Name: Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a dissecção do músculo transversus abdominis em camundongos para análise de junções neuromusculares por imunofluorescência. Este método permite visualizar inervação e estudar patologias em doenças do neurônio motor.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (número de subvenção MOP 38040) para R.K., Associação de Distrofia Muscular (EUA) para R.K., Famílias de SMA para R.K. e L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., e The Muscle Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M é um beneficiário de uma Sociedade de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá, e R.K. é um beneficiário de uma Cadeira de Pesquisa em Saúde universitária da Universidade de Ottawa.

Todos os procedimentos devem ser realizados nos padrões de cuidado animal estabelecidos pela instituição.
1. Dissecção da Musculatura Abdominal do Rato
<ol><li>Antes de começar, compõem 4% de paraformaldeído (PFA). Atenção: Mantenha sempre a PFA dentro de um capô de fumaça e use equipamentos de proteção adequados.</li>
	<li>Eutanize o rato por um método aprovado. Nota: O rato mostrado no vídeo foi eutanizado por overdose de CO2 e luxação cervical. Este mouse é um mouse de 4 semanas de idade em um fundo híbrido CD1/C57Bl6. Este rato foi criado nas instalações de animais da Universidade de Ottawa a partir de ratos que foram originalmente comprados.</li>
	<li>Faça uma incisão inicial através da pele ao nível do quadril e corte através da pele todo o caminho ao redor do rato.</li>
	<li>Retire a pele, puxando para cima até atingir o nível do membro dianteiro.</li>
	<li>Corte a musculatura abdominal ao nível do quadril e continue a incisão até chegar à coluna vertebral.</li>
	<li>Neste ponto, comece a cortar para cima através da musculatura e das costelas até chegar ao membro superior.</li>
	<li>Corte em linha reta até chegar à coluna vertebral do outro lado.</li>
	<li>Corte para baixo até chegar ao ponto em que começou.</li>
	<li>Libere o diafragma por baixo (tomando cuidado para não danificar o músculo TVA) e coloque-o em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em um prato de dissecção revestido de SYLGARD com pinos de dissecção de 0,2 mm.</li>
	<li>Fixar a caixa torácica e a musculatura associada no prato, lado superficial para cima, certificando-se de que o músculo está totalmente esticado.</li>
	<li>Despeje o PBS 1x e substitua por 4% de PFA.</li>
	<li>Cubra e deixe em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
	<li>Lave 3x em 1x PBS em temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
</ol>* Neste ponto, os músculos fixos podem ser deixados em uma geladeira durante a noite antes da dissecação subsequente.
2. Isolamento do Músculo TVA
<ol><li>Para proceder com o isolamento do músculo TVA, sob um microscópio de dissecção, comece cortando o músculo oblíquo externo ao nível das últimas costelas (Ver Figura 1 para um guia anotado).</li>
	<li>Corte direto para baixo ao lado da linhaa alba (tomando cuidado para não cortar através do TVA abaixo) até chegar ao início do músculo oblíquo interno.</li>
	<li>Em seguida, corte para liberar o reto abdominis sobreposto e os músculos oblíquos externos da parte superior do TVA abaixo.</li>
	<li>Remova o vaso sanguíneo e qualquer gordura excessiva do músculo TVA.</li>
	<li>Solte o músculo da última costela.</li>
	<li>Corte em torno das margens do músculo e remova para uma placa de 24 poços contendo PBS.</li>
</ol>3. Rotulagem imunofluorescente e microscopia do músculo TVA
Para todas as etapas subsequentes, remova o líquido usando uma pipeta fina e deixe a placa em uma plataforma de balanço. Salvo previsão em contrário, todas as etapas subsequentes são realizadas à temperatura ambiente.
<ol><li>Incubar em PBS contendo 1:1.000 bungarotoxina fluorescente marcada por 30 minutos para rotular os NMJs. Isso pode ser feito em uma sala escura ou sob papel alumínio.</li>
	<li>Músculo permeabilize adicionando 300 μl por poço de 2% Triton X-100 em PBS e deixe em uma plataforma de balanço por 30 minutos.</li>
	<li>Incubar no reagente de bloqueio (4% BSA, 1% Triton na PBS) por 30 min.</li>
	<li>Incubar no bloqueio de reagente contendo anticorpos primários (neurofilamento 1:100; proteína de vesícula sináptica 2, 1:250) a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lave 3x em 1x PBS.</li>
	<li>Incubar em PBS contendo 1:250 anticorpo secundário por 2-4 horas.</li>
	<li>Lave 3x em 1x PBS.</li>
	<li>Monte os músculos em lâminas de vidro usando mídia de montagem fluorescente suficiente e deslizamento de cobertura.</li>
	<li>Slides são melhor visualizados usando um filtro de passe de banda dupla em um microscópio epifluorescente padrão.</li>
	<li>Os NMJs são melhor imagens usando uma projeção da série Z em um microscópio confocal equipado com pelo menos um objetivo de 40X.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+insights+from+transgenic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li>
<li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li>
<li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li>
