Name: Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a sintetizar e testar fatores de transcrição artificial induzíveis quimicamente em levedura usando GFP. Este método permite expressão condicional de genes com controle preciso e reversível.

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RSM reconhece financiamento do NSF Graduate Research Fellowship. MBN reconhece financiamento de um Lewis-Sigler Fellowship eo dom dotado de Peter Lewis. DB reconhece financiamento do NIH (GM046406) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais Centro de Biologia Quantitativa (GM071508). Reconhecemos Christina DeCoste para assistência com experimentos de citometria de fluxo.

A Figura 2 proporciona um esquema de secções de protocolo 1-3. 1. Criação de ATFs <ol><li> Criar iniciadores para amplificar por PCR o ADN do domínio de ligação de interesse. A homologia com o receptor de promotor ACT1 e hormona (tal como descrito nas Figuras 3 e 4) é adicionado por meio de PCR para facilitar a recombinação correcta na estirpe yMN15. </li><li> PCR amplificar DBD de interesse, utilizando uma polimerase de alta fidelidade. </li><li> Transform&gt; 1 ug de produto de PCR purificado em levedura usando o método do acetato de lítio 13. </li><li> Após a transformação, as células de rotação em alta velocidade por 15 segundos em microcentrífuga e remover mix de transformação. </li><li> Ressuspender em ~ 200 mL de água estéril e placa YPD. </li><li> No dia seguinte, a placa de YPD réplica em placas de 5-FOA (5-FOA placas são feitas, como descrito no Manual de levedura Cold Spring Harbor) 13. </li><li> Permitir o crescimento de 2-4 days, e restreak pelo menos 5-10 colónias em meio YPD. Realizar PCR de colónias, utilizando os iniciadores do quadro 1 e a sequência para verificar a inserção. </li></ol> 2. Criação de ATF plasmídeo repórter <ol><li> Determinar o sítio de ligação do ATF (maior probabilidade de vir a partir da literatura). </li><li> Ordem desejada região de ligação como oligos (ou Ultramers, se necessário). Encomende como superior e fios de fundo com saliências corretos para NotI e XbaI, como mostrado na Tabela 2. </li><li> Diluir oligos para concentrações equimolares (100 uM). </li><li> Fosforilar usando polinucleótido cinase de T4 e, em seguida, recozer num termociclador. As condições de reacção estão na Tabela 3. </li><li> Digest ~ 1-2 ug de pMN8 com NotI-XbaI de HF e durante 1 hora a 37 ° C (condições de reacção do Quadro 4). </li><li> Gel purificar a banda backbone. </li><li> Dilui-se a espinha dorsal purificada a 10 ng / mL. </li><li> Dilua a cadeia dupla, fosforilated local de ligação 5x a concentração molar da espinha dorsal por ul. </li><li> Utilizando ligase de ADN T4, ligadura dos sítios de ligação para o backbone digerida à temperatura ambiente durante 30 minutos (Quadro 5). </li><li> Para a transformação, adicione metade da reação de ligação para 50 mL de padrão, Escherichia coli quimicamente competentes, tais como XL1-Blue ou DH5-Alpha. </li><li> Células de choque térmico durante 45 segundos num banho de água a 42 C ° e, em seguida, colocar em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 900 ul de meio SOC a reacção de transformação. </li><li> Crescer a 37 ° C durante 1 hora, num tambor de rolos. </li><li> Espalhe 100-200 células por uL de LB + Amp (100 ug / ml) da placa e incubar durante a noite. </li><li> Cresce E. coli em meio LB + AMP ADN plasmídeo líquido e colheita. Seqüência verificar novo plasmídeo repórter do colônias laqueadura com o primer 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Transformar novo plasmídeo repórter em contendo ATF levedura strain da Seção 1, usando a transformação acetato de lítio. </li></ol> 3. Quantificar o efeito da ATF indução na expressão do gene GFP Usando Reporter Preparação das amostras: <ol><li> Adicione 25 mM estoque β-estradiol (10 ml de etanol + 0,0681 g de β-estradiol). Mantenha refrigerado. </li><li> Crescer ATF + Reporter contendo tensão durante a noite em 5 ml SC-URA. </li><li> Obter nove frascos de 250 ml agitar e adicionar 25 ml SC-URA para cada um. </li><li> Adicionar 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM, ou 10 pM β-estradiol. Isso é mais facilmente feito através de diluições em série de 10 vezes de o estoque de β-estradiol 25 mM. Para uma concentração final de 10 uM β-estradiol, adicionar 10 ul de estoque β-estradiol a 25 mM e 25 ml de SC-URA. </li><li> Adicionar 125 ul de culturas de uma noite de frascos (1:200 de diluição). </li><li> Para os restantes dois frascos, inocular com uma produção de GFP strai constitutivan e uma estirpe sem GFP. Estes são necessários para a calibração do citómetro de fluxo. </li><li> Agitar a 200 rpm a 30 ° C durante 12-18 horas. Nota: O tempo de incubação óptimo é determinado pela identificação de indução GFP quando não altera a seguir à adição de β-estradiol. </li><li> Tome 500 mL de cada cultura e girar em tubos de 1,7 ml de microcentrífuga separados. </li><li> Aspirar SC-URA. </li><li> Lavar uma vez em 1 ml de PBS 0,1% Tween-20 e aspirado. