Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica

O objetivo geral deste protocolo é fornecer células-tronco progenitoras neurais ao SNC por meio de injeção intravenosa em camundongos afetados por encefalomielite autoimune experimental, um modelo de doença que imita a esclerose múltipla. Isso é feito primeiro derivando células-tronco progenitoras neurais, ou NPCs, da zona subventricular do cérebro de camundongos adultos. O segundo passo é marcar geneticamente NPCs com tecnologia de vetor viral para identificação e rastreamento de células in vivo.

Em seguida, as neuroesferas em proliferação são dissociadas em uma única suspensão celular, ressuspensas na densidade desejada e injetadas na veia da cauda de camundongos EAE no pico da doença. Em última análise, a patologia post-mortem de órgãos e tecidos e a imuno-histoquímica são realizadas para identificar e caracterizar a distribuição de sobrevivência e integração de células-tronco injetadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método minimamente invasivo, seguro e eficaz para transplantar células-tronco e progenitoras para o sistema nervoso inflamatório.

Este método ajuda a responder a três questões-chave relacionadas à segurança e eficácia das células-tronco injetadas sistemicamente em modelos de doenças inflamatórias do sistema nervoso. A demonstração visual deste método é útil especialmente para jovens cientistas, pois ajuda na compreensão das etapas experimentais críticas, desde o isolamento das células-tronco cerebrais até a preparação para a injeção sistêmica em um modelo de camundongo para esclerose múltipla. Usando técnica estéril adequada.

Coloque um cérebro recém-isolado em uma matriz de fatiamento cerebral. Use duas lâminas de barbear para produzir cortes coronais, a dois milímetros do pólo anterior do cérebro, excluindo os rastros ópticos e três milímetros posteriores ao corte anterior. Coloque as fatias de cérebro em uma placa de Petri limpa e trabalhe sob um microscópio de dissecação para isolar o tecido da zona subventricular.

Depois de picar o tecido, adicione-o a 30 mililitros de solução de digestão previamente preparada e filtrada. Agite suavemente e incube por 30 minutos, agitando a cada 15 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de crescimento completo.

Meio ou CGM por pipetagem. Primeiro com uma pipeta P 1000 e depois com uma pipeta P 200. Quando uma suspensão de célula única for alcançada, aumente para cinco mililitros com CGM e transfira para um novo frasco.

Coloque as células em uma incubadora e permita que as neuroesferas se formem por cinco a sete dias. Quando estiver pronto, recolher a suspensão num tubo de 15 mililitros e centrifugar. Remova o sobrenadante e ressuspenda o palato em 200 microlitros de CGM.

Dissocie as neuroesferas mecanicamente, passando-as por uma ponta de pipeta P 200 100 a 150 vezes. Aumente a suspensão para um mililitro com CGM. Em seguida, dilua a suspensão com precisão.

Misture o volume apropriado com uma coloração vital e encha um hemocitômetro para determinar a contagem de células. Ressuspender as células na concentração correcta e transferir para um novo balão. Repita essas etapas a cada quatro a cinco dias para ajudar na identificação de células transplantadas in vivo.

Os NPCs são transduzidos com vetores virais que codificam genes repórteres 72 horas após a transdução do NPC. A expressão de genes repórteres fluorescentes é verificável por imunofluorescência ou citometria de fluxo. Quando estiver pronto, colha as neuroesferas que expressam GFP por centrifugação e remova o sobrenadante.

Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de dissociação de agregados celulares e incube por 10 minutos. Recupere as células e ressuspenda-as suavemente para obter uma única suspensão celular. Tomando cuidado para evitar bolhas de ar.

Depois de contar e diluir as células, mantenha a suspensão celular no gelo até que esteja pronta para uso. Quando as neuroesferas estiverem prontas, recupere os camundongos que foram previamente preparados para servir como modelo de camundongo para o SNC. O tratamento de danos deve ocorrer no pico da expressão da doença.

Comece colocando os ratos em uma caixa de aquecimento por cerca de 10 minutos para permitir que a veia da cauda se dilate. Quando estiver pronto, transfira um mouse da caixa de aquecimento para um limitador de mouse. Feche o limitador para restringir o movimento e isolar a cauda.

Esterilize a área de injeção na cauda com uma solução tópica apropriada. Encha uma seringa de insulina de um mililitro com 150 microlitros de suspensão celular e certifique-se de remover todas as bolhas. Localize a veia na superfície dorsal da cauda e posicione a agulha paralelamente à veia na parte inferior média da cauda.

Aqui a veia está mais próxima da superfície da pele. Facilitando assim o procedimento. Insira suavemente a agulha na veia, garantindo sua posição correta, retirando alguns microlitros de sangue.

Em seguida, injete lentamente a solução na veia da cauda Após a injeção, remova a agulha e aplique pressão por alguns segundos para retardar o sangramento. Coloque o mouse em uma gaiola nova e monitore até que esteja recuperado. Repita o mesmo procedimento para todos os camundongos em pontos de tempo experimentais predeterminados.

As amostras são coletadas de animais tratados e controle e analisadas para determinar a infiltração e integração de NPCs no SNC e outros tecidos quando proliferam como neuroesferas NPCs expressam marcadores de atividade mitótica, como fosfohistona H três mostrada em verde e de células neurais indiferenciadas como ninho mostrado em vermelho quando plaqueado sob condições de diferenciação apropriadas, Os NPCs expressam marcadores típicos das três linhagens neurais, como o marcador astroglia, GFAP, o marcador neuronal, a proteína microtubular associada dois e os marcadores oligo dyl glial O quatro e os núcleos da proteína básica de mielina são contra-corados com MPCs indiferenciados dpi que devem ser terapeuticamente eficazes após o transplante devem expressar moléculas de adesão à superfície celular que incluem CD 44 e a subunidade alfa quatro do antígeno quatro muito tardio. Esses exemplos mostram que os NPCs transduzidos expressam GFP, tanto como neuroesferas em proliferação quanto quando se diferenciam in vitro após a retirada do fator de crescimento. NPCs singênicos injetados sistemicamente em camundongos EAE são encontrados quase exclusivamente em áreas perivasculares de danos no SNC indicados pelas setas no cérebro e na medula espinhal até 45 dias após o transplante.

Uma etapa fundamental deste procedimento é a dissociação celular. De fato, a preparação da suspensão unicelular é fundamental para evitar pinças ou agregados que possam levar à oclusão do vaso após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em medicina regenerativa que estavam explorando protocolos minimamente invasivos para a entrega eficiente de células-tronco não periódicas no cérebro de pequenos animais de laboratório e, em estreita perspectiva, humanos afetados por doenças neurológicas inflamatórias.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma compreensão clara das soluções de problemas relacionadas ao isolamento, preparação e injeção sistêmica de posturas específicas de tecido em animais de laboratório com doenças cerebrais.