<li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+peripheral+nerve%2C+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+%28SMARD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li>
<li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li>
<li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li>
<li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+translation+elongation+factor+%28eEF1A2%29+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li>
<li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li>
<li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste vídeo, detalhamos um protocolo para a dissecção do músculo TVA do camundongo e para a rotulagem imunofluorescente de montagem total de NMJs dentro do músculo. Também apresentamos dados que mostram que este músculo pode ser usado para analisar a patologia da junção neuromuscular em um modelo de camundongos de SMA.
O sucesso nesta técnica depende de uma série de fatores. Alguns dos problemas mais comuns estão descritos abaixo. Em primeiro lugar: má coloração imunohistoquímica. Pode haver uma série de razões para isso, uma das mais comuns sendo o uso de diferentes reagentes para os listados neste protocolo. Um PFA de alto grau de microscopia eletrônica é muito importante para garantir uma boa coloração, assim como a escolha de anticorpos listados neste protocolo. Além disso, em animais mais velhos (ou seja,> 3 meses), obter uma boa qualidade de coloração pode ser mais difícil. Isso se deve ao aumento da espessura da fáscia em torno do músculo e ao aumento do acúmulo de gordura entre o oblíquo externo e o tranversus abdominis. É importante retirar a gordura, antes de proceder à imunofluorescência. Também pode ser necessário tirar parte da fáscia cobrindo o músculo, que pode ficar engrossado. Às vezes é difícil tirar a fáscia e a gordura do músculo sem incorrer em algum dano à fibra muscular e uma interrupção do padrão de inervação. No entanto, se essa técnica for realizada com cuidado, a coloração de boa qualidade pode ser adquirida de camundongos até pelo menos 1 ano de idade. Em camundongos mais jovens (ouseja, menos de 3 meses de idade) não deve ser necessário realizar qualquer provocação ou separação de fibras musculares. Em segundo lugar: difícil encontrar NMJs após dissecação e coloração. Isso ocorre muitas vezes porque a dissecção não se estendeu por baixo da última costela. A maioria dos NMJs estão localizados logo abaixo da última costela e, portanto, devem ser tomados cuidados para garantir que esta parte do músculo seja incluída na dissecação. Em terceiro lugar: a adesão do músculo EO ao músculo TVA. Esta é frequentemente uma queixa quando os indivíduos tentam estender a dissecção abaixo do nível do músculo oblíquo interno (IO). A área do músculo TVA onde o IO também está presente é mais difícil de analisar, pois pode ser difícil distinguir qual músculo é qual. Por essa razão, nós rotineiramente apenas dissecamos a parte mais superior do músculo TVA. Neste nível, não há adesão entre os músculos EO e TVA e, portanto, este não deve ser um problema significativo.
Um obstáculo significativo para o uso do músculo TVA, comparado aos músculos appendiculares, é a acessibilidade para manipulações cirúrgicas ou injeção de substâncias. Esses tipos de experimentos podem ser cruciais para investigar a fisiologia do NMJ em um determinado músculo. Embora o TVA seja certamente menos facilmente acessível do que os músculos mais comumente utilizados, como tibialis anterior ou gastrocnemius,trabalhos anteriores mostraram que é possível denervar o TVA por lesão cirúrgica dos nervos intercostais18. Recentemente também usamos este músculo para a administração local de substâncias sob anestesia geral (dados inéditos). Embora esses experimentos possam representar um desafio técnico moderado, este trabalho mostra que eles são viáveis e, portanto, estendem a utilidade desse músculo para análise de NMJs sob manipulação patológica e fisiológica.
O músculo TVA é um dos vários músculos planos finos situados em todo o corpo que podem ser usados para análise completa dos padrões de inervação. Outros músculos incluem um grupo de músculos cranianos inervados por neurônios motores originários do núcleo facial do tronco cerebral, abrangendo levator auris longus, auricularis superiore adutor auris longus, as dissecções para as quais foram descritas anteriormente14,19. Além disso, a musculatura em torno do músculo TVA, incluindo EO, IO e reto abdominis,também pode ser rotulada e usada para análise de NMJ. Para uma análise abrangente da patologia NMJ em um modelo de camundongo, é importante considerar uma série de músculos situados em todo o corpo e não restringir a análise a um único músculo. Isso é exemplificado em modelos de camundongos de doenças do neurônio motor onde há heterogeneidade significativa nos níveis de patologia do NMJ entre diferentes músculos20. Essa variabilidade intermuscular é uma ferramenta extremamente valiosa ao investigar o mecanismo de vulnerabilidade do neurônio motor e, portanto, restringir a análise a um único músculo poderia diminuir significativamente o potencial da pesquisa.