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS 0,1% Tween-20 e ressuspender. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 para tubos Falcon. </li><li> Adicionar as células ressuspensas para tubos de 5 ml (volume final = 2 mL) (podem ser armazenados a 4 ° C durante vários dias). </li><li> Opcional: células sonicate levemente para separação quaisquer células agregada. A citometria de fluxo análise: Resumo: A fluorescência de 10.000-100.000 células normalmente é analisado por amostra. Os dados podem ser processadas em FlowJo ou usando scripts personalizados em MATLAB ouR. Certifique-se de calibrar a tensão do canal de GFP utilizando controles GFP positivos e negativos. Uma vez que os ficheiros de FCS são exportados, um roteiro tal como o mostrado na Figura 6, juntamente com as funções (fca_readfcs <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> ) pode ser usado para processar o dados. </li><li> Realizar citometria de fluxo. <ol><li> Use dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC) para identificar células de levedura. </li><li> Defina a taxa de fluxo para ~ 3.000 células / seg. </li><li> Meça GFP (canal ITCF). </li><li> Uma vez que os dados são coletados, de exportação. FCS arquivos </li></ol></li><li> Carregar MATLAB. </li><li> Mova os arquivos. FCS, fcs_readfcs.m, e um script semelhante ao da Figura 6 para a mesma pasta. </li><li> Alterar o atual diretório de trabalho para a pasta que contém os dados e scripts. </li><li> Execute o script a partir da Figura 6 (nota: olenda foi digitado manualmente para produzir o que é visto na Figura 7). </li></ol> 4. Quantificar o efeito da ATF indução no crescimento celular <ol><li> De estoques congelados, raia fora tanto (1) uma cepa contendo ATF e (2) uma cepa falta ATF (como yMN15) em placas de YPD separados. </li><li> Após 2 dias de crescimento, inocular tubos de cultura separados contendo 5 ml de meio YPD líquido com cada uma das estirpes e crescer durante a noite a 30 ° C. </li><li> Realizar 10 diluições em série de uma solução de estoque mM β-estradiol 0,25 até 10.000 vezes (0.025 uM β-estradiol) em etanol a 100%. </li><li> Adicionar 40 ul de culturas de uma noite de 10 ml de líquido de YPD (1-250 diluição). </li><li> Para cada estirpe, adicionar 96 ul de células diluídas para 18 cavidades de uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar 4 mL de β-estradiol para as células. Um ponto essencial é certificar-se cada poço tem a mesma quantidade de etanol total. (Alternativamente, um mo<html> re Estoque concentrado de β-estradiol podem ser utilizados e subsequentemente diluída até ao ponto do efeito do álcool sobre o crescimento não é mensurável). </li><li> Realiza-se em triplicado. Três dos poços para cada cepa deve ser de etanol somente controles. </li><li> Cobrir a placa de 96 poços na membrana permeável ao gás. </li><li> Monitorar o crescimento (OD 600) no leitor de placas. </li><li> Quantificar as taxas de crescimento, utilizando qualquer número de métodos standard, tais como encontrar o declive máximo. Nota: Nós tivemos um bom sucesso com o open source software grofit 14, que é executado no ambiente de programação R Vale ressaltar que, embora as taxas de crescimento calculadas a partir de ensaios de placa de 96 poços em relação a agitar-frascos (25 ml culturas). não são necessariamente os mesmos (devido a diferenças na fisiologia e na instrumentação), temos observado que as taxas de crescimento relativo são similares (embora isso nem sempre pode ser o caso). </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Criar induzíveis Genomic alelos <ol><li> Obter pMN10, um plasmídeo com o promotor noncentromeric ATF-responsivo de pMN8 fundido com KanMX (na orientação oposta). </li><li> Restrição digerir a espinha dorsal do vetor e extrato de gel como na Seção 2. </li><li> Anneal, fosforilam e oligos ligadura contendo sítios de ligação apropriadas conforme descrito na Seção 2. </li><li> Sequência de verificar. Este plasmídeo será agora servir como um molde de ADN para criar o alelo indutível. </li><li> Obter a estirpe de levedura que expressa o ATF correspondente de interesse. </li><li> PCR amplificar a cassete KanMX-Promotor (~ 2 kb), utilizando os iniciadores a partir da Tabela 6. </li><li> Transformar o produto de PCR para a estirpe que expressa ATF usando o método do acetato de lítio. </li><li> Placa em YPD e placa réplica em YPD + G418 no dia seguinte. </li><li> Confirmar a inserção apropriada do promotor utilizando o iniciador directo (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) e um iniciador interno reverso para poe gene cujo promotor foi substituído. O iniciador reverso é tipicamente concebida para estar entre 200-300 pb a jusante do primeiro ATG 15. O produto de PCR final é de aproximadamente de 1,2 kb. </li></ol>

