Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária
16 de janeiro de 2015
Este manuscrito descreve um protocolo para isolar exossomos da urina humana usando uma técnica de precipitação modificada.
O objetivo geral deste procedimento é projetar um método de precipitação de exossomos modificado que ofereça uma alternativa rápida, escalável e eficaz para o isolamento de exossomos da urina. Isso é feito removendo primeiro grandes células mortas e detritos celulares da amostra de urina por centrifugação, e o snat contendo os exossomos urinários é transferido para um novo tubo. Na segunda etapa, o pellet é dissolvido em solução de isolamento contendo DTT para remover a proteína de queda de cavalo TAM.
Em seguida, após centrifugação adicional, o sobrenadante livre de TP é incubado com reagente exo quick TC durante a noite para precipitar os exossomos no dia seguinte. As amostras tratadas com reagente exo quick TC são centrifugadas uma última vez para obter o pellet de exossomo. Em última análise, processos a jusante, como Western blot e QPCR em tempo real, podem ser realizados nos exossomos para identificar os biomarcadores de interesse.
A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como filtração e precipitação por ultra centrificação, é que o método de braço não requer etapas de ultracertificação, é fácil de executar relativamente rápido, enquanto ainda fornece um rendimento de exossomo alto e relativamente puro para análise molecular subsequente antes da coleta de urina. A 3,125 mililitros de coquetel de inibidor de protease recém-preparado para um recipiente estéril vazio e, em seguida, colete aproximadamente 10 mililitros da primeira urina no recipiente. Transferir a amostra para tubos cónicos de 15 mililitros.
Observe que uma amostra de urina de 24 horas coletada também pode ser usada para isolamento de exossomos, armazenando a quatro graus Celsius. Gire os tubos por 10 minutos a 17.000 GS e 37 graus Celsius para remover ou separar os detritos celulares dos exossomos urinários. Em seguida, tomando cuidado para não perturbar o pellet, transfira o sobrenadante para um tubo novo e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de solução de isolamento.
Incubar o pellet com DTT a uma concentração final de 200 miligramas por mililitro a 37 graus Celsius por 10 minutos. Vórtice da amostra a cada dois minutos. Então, quando o pellet estiver completamente dissolvido, adicione 500 microlitros de solução de isolamento à amostra e gire imediatamente a suspensão resultante.
Agrupar o sobrenadante com o sobrenadante previamente recolhido e ressuspender o novo sedimento em 50 microlitros de solução de isolamento. Para análise de página SDS para isolar os exossomos, primeiro incube 11 mililitros do sobrenadante combinado com 3,3 mililitros de reagente exo quick TC a quatro graus Celsius por pelo menos 12 horas. Após a incubação, centrifugue a amostra, transfira o sobrenadante para um tubo novo para análise de página SDS e o pellet contendo os exossomos urinários é usado para extrair D-N-A-R-N-A ou proteína, ou armazenado a 80 graus Celsius negativos.
Use um espectrofotômetro NanoDrop para determinar as concentrações de DNA e RNA de cada extração, medindo a absorbância em 260 e 280 nanômetros com dois microlitros de amostra aqui. Uma reprodução modificada de uma análise de página SDS e detecção de biomarcador usando análise de sangue ocidental é mostrada nas pistas com urina não processada e as primeiras proibições de proteína de pellet urinário correspondentes a 90 a 100 kilodaltons foram observadas indicando a presença e a remoção da proteína de queda de cavalo TAM, respectivamente, nas pistas finais de sobrenadante e exossomo. A banda de proteína de queda de cavalo TAM não foi observada, indicando uma remoção da proteína de queda de cavalo TAM nas etapas anteriores e resultando em um aumento do rendimento de pellets de exossomos.
Neste experimento, os biomarcadores Alex e TSG 1 0 1 foram detectados mesmo quando pequenas quantidades de amostra foram usadas, indicando um pellet de exossomo muito puro para análise de biomarcadores e uma ausência de proteínas solúveis abundantes, incluindo a proteína de queda de cavalo TAM após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da doença renal crônica usarem exossomos isolados de urina para a detecção e diagnóstico precoce de nefropatia diabética.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um protocolo para o isolamento de exossomos a partir de urina humana utilizando uma técnica de precipitação modificada. O método tem como objetivo fornecer uma alternativa rápida, escalonável e eficaz para o isolamento de exossomos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Pesquisa sobre exossomos
Antecedentes
- Os exossomos são vesículas extracelulares pequenas envolvidas na comunicação intercelular.
