Name: Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a analisar a iniciação da tradução em células de mamíferos sob estresse usando perfilamento de polissomos. Este método separa ribossomos ativos e inativos por gradiente de sacarose e ultracentrifugação.

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PA é um beneficiário de uma bolsa &quot;Pierre Durand&quot; pela Faculdade de Medicina da Universidade de Laval. Este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e Engenharia Research Council of Canada (MOP-CG095386) para RM O fraccionamento polysome foi adquirida através de uma Fundação Canadense para concessão inovação (MOP-GF091050) para RMR M tem um novo prêmio salário investigador CIHR. Somos gratos aos drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco e A. Cammas para conselhos úteis.

O protocolo a seguir as orientações aprovado pelo Conselho de Revisão Ética de Laval. 1. Preparação de culturas de células e Manipulação do cérebro <ol><li> As células de mamíferos e de Drosophila <ol><li> Crescer HeLa células de câncer cervical e células embrionárias Schneider Drosophila como recomendado pela American Type Culture Collection. Trabalhar com células em uma passagem baixa. </li><li> Células da placa, a fim de atingir 80% de confluência no dia da experiência. Para melhores resultados, utilizar ~ 12 x 10 6 de células para cada condição experimental. Antes de fazer extratos para análise polysome, estimular a tradução através da adição de meio completo fresco por pelo menos 90 min. </li></ol></li><li> Isolamento Cérebro: Isolar cérebros de camundongos com idade entre 9 e 16 dias após o nascimento. A eutanásia envolve inalação de CO 2 após anestesia e deslocamento cervical. Após o sacrifício, isolar todo o cérebro e quer lugar it a -80 ° C ou transferi-lo diretamente no frio PBS 1X, para uso imediato. </li></ol> 2. Preparação do Sistema de Gradiente de Densidade Fracionamento <ol><li> Lavar o sistema de tubagem com 0,1% de SDS durante 5 minutos. </li><li> Lavar o sistema de tubos com 70% de etanol durante 5 minutos, em seguida, com solução RNaseZAP durante 5 min antes de lavá-la com água DEPC. </li><li> Bomba de ar, a fim de secar o sistema de tubagem do aparelho. </li></ol> 3. Preparação dos gradientes de sacarose <ol><li> Adicione 15% e 55% de soluções de sacarose em 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, e 1 mM de DTT. </li><li> Gerar a 15-55% de gradiente linear de sacarose utilizando um Isco Modelo 160 gradiente anterior, conforme descrito nas instruções do fabricante. No entanto, é importante para controlar bem a velocidade de TRIS bomba peristáltica, a fim de evitar a criação de bolhas ou de turbulências nos gradientes. Manter os gradientes a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Durante o tempo em que o programa de formador de gradiente está em execução, esfriar a ultracentrífuga a 4 ° C. </li></ol> 4. Preparação de celular e cérebro do rato Extratos <ol><li> Preparação de Extratos celulares <ol><li> Coloque placa (s) em células de gelo e lavagem 3x com PBS frio 1X. </li><li> Células colheita (~ 12 x 10 6) em 1 ml de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,25 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1% Nonidet P40, 5 U de inibidor / ml de RNase, suplementado com mini tabletes completos inibidor de protease cocktail livre de EDTA), transferi-los para um tubo de Eppendorf, e misture bem, passando-os 15x através de uma seringa 1cc U100 Insulina 28 G 1/2. Deixe o ligado de células repousar em gelo durante 15 min. </li><li> Coloque algumas gotas de lisado de células numa lâmina de avaliar a lise celular por meio da observação de um microscópio de contraste de fase com uma objectiva 10X. Somente os núcleos devem estar visíveis e sem membranas celulares devem ser atestando visível para a lise celular. Como controle, observecélulas não lisadas. </li><li> Clarificar o ligado celular por centrifugação a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter o lisado solúvel contendo os polirribossomas. </li></ol></li><li> Preparação do cérebro do rato Extratos <ol><li> Homogeneizar o cérebro inteiro isolado (~ 500 mg) por 10 movimentos de um homogeneizador Dounce gelado com 2 ml de tampão de lise e clarificação do homogenado por centrifugação a 11.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Carrega-se o sobrenadante resultante sobre uma almofada de sacarose a 50% e prosseguir com a sedimentação durante 2 h a 200.000 x g usando um rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento translúcido contendo os polirribossomas em 1 ml de tampão de lise e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo. Deixe o resto suspensão sobre o gelo por 30 minutos antes de carregar em gradientes. </li></ol></li></ol> 5. Carregando os extratos em sacarose gradientes e Ultracentrifugação <ol><li> Medir a concentraçãode ARN presente no extracto citoplasmático utilizando um espectrofotómetro. Devagar e com cuidado carregar ~ 20 unidades de DO 260 do extracto sobre o gradiente de sacarose de 15% a 55%. Certifique-se de que não é de 2-3 mm de espaço disponível na superfície do tubo, para evitar transbordamento dos tubos, durante a centrifugação. </li><li> Centrifugar os gradientes utilizando uma ultra-centrifugadora durante 2 h 30 min a 230.000 x g usando um rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. Quando termina a centrifugação, remover os tubos e colocá-los no gelo com cuidado para não perturbar os gradientes. </li></ol> 6. Fracionamento de extratos citoplasmáticos para polissomos Profiling <ol><li> Coloque gradientes de sacarose no Sistema Automatizado de fraccionamento de densidade e prosseguir com fraccionamento automatizado e recolha de fracções (0,5 ml cada), tal como descrito pelo fabricante. </li><li> Recolhe cada fracção (~ 500 mL) em tubos de Eppendorf individuais, com monitorização contínua da absorvância a 254 nm. Em PARALLel da operação de fracionamento de gradiente, o perfil polyribosomal estará editando no papel gráfico. Como alternativa, use uma unidade de aquisição de dados conectado ao registrador gráfico para ter uma aquisição eletrônica do perfil polysome. </li><li> No final de cada corrida, transferir Eppendorfs coletadas em gelo seco. Neste momento, qualquer loja recolhidas fracções a -80 ° C ou precipitar directamente complexos de ARN-proteína, como se segue. </li></ol> 7. Extração de proteínas e análise <ol><li> Para cada fracção recolhida do gradiente de sacarose, adicionar 2 volumes de etanol a 100% frio e deixar complexos de ARN-proteína precipitar a -20 ° C durante a noite. </li><li> Centrifugar cada precipitado de ARN-proteína a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C, em seguida, lava-se com etanol a 70%. Seco e ressuspender o precipitado em tampão de amostra de SDS-PAGE antes de prosseguir com a Western blot usando anticorpos específicos (ver Figura 2). </li></ol> 8. Extração de RNA e Análise <ol><li> Precipitar complexos RNA-proteína como na secção 7.1. Ressuspender cada precipitado de ARN-proteína no tampão de lise contendo 0,1% de SDS. Digerir o componente proteína do precipitado com 2 mg / ml de proteinase K, durante 30 minutos num banho de água a 55 C °. </li><li> Extrair os componentes de ARN precipitado por adição de 1 volume de &quot;fenol: clorofórmio&quot;, 2 volumes de clorofórmio, e 0,1 volume de NaOAc 2 M pH 4, e centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 20 min. O precipitado de ARN a partir da fase aquosa resultante de cada amostra durante a noite a -20 ° C pela adição de um volume de isopropanol e de 0,2 mg / mL de glicogénio. Girar-se o precipitado durante 1 hora a 10.000 x g a 4 ° C. Lavar o sedimento de ARN com etanol a 70% frio. </li><li> Ressuspender o sedimento de ARN em um pequeno volume de ARNase isenta de água. Avaliar a quantidade e qualidade de RNA utilizando o espectrofotómetro. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
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<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
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<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
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<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
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<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A análise do perfil de polissoma em gradientes de sacarose permite a medição da iniciação da tradução através da análise da densidade de polissomas isolados a partir de células ou tecidos de 9,11-14. Esta técnica é a melhor (se não o único) abordagem para medir a iniciação da tradução in vivo. Ele é utilizado para monitorizar o estado de crescimento de células de translação durante o ciclo de célula 15, e para avaliar os efeitos de vários tipos de stress, incluindo infecções virais, hipoxi...