<ol><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic acids res. 41, e57(2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131, 129-134 (1993).</li>
<li>Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+oestrogen+receptor+ligand-binding+domain+as+an+improved+switch+for+the+regulation+of+heterologous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins.</a> Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Analysis+of+mRNA+Molecules+Using+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Vis. Exp. (76), e50382(2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).</li>
<li>Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activator%2Frepressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+aryl+hydrocarbon+receptors+for+bioassay+of+aryl+hydrocarbon+receptor+ligands+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).</li>
<li>Hickman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+sulfur+and+phospholipid+metabolism+reflects+the+importance+of+methylation+in+the+growth+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).</li>
<li>Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+protein+depletion+by+genetically+controlled+deprotection+of+a+dormant+N-degron%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 267(2009).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nat. methods. 6, 917-922 (2009).</li>
<li>Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+DJ+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , (2005).</li>
<li>Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((grofit%3A+Fitting+Biological+Growth+Curves+with+R%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Stat.+Softw%22%5BJournal%5D)">grofit: Fitting Biological Growth Curves with R.</a> J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).</li>
<li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).</li>
<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150, 647-658 (2012).</li>
<li>Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+specific+receptor-ligand+pairs+for+use+in+the+creation+of+gene+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).</li>
<li>McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+orthogonal+ligand+specificity+in+a+single+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold.</a> Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).</li>
<li>Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+pathways+that+couple+cell+growth+and+division+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast.</a> Science. 297, 395-400 (2002).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol. cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+biotechnol%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).</li>
<li>Losi, A., Gartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+chromophores%2C+new+photoactivation+paradigms%2C+trendy+applications%3A+flavins+in+blue+light-sensing+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors.</a> Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+biotechnol%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).</li>
</ol>

McIsaac, Noyes, e Botstein (com os outros) apresentaram parte desse sistema como uma divulgação de Patentes.

Os interruptores com base de hormonas aqui descritas ter múltiplas aplicações, a partir do estudo da biologia celular nativo para testar a capacidade de um domínio de ligação ao ADN de interesse para alvejar uma sequência de ADN in vivo. O sistema tem muitas características desejáveis, incluindo uma resposta graduada para indutor, ação rápida, e regulação apertada (ie. Leakiness não mensurável, ver Figura 7). No entanto, ainda há espaço para melhorias e expansão. Trabalhos recentes em biologia sintética tem enfatizado sistemas sintéticos de multiplexação e ampliando o repertório de bem caracterizados, peças de DNA programáveis ​​16. Independente expressão condicional de genes-alvo distintos requer ambos os vários indutores e domínios de ligação ao DNA que não têm sobreposição de especificidade. A disponibilidade de receptores de engenharia e naturais fornece um grande conjunto de peças com as quais a desenvolver novos fatores de transcrição artificial. Expansão darepertório de interruptores ortogonais entre si, foi muito facilitada pela evolução dirigida aproxima 17,18. Os esforços actuais para reprogramar a especificidade de ligação ao ligando dos nossos factores de transcrição artificiais serão apresentados no futuro. Anteriormente, as conseqüências fenotípicas de gene exclusão / superexpressão têm sido extensivamente estudadas em leveduras 19,20. No entanto, isso não tem sido fácil para estudar o efeito da expressão em diferentes fenótipos longo de uma gama de níveis de expressão. Uma característica principal do sistema aqui apresentado é a sua natureza graduada (Figura 8). Embora muitas vezes assumida, a relação entre a expressão dos genes e fenótipos de interesse pode não ser necessariamente monótona. Fatores de transcrição artificiais, como Z e Z 3 EV 4 EV vai tornar a tarefa de ensaiar as respostas fenotípicas para mudanças na expressão gênica direta. Finalmente, os protocolos de discutired no texto são em engenharia e caracterizar factores de transcrição artificiais que respondem a β-estradiol, no entanto, uma importante alternativa para domínios quimicamente sensíveis é a utilização de domínios de luz que respondem a (tais como o PhyB/Pif3, LOV e BLUF), cujas atividades são reversíveis sem ter que perturbar o meio de crescimento da cultura 21-23. Sistemas baseados em Luz facilitar o controle espaço-temporal da expressão gênica, interações proteína-proteína, transporte de íons, e atividade enzimática, que já provaram poderoso 21-26. Em conclusão, nós apresentamos os métodos para a rápida construção de factores de transcrição indutíveis, artificiais em levedura. Este protocolo fornece um modelo para a construção em conjunto com os repórteres GFP cognato, bem como métodos para a análise dos dados repórter usando citometria de fluxo e ensaio do efeito de activação de ATF em crescimento.