As junções neuromusculares (NMJs) são a conexão sináptica entre um neurônio motor inferior e uma fibra muscular esquelética. São tradicionalmente consideradas uma sinapse tripartite, composta por um neurônio (terminal pré-sináptico), fibra muscular (terminal pós-sináptico) e célula schwann terminal1. Os NMJs parecem ser alvos precoces e significativos na patologia em uma gama de doenças de neurônios motores e modelos de camundongos2,3. Os sintomas típicos incluem a denervação, onde a placa final do motor torna-se desprovida de uma inervação pré-sináptica, inchaço do terminal pré-sináptico e redução da complexidade da morfologia NMJ4-11. Também podem ser observadas respostas compensatórias, que incluem brotação terminal e nodal, onde os processos axonais se estendem desde terminais sinápticos remanescentes ou internos até placas endervadas reinnervadas12,13. Devido à correlação apertada entre a atividade sináptica e a morfologia do NMJ, uma grande quantidade de informações pode ser obtida sobre o estado funcional dos neurônios motores a partir da análise da morfologia NMJ. Como a perda de NMJs representa frequentemente um dos primeiros aspectos da patologia neuromuscular4,10, a quantificação ao nível da inervação pode dar informações importantes sobre a progressão da patologia e o efeito potencial de uma intervenção terapêutica. Além disso, como a perda do NMJ representa um passo significativo na progressão patológica, o desenvolvimento de terapêuticas que possam estabilizar as conexões e incentivar a regeneração pode gerar benefícios significativos.
Ao analisar a morfologia do NMJ, a escolha muscular é de grande importância. Algumas das considerações primárias podem incluir tipo de fibra muscular, posição corporal e análise comparativa às condições humanas. Além disso, quando são necessárias manipulações como injeção de substâncias ou lesão nervosa traumática, a acessibilidade experimental também é importante a considerar. Em geral, é preferível analisar uma gama de músculos posicionados em todo o corpo refletindo uma gama de subtipos de unidade motora. Muitas vezes, no entanto, a escolha muscular é influenciada pela facilidade de dissecção. Consequentemente, a análise do NMJ é frequentemente realizada exclusivamente em grandes músculos appendiculares, como gastrocnemius. Para obter uma boa coloração de NMJ nesses músculos, seccional ou interrupção mecânica das fibras musculares é frequentemente necessário. Como resultado, o padrão de inervação pode se tornar interrompido e uma análise abrangente e de alta qualidade dos padrões de inervação, brotando e denervação é frequentemente comprometida. Uma abordagem alternativa é usar músculos planos finos que não requerem secção e podem ser manchados e montados intactos, permitindo uma visão geral abrangente de toda a inervação do músculo. Há uma série de músculos que podem ser usados para tal análise, incluindo um grupo de músculos cranianos, (englobando levator auris longus, auricularis superior, e adutor auris longus)14, músculos torácicos (por exemplo. triangularis sterni) 15, e músculos abdominais(por exemplo, transversus abdominis (TVA)). O maior obstáculo no uso desses músculos é a perícia técnica necessária para dissecá-los sem danos.
Neste vídeo, fornecemos um protocolo para dissecar e realizar rotulagem imunofluorescente do músculo TVA do camundongo para permitir uma análise abrangente do padrão de inervação e morfologia NMJ. O músculo TVA é um músculo de contração predominantemente lento que compreende a camada mais profunda de musculatura abdominal e é inervatado pelos nervos intercostais inferiores. Trabalhos anteriores mostraram ser consistentemente altamente vulnerável à patologia em uma série de modelos de camundongos da doença do neurônio motor infantil atrofia muscular espinhal (SMA) e em outros modelos de camundongos de degeneração de neurônio motor de início precoce4,16. Por conseguinte, sugerimos que o TVA é um músculo útil para a realização da análise de NMJ em neuropatias periféricas.

