Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos das condições de estresse na tradução, iniciação de células e tecidos de mamíferos por meio de perfis polissômicos. Isso é feito primeiro tratando células cancerígenas de mamíferos com um medicamento anticâncer e, em seguida, preparando extratos celulares. O segundo passo é fazer sacarose, gradientes.

Em seguida, os extratos celulares são carregados na sacarose, gradientes e ultra centrifugados para separar as frações ribossômicas. Em última análise, a análise de western blot usando anticorpos específicos é realizada para avaliar a associação de proteínas testadas com polissomos. A principal vantagem desta técnica de um método existente como a marcação metabólica, é que ela nos permite avaliar o efeito das condições de estresse na etapa de iniciação da tradução.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo terapêutico do estresse, como se e como os medicamentos anticâncer afetam o início da tradução. A implicação desta técnica se estende à terapia do câncer porque ajuda a revelar novas vias regulatórias de iniciação da tradução. Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação do início da tradução em culturas de células, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como tecidos isolados, incluindo cérebro e tumores.

Para preparar primeiro o sistema automatizado de fracionamento de gradiente de densidade, lave o sistema de tubulação do aparelho com 0,1% SDS por cinco minutos. Em seguida, lave o sistema de tubulação com etanol a 70% por cinco minutos, seguido de solução de RNA Zap por cinco minutos. E por último, com DEPC, água, seque o sistema de tubulação bombeando ar para o sistema.

Em seguida, prepare soluções de sacarose de 15% e 55% para gerar o gradiente linear de sacarose de 15 a 55% usando um modelo ISCO um formador de gradiente de 60. Seguindo as instruções do fabricante, é importante controlar cuidadosamente a velocidade da bomba peristáltica tris para evitar a criação de bolhas ou turbulências nos gradientes durante o tempo em que o programa gradient maker está funcionando resfriar a ultracentrífuga a quatro graus Celsius. Mantenha os gradientes em quatro graus Celsius até que este experimento utilize células de câncer helicoidal de baixa passagem previamente plaqueadas para atingir 80% de confluência.

No dia do experimento. É importante fazer extrações de células frescas e evitar a contaminação por RNA durante este procedimento, 90 minutos antes de adicionar o medicamento anticâncer, substitua o meio das células por meio fresco e completo. Para estimular a tradução, devolva as células à incubadora.

Adicione o medicamento anticâncer diretamente à cultura de células como um complemento de controle. DMSO incube por quatro horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono após quatro horas, coloque as placas no gelo e lave as células três vezes com células de colheita de PBS frias em um mililitro de tampão de lise para obter melhores resultados. Use aproximadamente 12 milhões de células para cada condição experimental.

Transfira as células das placas raspadas para um tubo einor e misture bem, passando-as 15 vezes por uma seringa. Deixe os lisados celulares descansarem no gelo por 15 minutos. Em seguida, coloque algumas gotas de lisado celular em uma lâmina e avalie a lise celular por microscopia de contraste de fase usando uma objetiva de 10 x.

Uma vez verificada a lise celular, clarificar o lisado celular por centrifugação a 11 000 Gs durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Transferir o lisado solúvel que contém os poli-ribossomas para um novo tubo e mantê-lo no gelo antes de carregar os extractos citoplasmáticos em gradientes de sacarose. Meça a concentração de RNA presente usando um espectrofotômetro cuidadosamente e carregue lentamente aproximadamente 20 OD duas unidades de 60 do extrato no gradiente de sacarose de 15 a 55%.

Certifique-se de que haja dois a três milímetros de espaço disponível na superfície do tubo para evitar transbordar o tubo durante a centrifugação. Carregue os tubos no rotor. Coloque o rotor na ultracentrífuga e centrifugue os gradientes a 230.000 Gs a quatro graus Celsius por duas horas e 30 minutos.

Quando a centrifugação estiver concluída, remova os tubos e coloque-os no gelo com cuidado, sem perturbar os gradientes. Para iniciar o fracionamento dos extratos citoplasmáticos, colocar os gradientes de sacarose em um sistema automatizado de fracionamento de densidade e proceder ao fracionamento automatizado e à coleta de frações conforme descrito pelo fabricante. Colete cada fração de 0,5 mililitro em tubos einor individuais com monitoramento contínuo de absorbância a 250 nanômetros em paralelo à operação de fracionamento de gradiente, o perfil polirribossomal será editado no papel gráfico no final de cada execução.

Transfira os tubos finais com as frações coletadas para o gelo. Para iniciar este procedimento, adicione dois volumes de etanol 100% frio a cada fração coletada e deixe os complexos de proteínas de RNA precipitarem a menos 20 graus Celsius durante a noite. Para extração de proteínas, centrifugue cada precipitado de proteína de RNA a 11.000 Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius após lavagem com etanol a 70% de ar seco e ressuspenda o precipitado.

Um tampão de amostra de página SDS Antes de prosseguir com a análise de western blot para extração de RNA Resus, suspenda cada precipitado de proteína de RNA em tampão de lise contendo 0,1% SDS digerir um componente proteico do precipitado com dois miligramas por mililitro de proteinase K por 30 minutos. Em banho-maria a 55% Celsius, adicione um volume de clorofórmio fenol, dois volumes de clorofórmio e 0,1 volume de acetato de sódio molar pH quatro. Deixe descansar no gelo por 15 minutos.

Centrifugar a 10 000 GS a quatro graus Celsius durante 20 minutos. Colete a fase aquosa resultante de cada amostra de RNA precipitado adicionando um volume de isopropanol e 0,2 microgramas por microlitro de glicogênio e deixando-o a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, gire o precipitado a 10.000 Gs a quatro graus Celsius por uma hora.

Remova o sobrenadante e lave o pellet de RNA com etanol frio a 70%, ressuspenda o pellet de RNA em um pequeno volume de RNAs. Água grátis. Avalie a quantidade e a qualidade do RNA usando o fotômetro do espectro.

Aqui são mostrados perfis polissômicos representativos de extratos citoplasmáticos. Preparado a partir de células helicoidais cultivadas em condições normais ou após tratamento com o inibidor de proteassoma por quatro horas e centrífuga fez um gradiente linear de sacarose de 15 a 55% volume para peso. As posições de 40 s ribossomos 60 s, ribossomos 80 s, monos e polissomos são indicadas em cada perfil.

As frações de cima para baixo do gradiente são mostradas da esquerda para a direita, as frações foram coletadas e analisadas por Western blot com anticorpos contra a proteína L 28 ribossômica grande, bem como a proteína associada ao polissomo FMRP que servem como controles para a integridade do polissomo em condições normais de crescimento. Os complexos de iniciação da tradução são convertidos em polirribossomos cuja detecção por perfil de polissoma atesta uma iniciação ativa da tradução, como observado aqui. O tratamento com o inibidor de proteassoma reduz os picos de polissoma com um aumento concomitante de um DS Monos, indicando uma inibição do início da tradução Ao participar deste procedimento, é importante trabalhar em um ambiente livre de r nase para lidar com gradientes com cuidado e controlar a lise celular Após este procedimento.

Outros métodos, como sangue ocidental e sangue norte, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a associação de proteína específica ou M MNA com polissomo é afetado pelo tratamento anticâncer após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da tradução ária explorarem o impacto da regulação dos fatores de iniciação da tradução em doenças humanas, como câncer e doenças neurodegenerativas.