Desenvolvimento de interruptores genéticos em leveduras é de grande interesse na pesquisa, tanto acadêmica e industrial. No caso ideal, interruptores genéticos pode ser usado para activar um gene particular (ou o conjunto de genes) apenas quando desejado pelo experimentador. Uma sequência de codificação do gene colocado a jusante de um promotor sintético que não é expressa na ausência de uma molécula de indução: depois da adição do indutor do gene deve ser expresso rapidamente. Foi recentemente demonstrado que uma tal mudança pode ser manipulada em levedura, em que, na ausência do indutor, a estirpe exibe um fenótipo de supressão, mas na presença de indutor, a expressão é activada em proporção com o nível de indutor em todas as células 1,2. Historicamente, os sistemas de expressão condicional em leveduras têm dependido pesadamente sobre seqüências de DNA em nutrientes sensível, incluindo o MET, PHO, e promotores GAL (cujas atividades são sensíveis aos níveis extracelulares de metionina, fosfato egalactose, respectivamente). Enquanto expressão condicional pode ser alcançado, ele vem com o custo de efeitos pleiotrópicos significativos. Receptores hormonais, tais como os receptores de estrogênio humanos provaram ser eficazes interruptores em eucariotos 3,4. Na ausência de hormona, uma proteína fundida a um receptor hormonal pode ser sequestrado no citoplasma onde interage com o complexo Hsp90 chaperone. Após a ligação do ligando apropriado, o receptor sofre uma alteração conformacional, fazendo com que seja libertada a partir do complexo Hsp90 chaperone e revelando um sinal de localização nuclear. Para observar a dinâmica de localização de uma determinada proteína contendo o receptor da hormona, foi criada uma fusão C-terminal do Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, um factor de transcrição sintética, contendo o domínio de ligação ao ADN Gal4p, o domínio de ligação ao ligando do receptor estrogénio humano , e VP16) com GFP 2. A localização nuclear foi observada a cerca de 8 minutos após a adição dequantidades saturantes do indutor, ß-estradiol, para o tipo selvagem de levedura é completamente inerte. Por esta altura, a maioria das células têm sítios de transcrição activas claramente visíveis para os genes alvo (GEV ensaiadas através de hibridação in situ fluorescente), bem como os ARNm totalmente maduros 2,5. Genes-alvo GEV aumento na expressão&gt; 2 vezes dentro de 2,5 min 2,6 (medido utilizando microarrays), demonstrando que leva &lt;2,5 min para o activador quimérico para translocar para o núcleo, ligar ao ADN e activar a transcrição. Enquanto vários outros on-chaves foram aplicadas em leveduras que utilizam várias moléculas pequenas ou drogas (incluindo as opções de base em doxiciclina clássicos da Escherichia coli 7,8 e um switch baseado em indigo 9 de Arabidopsis thaliana), nenhum alcançaram a velocidade, especificidade, ou aperto da regulação exibida pelos interruptores à base de hormônios. Vale ressaltar tchapéu rápida fora dos interruptores, também têm sido desenvolvidas na levedura, e normalmente funcionam por fusão de um gene para uma protease ou ubiquitina ligase sequência de direccionamento 2,10,11,12. A capacidade de remover rapidamente uma proteína alvo a partir da célula facilita o estudo de genes essenciais, bem como os genes que são propensas a supressão genético quando apagados 10. Os métodos descritos neste protocolo são para a construção e caracterização sintética on-chaves em levedura. Primeiro, vamos mostrar como gerar rapidamente as proteínas de fusão genomically integrados constituídos por um domínio de ligação ao DNA de interesse, a ligação do ligante de domínio do receptor de estrógeno humano e VP16 (DBD-EV). Conforme o protocolo, a proteína de fusão é expressa a partir de um promotor ACT1. Em seguida, mostramos como criar um plasmídeo repórter cognato para o ATF e testar sua funcionalidade usando citometria de fluxo. Embora prevemos estes plasmídeos repórter sendo usado com novas ATFs (Figura 1), que pode be utilizado como repórteres para um activador da transcrição nativo bem. Finalmente, os detalhes para testar o efeito de activação do ATF no crescimento celular em placas de 96 poços e para a engenharia de alelos genómicas indutíveis são fornecidos.