<table><tbody><tr><td>Solução aquosa de paraformaldeído (16%)</td> <td>Ciências de Micropscopia Eletrônica</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola angular</td> Ferramentas <td>de ciências finas</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>dependendo do fornecedor local</td><td>Use isso para fazer prato de dissecação para fixar o músculo</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilamento Anticorpo primário (2H3), Sobrenadante</td><td>Desenvolvimento Estudos Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SV2 Anticorpo primário (SV2), Estudos de desenvolvimento sobrenadante</td><td>Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescência Montagem Média</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Superfrost Plus; Branco)</td> <td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>CD1 / C57Bl6 mouse</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção do músculo transversus abdominis para análise de junção neuromuscular de montagem integral

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

A análise da morfologia da junção neuromuscular pode dar uma visão importante do estado fisiológico de um determinado neurônio motor. A análise de músculos planos finos pode oferecer vantagem significativa sobre os músculos mais grossos tradicionalmente utilizados, como os do membro traseiro (por exemplo. gastrocnemius). Os músculos finos permitem uma visão geral abrangente de todo o padrão de inervação para um determinado músculo, o que, por sua vez, permite a identificação de piscinas seletivamente vulneráveis de neurônios motores. Esses músculos também permitem a análise de parâmetros como tamanho da unidade motora, ramificação axonal e broto terminal/nodal. Um obstáculo comum no uso desses músculos é ganhar a expertise técnica para dissecá-los. Neste vídeo, detalhamos o protocolo de dissecação do músculo transversus abdominis (TVA) de camundongos jovens e a realização de imunofluorescência para visualizar axônios e junções neuromusculares (NMJs). Demonstramos que essa técnica dá uma visão completa do padrão de inervação do músculo TVA e pode ser usada para investigar a patologia do NMJ em um modelo de camundongo da doença do neurônio motor infantil, atrofia muscular espinhal.

