Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária

O objetivo geral deste procedimento é projetar um método de precipitação de exossomos modificado que ofereça uma alternativa rápida, escalável e eficaz para o isolamento de exossomos da urina. Isso é feito removendo primeiro grandes células mortas e detritos celulares da amostra de urina por centrifugação, e o snat contendo os exossomos urinários é transferido para um novo tubo. Na segunda etapa, o pellet é dissolvido em solução de isolamento contendo DTT para remover a proteína de queda de cavalo TAM.

Em seguida, após centrifugação adicional, o sobrenadante livre de TP é incubado com reagente exo quick TC durante a noite para precipitar os exossomos no dia seguinte. As amostras tratadas com reagente exo quick TC são centrifugadas uma última vez para obter o pellet de exossomo. Em última análise, processos a jusante, como Western blot e QPCR em tempo real, podem ser realizados nos exossomos para identificar os biomarcadores de interesse.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como filtração e precipitação por ultra centrificação, é que o método de braço não requer etapas de ultracertificação, é fácil de executar relativamente rápido, enquanto ainda fornece um rendimento de exossomo alto e relativamente puro para análise molecular subsequente antes da coleta de urina. A 3,125 mililitros de coquetel de inibidor de protease recém-preparado para um recipiente estéril vazio e, em seguida, colete aproximadamente 10 mililitros da primeira urina no recipiente. Transferir a amostra para tubos cónicos de 15 mililitros.

Observe que uma amostra de urina de 24 horas coletada também pode ser usada para isolamento de exossomos, armazenando a quatro graus Celsius. Gire os tubos por 10 minutos a 17.000 GS e 37 graus Celsius para remover ou separar os detritos celulares dos exossomos urinários. Em seguida, tomando cuidado para não perturbar o pellet, transfira o sobrenadante para um tubo novo e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução de isolamento.

Incubar o pellet com DTT a uma concentração final de 200 miligramas por mililitro a 37 graus Celsius por 10 minutos. Vórtice da amostra a cada dois minutos. Então, quando o pellet estiver completamente dissolvido, adicione 500 microlitros de solução de isolamento à amostra e gire imediatamente a suspensão resultante.

Agrupar o sobrenadante com o sobrenadante previamente recolhido e ressuspender o novo sedimento em 50 microlitros de solução de isolamento. Para análise de página SDS para isolar os exossomos, primeiro incube 11 mililitros do sobrenadante combinado com 3,3 mililitros de reagente exo quick TC a quatro graus Celsius por pelo menos 12 horas. Após a incubação, centrifugue a amostra, transfira o sobrenadante para um tubo novo para análise de página SDS e o pellet contendo os exossomos urinários é usado para extrair D-N-A-R-N-A ou proteína, ou armazenado a 80 graus Celsius negativos.

Use um espectrofotômetro NanoDrop para determinar as concentrações de DNA e RNA de cada extração, medindo a absorbância em 260 e 280 nanômetros com dois microlitros de amostra aqui. Uma reprodução modificada de uma análise de página SDS e detecção de biomarcador usando análise de sangue ocidental é mostrada nas pistas com urina não processada e as primeiras proibições de proteína de pellet urinário correspondentes a 90 a 100 kilodaltons foram observadas indicando a presença e a remoção da proteína de queda de cavalo TAM, respectivamente, nas pistas finais de sobrenadante e exossomo. A banda de proteína de queda de cavalo TAM não foi observada, indicando uma remoção da proteína de queda de cavalo TAM nas etapas anteriores e resultando em um aumento do rendimento de pellets de exossomos.

Neste experimento, os biomarcadores Alex e TSG 1 0 1 foram detectados mesmo quando pequenas quantidades de amostra foram usadas, indicando um pellet de exossomo muito puro para análise de biomarcadores e uma ausência de proteínas solúveis abundantes, incluindo a proteína de queda de cavalo TAM após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da doença renal crônica usarem exossomos isolados de urina para a detecção e diagnóstico precoce de nefropatia diabética.