No dia seguinte, cresça e coli e lb mais ampicilina líquida e colha o DNA do plasmídeo conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, verifique o novo plasmídeo repórter das colônias de ligação. Finalmente, transforme o novo plasmídeo repórter na cepa A TF contendo E usando a transformação de acetato de lítio. Para começar a cultivar um repórter TF plus contendo tensão durante a noite em cinco mililitros de meio sintético completo sem uracila.

Obtenha 9 250 mililitros, agite o frasco e adicione 25 mililitros de SC menos URA a cada um. Em seguida, prepare sete dos frascos com diluição diferente de beta estradiol, conforme listado no protocolo de texto, desde a diluição serial de dez vezes de um estoque de beta estradiol de 25 milimolares a 125 microlitros das culturas noturnas até esses sete frascos, pois os dois frascos restantes inoculam com uma cepa produtora de GFP constitutiva e uma cepa sem GFP. Estes são necessários para calibrar o citômetro de fluxo.

Agitar o balão a 200 rpm e a 30 graus Celsius durante 12 a 18 horas. Em seguida, remova 500 microlitros de cada cultura e gire em tubos einor separados de 1,7 mililitro. Depois de aspirar o sobrenadante, enxágue as células peletizadas uma vez com tampão de citometria de fluxo e, em seguida, ressuspenda as células em um mililitro do mesmo tampão.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão de citometria de fluxo a nove falcões dois. Adicione as células ressuspensas ao tampão contendo tubos de falcão para um volume final igual a dois mililitros. Por fim, execute a citometria de fluxo.

Use dispersão direta e dispersão lateral para identificar células de levedura. Defina a taxa de fluxo para aproximadamente 3000 células por segundo. Meça a GFP através do canal 50 e proceda como no protocolo de texto de estoques congelados risque uma cepa contendo A TF e uma cepa sem A TF em YPD Após dois dias de crescimento, inocule tubos de cultura separados contendo cinco mililitros de líquido YPD e cultive cada cepa durante a noite a 30 graus Celsius.

Realize diluições seriadas dez vezes de uma solução estoque de beta-estradiol a 0,25 milimolar até 10.000, dobrada em etanol a 100%. Adicione 40 microlitros de cada cultura noturna a 10 mililitros de líquido YPD. Para cada cepa, adicione 96 microlitros das células diluídas a 18 poços de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione quatro microlitros de beta estradiol às células. Um ponto essencial é garantir que cada poço tenha a mesma quantidade de etanol total. Realize um triplicado com três dos poços para cada cepa sendo apenas etanol.

Os controles cobrem a placa de 96 poços em uma membrana permeável a gás. Monitore o crescimento em uma densidade óptica de 600 nanômetros em um leitor de placas. Quantifique as taxas de crescimento usando qualquer número de métodos, como encontrar a inclinação máxima.

Depois de preparar o plasmídeo conforme as instruções do protocolo de texto PCR, amplificar o do promotor can MX. Transforme o produto de PCR em uma cepa que expressa A TF usando a placa do método de acetato de lítio, as células de transformação em YPD e a placa de réplica em YPD mais antibiótico G four 18 no dia seguinte. Por fim, confirmar a inserção adequada do promotor utilizando o iniciador directo e um iniciador inverso interno do gene cujo promotor foi substituído.

O produto final da PCR é de aproximadamente 1,2 KB mostrado aqui é a indução de GFP por três pares diferentes de promotores de TF Z, quatro EVZ, três EV ou GEV ao longo do tempo em resposta a um beta estradiol micromolar. Observe o aumento na produção de GFP em resposta aos ATFs contendo domínios de ligação ao DNA não levedura. Isso pode resultar desses fatores que alcançam especificidade de gene único no genoma da levedura.

A indução de GEV por si só leva à ativação ou repressão de centenas de genes, enquanto Z três EV e Z quatro EV apenas ativam a expressão de um gene alvo colocado a jusante de um promotor sintético contendo locais de ligação apropriados. Aqui, a indução de GFP por Z três EV em resposta a zero beta estradiol nanomolar e um beta estradiol micromolar após 18 horas de indução é mostrada A fluorescência também foi medida a partir de células sem GFP para ilustrar a regulação rígida do sistema Z três EV. A capacidade de Z três EV de induzir GFP em uma faixa de concentrações de beta estradiol é mostrada aqui.

A fluorescência média das distribuições revela que a relação entre a concentração do indutor e a saída de expressão é classificada com um coeficiente de colina de aproximadamente um, indicando a ligação independente de Z três EV Após este procedimento, outros métodos, como microarrays de expressão gênica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a alteração da expressão de um único gene afeta os padrões de expressão gênica do genoma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar, testar e validar a eficácia dos fatores de transcrição artificiais. Esses fatores de transcrição artificiais controlam condicionalmente a expressão de genes colocados a jusante das sequências-alvo de DNA apropriadas.