<table><tbody><tr><td>Nome da empresa de reagentes</td><td></td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários&nbsp;</td></tr><tr><td>Expandir Sistema de PCR de Alta Fidelidade</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Competente E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de lítio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeos pMN8 e pMN10; cepa de levedura yMN15</td><td>Noyes ou Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>Equipamento Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Citômetro de Fluxo LSRII&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Vários Modelos</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB ou FlowJo</td><td>MATLAB ou FlowJo</td><td></td><td>Software para análise . Arquivos FCS de experimentos de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>R</td><td>Código aberto</td><td></td><td>Para analisar dados de taxa de crescimento do leitor de placas.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml Eppendorf&nbsp; Tubos</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de agitação de 250 ml</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 96 poços Leitor de</td> placas <td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>(Leitor de placas multimodo Synergy H1)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Membranas Breathe-Easy</td><td>Termociclador Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>várias</td><td>empresas</td><td>Vários modelos</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura pó</td><td>MP Biomedicals</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

síntese rápida e triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em gfp

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

A biologia sintética visa racionalmente projetar e construir circuitos sintéticos com propriedades quantitativas desejadas, bem como fornecer ferramentas para interrogar a estrutura dos circuitos de controle de origem. Em ambos os casos, a capacidade de programar a expressão do gene de uma forma rápida e sintonizável, sem efeitos fora do alvo, podem ser úteis. Foram construídas estirpes de levedura contendo o promotor a montante ACT1 de uma cassete URA3 seguido pelo domínio de ligação ao ligando do receptor estrogénio humano e VP16. Ao transformar essa tensão, com um produto de PCR linear contendo um domínio de ligação ao ADN e de selecção contra a presença de URA3, um factor de transcrição artificial constitutivamente expresso (ATF) podem ser gerados por recombinação homóloga. ATFs modificadas desta forma podem activar um gene alvo único, na presença de indutor, eliminando assim tanto a activação fora do alvo e das condições de crescimento não fisiológicas encontrados com condiciona utilizadaOs sistemas de expressão de genes onal. Um método simples para a rápida construção de plasmídeos repórter GFP que respondem especificamente a um factor de transcrição nativo ou artificial de interesse também é fornecido.