- O isolamento de exossomos da urina pode fornecer informações sobre diversos processos biológicos.
- Os métodos atuais podem ser demorados e menos eficientes.
- Uma técnica de precipitação modificada poderia aumentar a recuperação de exossomos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método rápido para o isolamento de exossomos a partir da urina.
- Aprimorar a escalabilidade e a eficácia da extração de exossomos.
- Facilitar aplicações posteriores, como a identificação de biomarcadores.
Métodos Utilizados
- Centrifugação para remover células grandes e detritos das amostras de urina.
- Dissolução do pellet em solução de isolamento contendo DTT.
- Incubação do sobrenadante com o reagente exo quick TC durante a noite.
- Centrifugação final para obtenção do pellet de exossomos.
Resultados Principais
- O método modificado isola com sucesso exossomos da urina.
- Os exossomos podem ser usados em análises posteriores, como Western blot e qPCR.
- A remoção eficiente de contaminantes aumenta a pureza dos exossomos isolados.
- O protocolo é escalonável para tamanhos maiores de amostra.
Conclusões
- A técnica de precipitação modificada é um método viável para o isolamento de exossomos.
- Essa abordagem pode agilizar a pesquisa com exossomos em diversos estudos biológicos.
- Estudos futuros podem explorar aplicações adicionais dos exossomos isolados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de exossomos urinários permite a descoberta não invasiva de biomarcadores para doenças renais, apoiando a detecção precoce e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de terapias renais. O método modificado de precipitação oferece uma alternativa escalável e de alto rendimento à ultracentrifugação, melhorando a reprodutibilidade e a produtividade em fluxos de trabalho de validação de alvos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na identificação de biomarcadores ao reduzir a contaminação e aumentar a pureza dos exossomos para perfis moleculares posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar exossomos que refletem carga específica de tipo celular a partir de segmentos do néfron.
- Valor Operacional: Oferece um método rápido e escalável para isolamento de exossomos sem ultracentrifugação, reduzindo a variabilidade técnica.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na detecção de biomarcadores ao gerar pellets de exossomos de alta pureza enriquecidos em miRNA e mRNA para perfilagem.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara amostras validadas de exossomos para ensaios posteriores, como Western blot e qPCR, para detectar biomarcadores associados a doenças.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento de exossomos por meio de um fluxo de trabalho baseado em precipitação, compatível com o processamento de alto rendimento de amostras.
- Prontidão para Ensaios: Gera rendimentos consistentes de exossomos adequados para extração de RNA e análise de proteínas, apoiando a triagem reprodutível de biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a progressão da descoberta de biomarcadores na urina até a validação pré-clínica, fornecendo conteúdo de exossomos relevante para a doença.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a detecção de alterações no conteúdo dos exossomos em condições de disfunção renal, esclarecendo as vias fisiopatológicas.
- Confiabilidade Preditiva: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco ao associar biomarcadores de exossomos a sinais precoces de nefropatia diabética.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses até a identificação de compostos ativos, permitindo o isolamento não invasivo de biomarcadores que orientam a seleção de alvos e a continuidade pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de exossomos que refletem carga específica da célula de origem de células do trato urinário.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de exossomos adequados para o desenvolvimento de ensaios de biomarcadores e triagem de compostos.
- Análises: Permite a medição de níveis de RNA e proteínas associados a exossomos por meio de qPCR e Western blot para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta biomarcadores de exossomos urinários a modelos pré-clínicos de doenças renais por meio da detecção de carga relevante à doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e escalável de isolamento aplicável a diversos tipos de amostras de urina e programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aprimora a validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista mediante o isolamento puro de exossomos para perfilagem de biomarcadores.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e escalabilidade ao eliminar etapas de ultracentrifugação e simplificar o fluxo de trabalho.
- Valor Estratégico: Apoia decisões mais seguras de avançar/não avançar ao aumentar a confiança na detecção precoce de biomarcadores para doenças renais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos renais com base em dados robustos de biomarcadores de exossomos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia de exossomos e técnicas moleculares, como extração de RNA e qPCR.
- Exige acesso a equipamentos de centrifugação, reagente ExoQuick TC e ferramentas espectrofotométricas para quantificação de RNA/DNA.
- Exige padronização entre equipes para garantir tempos de incubação, temperaturas e manipulação de reagentes consistentes.
- Requer considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes protocolos de coleta de urina ou condições de armazenamento.
- As limitações práticas incluem a necessidade de incubação noturna e manipulação cuidadosa para evitar perda de exossomos durante as transferências.