As células eucarióticas encontrar constantemente uma gama de condições de estresse fisiológicos e ambientais nocivos que exigem uma resposta celular adaptativa rápida. Resposta ao estresse celular envolve um equilíbrio preciso entre anti-sobrevivência e pró-sobrevivência fatores atuando. Perturbar este equilíbrio pode ter consequências irreversíveis que levam ao desenvolvimento de patologias humanas, como câncer e doenças neurodegenerativas. Durante o primeiro passo da resposta ao stress, as células de activar as vias pró-sobrevivência que envolvem o controlo coordenado de alterações na expressão do gene ao nível da tradução do mRNA. tradução do mRNA em eucariotos é um processo celular complexo que envolve interações coordenadas entre os fatores de iniciação da tradução (EIFS), proteínas de ligação de RNA específico (RBDs) e moléculas de RNA 1. tradução do mRNA é dividido em três fases distintas: iniciação, alongamento e terminação. Embora todas as três fases estão sujeitos a regulamenmecanismos reguladoras nacionais, os mecanismos de controlo da tradução como alvo principalmente na fase de iniciação da tradução, que assim constitui o passo limitante da taxa de síntese de proteína 2. De iniciação da tradução é um processo altamente ordenadas que começa com a formação da eIF2a.GTP.Met-ARNt eu Met complexo ternário e sua subsequente ligação à subunidade 40S do ribossoma, levando à formação do complexo de pré-iniciação. O próximo passo é o recrutamento do complexo de pré-iniciação de ARNm, que envolve a actividade de factores de iniciação da tradução, tais como eIF4F e eIF3. O complexo de pré-iniciação 48S assim formado sofre alterações conformacionais específicos que permitem que esta maquinaria para iniciar a digitalização da região 5 &#39;não traduzida do mRNA, até que reconhece o codão de iniciação agosto A maioria dos fatores de iniciação da tradução são então liberados e 60 subunidades são recrutados para formar um ribossomo 80S complexo competente para a tradução, umat que começa síntese protéica ponto (Figura 1). Mais do que uma 80S monosome pode ser traduzindo o mesmo mRNA de cada vez produzindo assim chamados polissomas (ou polirribossomas). A densidade de polissomas num ARNm reflecte a iniciação, elongação e taxas de terminação e, assim, é uma medida da traductibilidade de um transcrito particular. No entanto, em polissoma perfil é utilizado principalmente para avaliar alterações na tradução do mRNA na etapa de iniciação. Aqui utilizámos um inibidor de proteassoma, como inibidor de iniciação da tradução. O tratamento de células cancerosas com esta droga induz uma resposta ao estresse caracteriza-se pela ativação do estresse chamado HRI quinase que fosforila o fator de iniciação da tradução eIF2a 3. A fosforilação de eIF2a é um dos principais eventos que levam à inibição da iniciação da tradução, em células de mamíferos 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Células</td></tr><tr><td>HeLa células de câncer cervical</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila células embrionárias</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Meio de cultura e suplementos</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Cientista Cientista</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Soluções de sacarose</td></tr><tr><td>D-sacarose</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampão de lise</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inibidor de RNase (Inibidor de Ribonuclease Recombinante RnaseOUT)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteases (completas, mini, sem EDTA)</td> <td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extração</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenol:clorofórmio</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias Glycogen</td><td>Life</td><td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpos</td></tr><tr><td>anticorpo anti-FMRP</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análise da tradução iniciação durante condições de estresse por polysome profiling

