Injeção sistêmica de células-tronco neurais / progenitoras em ratos com EAE crónica
15 de abril de 2014
O transplante de células-tronco / progenitoras neurais (NPCs) detém grandes promessas em neurologia regenerativa. A administração sistêmica de NPCs se transformou em baixo invasivo e muito eficaz terapeuticamente protocolo eficaz, para entregar as células-tronco no cérebro e na medula espinhal de roedores e primatas não-humanos que sofreram prejuízos inflamatória crônica experimental do sistema nervoso central.
O objetivo geral deste protocolo é fornecer células-tronco progenitoras neurais ao SNC por meio de injeção intravenosa em camundongos afetados por encefalomielite autoimune experimental, um modelo de doença que imita a esclerose múltipla. Isso é feito primeiro derivando células-tronco progenitoras neurais, ou NPCs, da zona subventricular do cérebro de camundongos adultos. O segundo passo é marcar geneticamente NPCs com tecnologia de vetor viral para identificação e rastreamento de células in vivo.
Em seguida, as neuroesferas em proliferação são dissociadas em uma única suspensão celular, ressuspensas na densidade desejada e injetadas na veia da cauda de camundongos EAE no pico da doença. Em última análise, a patologia post-mortem de órgãos e tecidos e a imuno-histoquímica são realizadas para identificar e caracterizar a distribuição de sobrevivência e integração de células-tronco injetadas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método minimamente invasivo, seguro e eficaz para transplantar células-tronco e progenitoras para o sistema nervoso inflamatório.
Este método ajuda a responder a três questões-chave relacionadas à segurança e eficácia das células-tronco injetadas sistemicamente em modelos de doenças inflamatórias do sistema nervoso. A demonstração visual deste método é útil especialmente para jovens cientistas, pois ajuda na compreensão das etapas experimentais críticas, desde o isolamento das células-tronco cerebrais até a preparação para a injeção sistêmica em um modelo de camundongo para esclerose múltipla. Usando técnica estéril adequada.
Coloque um cérebro recém-isolado em uma matriz de fatiamento cerebral. Use duas lâminas de barbear para produzir cortes coronais, a dois milímetros do pólo anterior do cérebro, excluindo os rastros ópticos e três milímetros posteriores ao corte anterior. Coloque as fatias de cérebro em uma placa de Petri limpa e trabalhe sob um microscópio de dissecação para isolar o tecido da zona subventricular.
Depois de picar o tecido, adicione-o a 30 mililitros de solução de digestão previamente preparada e filtrada. Agite suavemente e incube por 30 minutos, agitando a cada 15 minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de crescimento completo.
Meio ou CGM por pipetagem. Primeiro com uma pipeta P 1000 e depois com uma pipeta P 200. Quando uma suspensão de célula única for alcançada, aumente para cinco mililitros com CGM e transfira para um novo frasco.
Coloque as células em uma incubadora e permita que as neuroesferas se formem por cinco a sete dias. Quando estiver pronto, recolher a suspensão num tubo de 15 mililitros e centrifugar. Remova o sobrenadante e ressuspenda o palato em 200 microlitros de CGM.
Dissocie as neuroesferas mecanicamente, passando-as por uma ponta de pipeta P 200 100 a 150 vezes. Aumente a suspensão para um mililitro com CGM. Em seguida, dilua a suspensão com precisão.
Misture o volume apropriado com uma coloração vital e encha um hemocitômetro para determinar a contagem de células. Ressuspender as células na concentração correcta e transferir para um novo balão. Repita essas etapas a cada quatro a cinco dias para ajudar na identificação de células transplantadas in vivo.
Os NPCs são transduzidos com vetores virais que codificam genes repórteres 72 horas após a transdução do NPC. A expressão de genes repórteres fluorescentes é verificável por imunofluorescência ou citometria de fluxo. Quando estiver pronto, colha as neuroesferas que expressam GFP por centrifugação e remova o sobrenadante.
Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de dissociação de agregados celulares e incube por 10 minutos. Recupere as células e ressuspenda-as suavemente para obter uma única suspensão celular. Tomando cuidado para evitar bolhas de ar.
Depois de contar e diluir as células, mantenha a suspensão celular no gelo até que esteja pronta para uso. Quando as neuroesferas estiverem prontas, recupere os camundongos que foram previamente preparados para servir como modelo de camundongo para o SNC. O tratamento de danos deve ocorrer no pico da expressão da doença.