O protocolo acima direciona o isolamento e a coloração do músculo TVA para análise de NMJ. Isso permite a análise completa dos padrões de inervação muscular, bem como a análise de alta resolução da morfologia NMJ(Figura 2). Essa técnica pode ser aplicada com sucesso para revelar a patologia do NMJ em modelos de camundongos da doença do neurônio motor, como a SMA4,17(Figura 3). Nos modelos de camundongos de SMA há variabilidade intramuscular significativa na patologia, porém o músculo TVA é consistentemente altamente afetado. Isso é evidenciado pela denervação de placas finais motoras, acúmulo de neurofilamentos no terminal pré-sináptico e broto terminal(Figura 3). Os resultados aqui apresentados demonstram que a técnica descrita acima pode ser um método poderoso para fornecer uma visão geral abrangente da inervação e análise da patologia NMJ em modelos de camundongos.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Visão geral da musculatura abdominal do rato. (A) A imagem mostra a gaiola torácica com musculatura abdominal anexada, que foi removida de um rato recentemente eutanizado e presa em um prato de dissecção superficial para cima(A). (B) A dissecação em A foi anotada para marcar os limites aproximados dos músculos abdominais. Os músculos abdominais superficiais podem ser vistos no lado esquerdo da dissecção, e incluem oblíquo externo (delineado em azul) e reto abdominis (delineado em vermelho). No lado direito da dissecção, os músculos superficiais foram removidos permitido visualização do músculo transverso abdominis (delineado em verde) e do músculo oblíquo interno (delineado em amarelo). O objetivo deste protocolo é direcionar a dissecação da parte superior do músculo TVA, mostrada aqui como um triângulo verde sólido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. Visão geral total das junções neuromusculares no músculo TVA. Imagens que mostram exemplos de NMJs do músculo TVA visualizados com coloração imunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) e bungarotoxina (BTX; vermelho). As imagens são micrografias fluorescentes em montagem que mostram todo o músculo (A) ou imagens confocal mostrando grupos (B) ou individuais(C)NMJs. Barra de escala = 800 μm(A),70 μm(B),25 μm(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Figura 3. Patologia da junção neuromuscular no músculo TVA de um modelo de camundongos de SMA. Micrografias confocal mostrando NMJs do músculo TVA visualizados com coloração imunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína vesícula sináptica 2 (SV2; verde) e bungarotoxina (BTX; vermelho) de ambos os controles(Smn2B/+) ou modelo de rato SMA(Smn2B/-). Observe que, embora a morfologia NMJ normal possa ser observada em camundongos de controle, nos músculos TVA de Smn2B/- ratos há evidências de denervação total (ponta de flecha branca), denervação parcial (ponta de flecha roxa) brotando terminal (ponta de flecha azul) e inchaço pré-sináptico (ponta de flecha amarela). As placas finais pós-sinápticas também são menos complexas refletindo um fenótipo aparentemente menos maduro. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.

Neste vídeo demonstramos um protocolo de dissecção do músculo transversus abdominis do camundongo e usamos imunofluorescência e microscopia para visualizar junções neuromusculares.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