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

O controle preciso da tradução do mRNA é fundamental para a homeostase da célula eucariótica, em particular na resposta ao stress fisiológico e patológico. Alterações deste programa pode conduzir ao crescimento de células danificadas, uma indicação de desenvolvimento de cancro, ou a morte prematura das células, tal como visto nas doenças neurodegenerativas. Muito do que se conhece sobre a base molecular para o controlo da tradução foi obtido a partir de análise de polissoma usando um sistema de fraccionamento de gradiente de densidade. Esta técnica baseia-se na ultracentrifugação de extractos citoplasmáticos de um gradiente linear de sacarose. Uma vez que a rotação é completado, o sistema permite o fraccionamento e quantificação de zonas correspondentes a centrifugadas traduzindo diferente ribossomos populações, resultando, assim, em um perfil de polissoma. As alterações no perfil de polissoma são indicativos de alterações ou defeitos de iniciação da tradução que ocorrem em resposta a vários tipos de stress. Esta técnica também permite avaliar the papel de proteínas específicas no início da tradução e, para medir a atividade de translação de mRNAs específicos. Aqui descrevemos o nosso protocolo para realizar perfis de polissomas, a fim de avaliar a iniciação da tradução de células e de tecidos eucarióticos, em condições de crescimento normais ou de stress.

Como referido acima, polysome perfil permite a análise de mudanças de iniciação da tradução em condições de estresse. Figura 1 é uma visão simplificada de iniciação da tradução, que, conforme descrito anteriormente é um processo de várias etapas que envolvem um conjunto ordenado de complexos de iniciação da tradução. Em condições normais de crescimento, os complexos de iniciação da tradução são convertidos em polirribossomos cuja detecção por perfil polysome atestam para uma iniciação da tradução ativa ...

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos de condições de estresse na tradução e na iniciação em células e tecidos de mamíferos por meio de perfis de polissomos. Isso é realizado primeiramente tratando células cancerígenas de mamíferos com uma droga anticâncer e, em seguida, preparando extratos celulares. O segundo passo é preparar gradientes de sacarose.Em seguida, os extratos celulares são carregados sobre gradientes de sacarose e submetidos à ultracentrifugação para separar as frações ribossomais. Por fim, é realizada uma análise por western blot utilizando anticorpos específicos para avaliar a associação das proteínas testadas com polissomos. A principal vantagem desta técnica em relação a um método existente, como o marcação metabólica, é que ela nos permite avaliar o efeito de condições de estresse na etapa de iniciação da tradução.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo terapêutico do estresse, como se e como os medicamentos anticâncer afetam a iniciação da tradução. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia contra o câncer, pois ajudam a revelar novas vias regulatórias da iniciação da tradução. Embora este método possa

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

O protocolo aqui apresentado envolve o perfil polissômico para isolar translatome, mRNAs associados a ribossomos, em RNAs não polissomais e polissomais de Arabidopsis por meio de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. Este método demonstra a eficiência de tradução de Arabidopsis estressada pelo calor.

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Aprenda a analisar a iniciação da tradução em células de mamíferos sob estresse usando perfilamento de polissomos. Este método separa ribossomos ativos e inativos por gradiente de sacarose e ultracentrifugação.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

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