Comece colocando os ratos em uma caixa de aquecimento por cerca de 10 minutos para permitir que a veia da cauda se dilate. Quando estiver pronto, transfira um mouse da caixa de aquecimento para um limitador de mouse. Feche o limitador para restringir o movimento e isolar a cauda.
Esterilize a área de injeção na cauda com uma solução tópica apropriada. Encha uma seringa de insulina de um mililitro com 150 microlitros de suspensão celular e certifique-se de remover todas as bolhas. Localize a veia na superfície dorsal da cauda e posicione a agulha paralelamente à veia na parte inferior média da cauda.
Aqui a veia está mais próxima da superfície da pele. Facilitando assim o procedimento. Insira suavemente a agulha na veia, garantindo sua posição correta, retirando alguns microlitros de sangue.
Em seguida, injete lentamente a solução na veia da cauda Após a injeção, remova a agulha e aplique pressão por alguns segundos para retardar o sangramento. Coloque o mouse em uma gaiola nova e monitore até que esteja recuperado. Repita o mesmo procedimento para todos os camundongos em pontos de tempo experimentais predeterminados.
As amostras são coletadas de animais tratados e controle e analisadas para determinar a infiltração e integração de NPCs no SNC e outros tecidos quando proliferam como neuroesferas NPCs expressam marcadores de atividade mitótica, como fosfohistona H três mostrada em verde e de células neurais indiferenciadas como ninho mostrado em vermelho quando plaqueado sob condições de diferenciação apropriadas, Os NPCs expressam marcadores típicos das três linhagens neurais, como o marcador astroglia, GFAP, o marcador neuronal, a proteína microtubular associada dois e os marcadores oligo dyl glial O quatro e os núcleos da proteína básica de mielina são contra-corados com MPCs indiferenciados dpi que devem ser terapeuticamente eficazes após o transplante devem expressar moléculas de adesão à superfície celular que incluem CD 44 e a subunidade alfa quatro do antígeno quatro muito tardio. Esses exemplos mostram que os NPCs transduzidos expressam GFP, tanto como neuroesferas em proliferação quanto quando se diferenciam in vitro após a retirada do fator de crescimento. NPCs singênicos injetados sistemicamente em camundongos EAE são encontrados quase exclusivamente em áreas perivasculares de danos no SNC indicados pelas setas no cérebro e na medula espinhal até 45 dias após o transplante.
Uma etapa fundamental deste procedimento é a dissociação celular. De fato, a preparação da suspensão unicelular é fundamental para evitar pinças ou agregados que possam levar à oclusão do vaso após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em medicina regenerativa que estavam explorando protocolos minimamente invasivos para a entrega eficiente de células-tronco não periódicas no cérebro de pequenos animais de laboratório e, em estreita perspectiva, humanos afetados por doenças neurológicas inflamatórias.
Depois de assistir a este vídeo, você terá uma compreensão clara das soluções de problemas relacionadas ao isolamento, preparação e injeção sistêmica de posturas específicas de tecido em animais de laboratório com doenças cerebrais.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a administração de células progenitoras neurais (NPCs) ao sistema nervoso central (SNC) por injeção intravenosa em camundongos com encefalomielite autoimune experimental, um modelo para esclerose múltipla. O método enfatiza uma abordagem minimamente invasiva para o transplante eficaz de células-tronco.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Medicina Regenerativa
- Terapia Celular
Contexto
- As células-tronco/progenitoras neurais (NPCs) têm potencial em neurologia regenerativa.
- A administração sistêmica de NPCs é um protocolo terapêutico pouco invasivo e eficaz.
- Este estudo utiliza um modelo que simula a esclerose múltipla para avaliar a administração de NPCs.
- A marcação genética de NPCs permite o rastreamento e a identificação após o transplante.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a entrega de NPCs ao SNC por meio de injeção intravenosa.
- Avaliar a sobrevivência e a integração dos NPCs transplantados em um ambiente inflamatório.
- Fornecer um protocolo seguro e eficaz para o transplante de células-tronco.
Métodos Utilizados
- Derivação de NPCs da zona subventricular de camundongos adultos.
- Marcação genética de NPCs utilizando tecnologia de vetor viral.
- Dissociação de neuroesferas em proliferação para uma suspensão de células simples.