O músculo transverso do abdome é um músculo fino e plano que constitui a camada mais profunda da musculatura abdominal. Ele se prende à linha média por meio da linha alfa e à superfície profunda da caixa torácica. Neste vídeo, vamos dissecar a parte superior deste músculo e utilizar imunofluorescência para visualizar os padrões de inervação e a estrutura das junções neuromusculares.Para esta dissecação, você precisará dessas ferramentas, que são listadas separadamente no protocolo anexado. Após eutanasiar os camundongos por um método apropriado, pulverize com etanol 70% para minimizar a dispersão de pelos. Coloque o camundongo em decúbito dorsal e faça uma incisão na pele ao nível do quadril.Tendo o cuidado de não cortar a musculatura abdominal. Continue essa incisão ao redor do camundongo. Após concluir a incisão, puxe a pele para cima, sobre a cabeça do camundongo.Novamente, tendo o cuidado de não romper a musculatura abdominal. Corte através dos músculos abdominais e continue a incisão até atingir a coluna vertebral. Nesse ponto, corte para cima através das costelas até ficar acima do esterno, tomando o cuidado de liberar o diafragma da caixa torácica.Repita este processo no outro lado do camundongo. Neste momento, corte as costelas e o esterno e transfira as costelas com os músculos anexos para um recipiente de dissecação revestido com algar. Estenda o músculo utilizando pinos de dissecação para insetos.Fixe seu tecido em PFA 4% e deixe em uma plataforma agitadora por 15 minutos. Aqui está um exemplo de como deve ficar seu músculo estendido e fixado. No lado esquerdo da imagem, podem ser vistos os músculos superficiais, que incluem o oblíquo externo delineado em azul e o reto abdominal delineado em vermelho.Esta camada foi descolada no lado direito da imagem para revelar o oblíquo interno destacado em amarelo e o transverso do abdome destacado em verde. Nosso objetivo é dissecar a parte superior do músculo transverso do abdome. Mostrado aqui no triângulo verde sólido sob um microscópio de dissecação, corte através do músculo oblíquo externo em um ponto onde ele cobre as costelas, depois corte em direção inferior através do oblíquo externo, mas acima do transverso do abdome. Continue cortando até visualizar o início do músculo oblíquo interno, visto aqui como fibras musculares tangenciais no lado esquerdo da imagem.Remova o vaso sanguíneo removendo-o suavemente da superfície do músculo. Em seguida, use dissecação romba para separar o músculo transverso do abdômen da costela sobrejacente. Corte ao redor das margens do músculo, certificando-se de incluir a parte situada sob a costela.Remova a costela e transfira o músculo para uma placa de 24 poços para imunofluorescência. Realize todos os procedimentos de imunofluorescência em uma placa de 24 poços. Utilize uma pipeta de ponta fina e siga o protocolo descrito neste manuscrito.Certifique-se de usar os reagentes detalhados neste protocolo. Após a coloração por imunofluorescência, monte os músculos em lâminas de vidro com meio de montagem fluorescente, utilizando uma pinça para desdobrar suavemente o músculo, verificando se ele está plano antes de aplicar a lamínula. Certifique-se de pressionar firmemente para aplainar o músculo durante a montagem. Conforme mostrado nesta imagem, este protocolo pode ser utilizado para realizar a coloração em montagem inteira do músculo transverso do abdômen, a fim de visualizar as junções neuromusculares e os padrões de inervação.Nesta imagem, os axônios e terminais sinápticos são mostrados em verde, marcados com anticorpos contra SB dois e neurofilamento e motoneurônios, como mostrado em vermelho, rotulados como toxina alfa bunger. A série Z de microscopia confocal pode agora ser utilizada para obter imagens de alta resolução da morfologia da junção neuromuscular. Este protocolo pode ser aplicado para estudar a patologia da junção neuromuscular em modelos murinos.Por exemplo, estas imagens mostram a patologia da junção neuromuscular em um modelo murino de atrofia muscular espinhal. Observe que há evidência de desnervação completa ou parcial, indicada por setas brancas ou roxas, respectivamente, brotamento terminal representado por setas azuis e inchaço pré-sináptico marcado por setas amarelas. Essa análise pode fornecer informações importantes sobre o processo patológico nas doenças dos neurônios motores.

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem...

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Este vídeo demonstra um protocolo para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares nos músculos dorsais longitudinais de Drosophila. O procedimento envolve a coloração de neurônios e músculos com dois anticorpos distintos e a comparação de padrões de fluorescência entre moscas mutantes e selvagens. Uma redução na coloração neuronal em moscas mutantes indica neurodegeneração, enquanto a estrutura muscular permanece intacta.

Avaliação da integridade estrutural das junções neuromusculares do músculo longitudinal dorsal em Drosophila

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

A eficácia da captação intramuscular e do transporte retrógrado de moléculas para os neurônios motores correspondentes depende da localização dos locais de injeção em relação às placas terminais motoras (MEPs). Aqui, descrevemos como localizar MEPs nos músculos esqueléticos para otimizar o transporte retrógrado de traçadores para os neurônios motores.

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.

Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Aprenda a dissecção do músculo transversus abdominis em camundongos para análise de junções neuromusculares por imunofluorescência. Este método permite visualizar inervação e estudar patologias em doenças do neurônio motor.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

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