<html> A Figura 5 mostra a indução de GFP por Z 3 EV, Z 4 VE, ou GEV ao longo do tempo. Notar o aumento na produção de GFP em resposta aos ATFs contendo ADN nonyeast domínios de ligação. Recentemente, especulou que isto resulta a partir destes factores alcançar especificidade de um único gene no genoma de levedura 1. GEV indução por si só conduz à activação / repressão de centenas de genes, enquanto que Z 3 e Z 4 VE VE apenas activar a expressão de um gene alvo colocado a jusante de um promotor sintético que contém os locais de ligação adequados (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;e 5&#39;- GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, respectivamente), 1. Figura 7 demonstra a regulação apertada do sistema (não há resultados indutor em não detectável GFP) e todas as células que se induzida em resposta ao indutor A capacidade de Z 3 EV para induzir GFP através de uma variedade de concentrações β-estradiol é mostrado na Figura 8. <html> ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Figura 1. Factores de transcrição artificiais interagir com Hsp90 na ausência de β-estradiol. Quando β-estradiol se liga com o ATF, Hsp90 dissocia, permitindo que o ATF para entrar no núcleo e activar a expressão a partir do plasmídeo repórter. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemática do protocolo para as estirpes de engenharia que contêm fatores de transcrição artificiais e construção / testando repórteres GFP cognatos. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. A sequência ACT1pr-URA3-VE na estirpe yMN15 no locus LEU2. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Figura 4. Desenho de primers de PCR para a amplificação de um domínio de ligação de ADN de interesse com uma homologia de sequência adicional para gerar uma nova proteína de fusão quando transformado com sucesso em yMN15. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figura 5. Indução GFP por três pares de ATF-promotores diferentes em resposta a 1 uM β-estradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figura 6. Um script MATLAB para o fluxo de processamento de dados de citometria. Este roteiro foi adaptado de <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figura 7. Indução de GFP por Z 3 EV em resposta a 0 μ M β-estradiol e 1 uM β-estradiol seguinte de 18 horas de indução. Fluorescência foi também meamedido a partir de células sem GFP para ilustrar a forte regulamentação do sistema Z 3 EV. Esta figura foi gerada usando o código na Figura 6. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figura 8. A relação entre a concentração de indutor e saída de expressão é classificada com um coeficiente de Hill de 1 ~. (A) As distribuições de expressão da GFP como uma função da concentração de β-estradiol. (B) O valor médio de fluorescência das distribuições de (A). Os dados foram ajustados à função G (D) = L + min (L-L max min) D n / (n + K D n) onde D é a dose β-estradiol, L min e G são o máximo e mínimo valores máximos GFP, respectivamente, n é o coeficiente de Hill, e K é a dose β-estradiol que produz ½ (L max + L min). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Seqüência de oligonucleotídeos </td><td> Nome </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Verifique Encaminhar </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD check Reversa </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Primers para confirmar fusão correcta de DBD de interesse para o receptor de estrogênio. O iniciador directo é homóloga do promotor ACT1 e o iniciador reverso é homólogo ao receptor de estrogénio. Para DBDs típicas (~ 300 pb), o produto de PCR é &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Seqüência de oligonucleotídeos </td><td> Nome </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... Local binging DBD ... t-3 &#39; </td><td> Top oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... sítio de ligação do DNA reverter ... gc-3 &#39; </td><td> Oligo inferior </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x Zif268 Sites Encadernação </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Oligo inferior + 6x Zif268 Sites Encadernação </td></tr></tbody></table> Tabela 2. STRUTURA de primers para a criação de dsDNA contendo sítios de ligação de interesse. Para criar a Z 3 EV-responsive promotor, os oligonucleotídeos Top oligo + 6x Zif268 sítios de ligação e oligo inferior + 6x Zif268 foram usados ​​Binding.Seqüências para criar as saliências de DNA corretas estão em minúsculas. O sítio de ligação consenso Zif268, GCGTGGGCG, é sublinhado no top oligo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Tampão de quinase de polinucleótido T4 </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Polinucleotídeo cinase de T4 (@ 10.000 unidades / ml) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Topo de oligo (100 uM) </td><td> 1,5 mL </td></tr><tr><td> Oligo inferior (100 uM) </td><td> 1,5 mL </td></tr><tr><td> Água </td><td> 41 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Fosforilar e iniciadores de recozimento em um termociclador utilizando 50 ul de reacção descrito acima. Existem duas etapas termociclador. Passo 1: 37 ° C, 30 min (fosforilar), e Passo 2: 95 ° C 30 seg (descer 1 ° C em cada 30 segundos até a 4 ° C; hibridação). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> XbaI </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Notl-HF </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> O DNA de plasmídeo </td><td> 5 ul (1-2 ug) </td></tr><tr><td> 10x Cut inteligente de buffer </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Água </td><td> 38 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Digestão de restrição do plasmídeo pMN8 com Xbal e Notl. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reagente </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Quantidade </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 ligase Buffer </td><td> 2 ul </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 ligase </td><td> 0,2 mL </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / mL </td><td> 1 ul </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Encadernação Seqüências @ 5x molar concentração / mL </td><td> 1 ul </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Água </td><td> 15,8 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 5. Ligadura sítios de ligação para o DNA de plasmídeo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Cartilha </td><td> Descrição </td></tr><tr><td> ~ 40 pb a montante do ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Cartilha para a frente para amplificar KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-inversa do complemento (ATG + ~ 37BP) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Reverter primer para amplificar KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Cartilha para a frente para fazer troca GCN4 promotor. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Reverter cartilha para fazer troca GCN4 promotor. </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Amplificar por PCR KanMX-Promotor para fazer alelo titratible.

Este protocolo descreve o procedimento experimental para a rápida construção de factores de transcrição artificiais (ATFs) com repórteres GFP cognatas e quantificação da capacidade ATFs para estimular a expressão de GFP por meio de citometria de fluxo.

Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

O objetivo geral deste procedimento é criar, testar e validar fatores de transcrição artificiais geneticamente codificados e indutíveis, ou ATF, com especificidade desejada. Isso é realizado primeiramente criando o ATF por meio de uma simples transformação em levedura, na qual a inclusão de um produto de PCR do domínio de ligação ao DNA resulta em uma fusão em quadro de leitura com um receptor de estrogênio humano e VP16. O segundo passo do procedimento consiste em criar um plasmídeo repórter GFP para o ATF substituindo os sítios de ligação no plasmídeo PMN8 por sequências-alvo do fator de transcrição.O terceiro passo do procedimento é testar a capacidade dos ATF de ativar o repórter GFP e também avaliar seu efeito na fisiologia da levedura mediante a medição da taxa de crescimento. O passo final do procedimento é utilizar um TF validado para expressar condicionalmente um alvo genômico nativo. Em última instância, qualquer gene de interesse pode ser tornado condicionalmente ativo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a indução mediada por galactose da expressão gênica, é que a indução seletiva pode ser alcançada sob diversas condições nutricionais e fisiológicas, sem efeitos pleiotrópicos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia de leveduras por meio da introdução rápida e reversível de produtos gênicos desejados, permitindo o estudo tanto de ganho quanto de perda de função. Para começar, amplifique por PCR o domínio de ligação ao DNA ou DVD de interesse utilizando uma polimerase de alta fidelidade.Transforme mais de um micrograma do produto de PCR purificado em levedura utilizando o método de acetato de lítio. Após a transformação, centrifugue as células em velocidade máxima por 15 segundos em uma microcentrífuga, remova a mistura de transformação e reconstitua as células em aproximadamente 200 microlitros de água estéril antes de semear em extrato de levedura. No dia seguinte, plaque em meio peptona-dextrose ou YPD e, em seguida, replique de YPD para cinco placas de ácido fluororacético.Após o crescimento por dois a quatro dias, replique pelo menos cinco a 10 colônias em YPD. Em seguida, realize uma PCR de colônia utilizando os iniciadores descritos no protocolo e faça o sequenciamento para verificar a inclusão. Dilua os oligonucleotídeos da região de ligação desejada para concentrações equimolares.Fosforile a região de ligação utilizando a cinase de polinucleotídeo T4 e, em seguida, um termociclador neo de acordo com as condições da reação descritas no protocolo. Em seguida, digira aproximadamente um a dois microgramas de PMN8 com NotI-HF e XbaI por uma hora a 37 graus Celsius em gel.Limpe a faixa do esqueleto e dilua o esqueleto purificado para 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, dilua o sítio de ligação fosforilado de dupla fita para cinco vezes a concentração molar do esqueleto por microlitro. Usando a ligase de DNA T4, ligue os sítios de ligação ao esqueleto digerido à temperatura ambiente por 30 minutos.Realize a transformação adicionando metade da reação de ligação a 50 microlitros de células de EIA coli quimicamente competentes padrão e siga o procedimento descrito no protocolo textual. Após recuperar as células, adicione de 100 a 200 microlitros das células por placa luria berti ou lb mais ampicilina e incube durante a noite. No dia seguinte, cultive o e coli em meio líquido lb mais ampicilina e extraia o DNA plasmidial conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, faça a verificação por sequenciamento do novo plasmídeo repórter a partir de colônias de ligação. Por fim, transforme o novo plasmídeo repórter na linhagem E contendo o Fator de Transcrição (A TF) utilizando transformação com acetato de lítio. Para iniciar, cultive uma linhagem contendo o Fator de Transcrição mais o repórter durante a noite em cinco mililitros de meio sintético completo desprovido de uracila.Obtenha 9 frascos agitadores de 250 mililitros e adicione 25 mililitros de SC sem URA a cada um. Em seguida, prepare sete dos frascos com diferentes diluições de beta-estradiol conforme listado no protocolo descrito no texto, a partir de diluições seriadas de dez vezes de um estoque de beta-estradiol 25 milimolar, adicionando 125 microlitros das culturas de crescimento noturno a esses sete frascos. Para os dois frascos restantes, inocular com uma linhagem produtora constitutiva de GFP e uma linhagem que não possui GFP. Essas são necessárias para calibrar o citômetro de fluxo.Agite o frasco a 200 RPM e 30 graus Celsius por 12 a 18 horas. Em seguida, retire 500 microlitros de cada cultura e centrifugue em tubos einor separados de 1,7 mililitro. Após a aspiração do sobrenadante, lave as células sedimentadas uma vez com tampão de citometria de fluxo, depois reconstitua as células em um mililitro do mesmo tampão.Em seguida, adicione um mililitro de tampão para citometria de fluxo a nove tubos Falcon dois. Adicione as