- Injeção intravenosa de NPCs em camundongos com EAE no pico da doença.
Resultados Principais
- Entrega bem-sucedida de NPCs ao SNC por injeção intravenosa.
- Caracterização da sobrevivência e distribuição de NPCs na análise post mortem.
- Demonstração da eficácia do método de transplante minimamente invasivo.
- Informações sobre a integração de NPCs em um sistema nervoso inflamatório.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem viável para o transplante de NPCs em doenças do SNC.
- Técnicas minimamente invasivas podem aumentar a segurança e a eficácia das terapias com células-tronco.
- Estudos futuros podem ampliar o potencial terapêutico dos NPCs em condições neuroinflamatórias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A administração sistêmica de células-tronco/progenitoras neurais (NPCs) oferece uma abordagem minimamente invasiva para direcionar lesões inflamatórias no sistema nervoso central, abordando um desafio fundamental na neurologia regenerativa para doenças multifocais como a esclerose múltipla. Este método permite a biodistribuição para sítios perivasculares de dano, apoiando a desvinculação mecanicista de terapias celulares em condições neuroinflamatórias. Ele fornece uma ponte translacional para avaliar a enxertia de NPCs, potencial imunomodulador e engajamento do alvo em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a patotropia das CPCs e sua migração direcionada para lesões inflamatórias no SNC por meio de administração intravenosa.
- Valor Operacional: Possibilita a validação funcional da imunomodulação mediada por CPCs e seus efeitos tróficos teciduais in vivo.
- Valor Preditivo: Facilita a avaliação do engajamento do alvo e da atividade biológica em um modelo de EAE relevante para a doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantificáveis de biodistribuição por meio de imunohistoquímica e rastreamento de genes repórter.
- Valor Operacional: Estabelece protocolos reprodutíveis de preparo e dissociação de NPCs para a entrega em suspensão de células únicas.
- Prontidão do Ensaio: Permite a avaliação padronizada da sobrevivência, integração e diferenciação em linhagem das células após o transplante.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Modela a entrega sistêmica de NPCs na desmielinização inflamatória crônica, relevante para terapêuticas da EM.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as interações dos NPCs com células hospedeiras por meio de moléculas de adesão na superfície (por exemplo, CD44, subunidade alfa VLA-4) in vivo.
- Continuidade do Pipeline: Apoia o avanço ajustado ao risco ao definir o comportamento dos NPCs em ambientes inflamatórios ao longo de 45 dias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais e a avaliação pré-clínica, particularmente para terapias celulares imunomoduladoras em doenças neuroinflamatórias.
- Biologia da Descoberta: Testa mecanismos de direcionamento de NPCs e sinalização parácrina em um modelo disseminado de inflamação no SNC.
- Triagem: Fornece suspensões padronizadas e livres de vesículas de NPCs adequadas para administração intravenosa e rastreamento.
- Análises: Permite a avaliação quantitativa da distribuição, sobrevivência e diferenciação multilinhagem de NPCs por meio de histologia pós-mortem e imunofluorescência.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a administração de NPCs com desfechos imunomoduladores em um modelo com disseminação temporal e espacial de lesões.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para avaliar diferentes linhagens de NPCs ou modificações genéticas em modelos de EAE e relacionados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista no modo de ação de NPCs ao demonstrar o acúmulo perivascular e a regulação imune in vivo.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de dissociação de neuroesferas, contagem celular e injeção na veia caudal.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao validar a segurança, biodistribuição e modulação do alvo de NPCs em um modelo clinicamente relevante.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização com estratificação de risco de candidatos a NPCs com base no enxerto no SNC e na estabilidade fenotípica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em dissecação de tecido neural, cultura de neuroesferas e transdução viral para marcação com genes repórter.
- Depende de técnicas cirúrgicas estéreis, precisão na injeção intravenosa e processamento do tecido pós-transplante para histologia.
- Necessita padronização entre laboratórios quanto à dissociação de NPCs, concentração e volume de injeção para garantir reprodutibilidade.
- Deve levar em conta a variabilidade no momento e na gravidade da doença EAE ao alinhar a injeção com os sintomas clínicos máximos.
- É limitado pela necessidade de análise post mortem para avaliar a biodistribuição, impedindo imagens in vivo longitudinais sem estratégias adicionais de marcação.