células ressuspendidas aos tubos Falcon contendo o tampão, para um volume final igual a dois mililitros. Por fim, realize a citometria de fluxo.Utilize dispersão frontal e dispersão lateral para identificar células de levedura. Ajuste a taxa de fluxo para aproximadamente 3000 células por segundo. Meça a GFP através do canal 50 e prossiga conforme o protocolo descrito no texto: a partir de estoques congelados, plaque separadamente uma linhagem contendo o fator de transcrição A e uma linhagem que não possui o fator de transcrição A em meio YPD. Após dois dias de crescimento, inocular tubos de cultura separados contendo cinco mililitros de meio líquido YPD e cultivar cada linhagem durante a noite a 30 graus Celsius.Realize diluições seriadas de dez vezes de uma solução estoque de beta-estradiol 0,25 milimolar até 10.000 vezes em etanol 100%. Adicione 40 microlitros de cada cultura mantida durante a noite a 10 mililitros de meio líquido YPD. Para cada linhagem, adicione 96 microlitros das células diluídas a 18 poços de uma placa de 96 poços.Em seguida, adicione quatro microlitros de beta-estradiol às células. Um ponto essencial é garantir que cada poço tenha a mesma quantidade total de etanol. Realize uma triplicata com três poços para cada linhagem, utilizando apenas etanol.Controles cobrem a placa de 96 poços com uma membrana permeável a gases. Monitore o crescimento em uma densidade óptica de 600 nanômetros em um leitor de placas. Quantifique as taxas de crescimento usando qualquer um dos diversos métodos, como determinar a inclinação máxima.Após preparar o plasmídeo conforme instruído no protocolo textual de PCR, amplifique o cassete do promotor can MX. Transforme o produto de PCR em uma linhagem que expressa A TF utilizando o método de acetato de lítio, plaque as células transformadas em YPD e replique o plaqueamento em YPD acrescido do antibiótico G418 no dia seguinte. Por fim, confirme a inserção apropriada do promotor utilizando uma ponta marcadora (primer) direta e uma ponta marcadora reversa localizada internamente ao gene cujo promotor foi substituído.O produto final da PCR tem aproximadamente 1,2 KB. Aqui é mostrada a indução de GFP por três pares diferentes de promotores de TF: Z four EVZ, three EV ou GEV ao longo do tempo em resposta a um micromolar de beta-estradiol. Observe o aumento na produção de GFP em resposta aos ATF contendo domínios de ligação ao DNA não derivados de levedura. Isso pode resultar do fato desses fatores alcançarem especificidade para um único gene no genoma de levedura.A indução por GEV isoladamente leva à ativação ou repressão de centenas de genes, enquanto Z três EV e Z quatro EV apenas ativam a expressão de um gene alvo posicionado a jusante de um promotor sintético contendo sítios de ligação apropriados. Aqui, é mostrada a indução de GFP por Z três EV em resposta a zero nanomolar de beta-estradiol e a um micromolar de beta-estradiol após 18 horas de indução. A fluorescência também foi medida em células que não possuem GFP para ilustrar a regulação rigorosa do sistema Z três EV. A capacidade de Z três EV de induzir GFP ao longo de uma faixa de concentrações de beta-estradiol é mostrada aqui.A fluorescência média das distribuições revela que a relação entre a concentração do indutor e a saída de expressão é graduada, com um coeficiente de Hill de aproximadamente um, indicando ligação independente do Z três EV. Após este procedimento, outros métodos, como microarranjos de expressão gênica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como a alteração da expressão de um único gene afeta os padrões genômicos de expressão gênica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar, testar e validar a eficácia de fatores de transcrição artificiais. Esses fatores de transcrição artificiais controlam condicionalmente a expressão de genes posicionados a jusante de sequências-alvo de DNA apropriadas.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Com o transportador ABC de murino Bcrp1 (ABCG2) como um exemplo, in silico protocolos são apresentados para detectar alternativos de utilização do promotor nos genes expressos em tecidos de ratinho, e para avaliar a funcionalidade dos promotores alternativos identificados utilizando ensaios de repórter.

Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de &gt; 1.000 TFs em uma única experiência.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Este estudo descreve um método para experimentos de alto rendimento usando uma matriz de LED impressa em 3D para otimizar a expressão gênica induzível por luz em células HEK293T.

Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Geração de humanos CD40-activated células B

Aprenda a sintetizar e testar fatores de transcrição artificial induzíveis quimicamente em levedura usando GFP. Este método permite expressão condicional de genes com controle preciso e reversível.

Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP

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