Redução de Concentração e Durações Itraconazol são bem sucedidos no tratamento

O objetivo geral deste procedimento é tratar anfíbios infectados com o fungo anfíbio Kitt, Bera key tridium, dendro, he ou BD, utilizando a quimioterapia antifúngica com at triazole. Isso é realizado primeiramente cultivando culturas de BD e inoculando os animais com o patógeno fúngico. O segundo passo consiste em testar os animais por meio da extração de DNA e QPCR em swabs de pele para confirmar a infecção por BD.

Em seguida, os animais infectados são tratados mediante banho com solução de econazol a 0,0025% durante cinco minutos por dia, durante seis dias. O passo final é monitorar o estado da infecção nos animais tratados, realizando análise de QPCR em swabs de pele por um período mínimo de quatro semanas após a conclusão do tratamento, a fim de garantir o sucesso do tratamento do animal. Este procedimento demonstra que uma concentração reduzida e um tempo de tratamento mais curto do antifúngico itraconazol são eficientes para o tratamento de animais infectados com bd. A principal vantagem do uso deste regime terapêutico em comparação com a dose recomendada de tratamento, que consiste em uma solução de itraconazol a 0,01% durante 11 dias, é que uma concentração reduzida equivalente a um quarto da dose recomendada e um tempo de tratamento reduzido para seis dias ainda é eficaz no tratamento da infecção por BD, mas também minimiza os efeitos colaterais negativos associados ao uso da dose recomendada.

Após a incubação do BD em caldo tritão conforme descrito no protocolo textual e verificação do movimento de esporos Zo, alague cada placa com cinco mililitros de água da torneira envelhecida e aguarde 10 minutos para permitir que os esporos ZO entrem no meio. Em seguida, transfira a suspensão de esporos Zo para um recipiente portátil. Estime a concentração de esporos ZO com um hemocitômetro e dilua a mistura até uma concentração de um vezes 10 elevado a seis por três mililitros com água da torneira envelhecida para inocular um animal, como o Latoria vei Alpina mostrado aqui.

Segure-o sobre um recipiente de 50 mililitros e despeje três mililitros da mistura de inóculo sobre seu venter. Em seguida, coloque o animal dentro do recipiente com o escoamento do inóculo. Tampe o recipiente e deixe o animal no recipiente de inoculação por 24 horas para garantir a infecção.

Para evitar contaminação com o patógeno BD, remova as luvas usadas e coloque-as para serem autoclavadas antes da eliminação. Após colocar um novo par de luvas, prossiga para inocular o próximo animal.

Após 24 horas de inoculação, devolva os animais aos seus terrários individuais desinfetados por duas semanas. Lembre-se de desinfetar todos os resíduos líquidos antes da eliminação, levando a solução a 10% de água sanitária após duas semanas. Teste a infecção bem-sucedida por BD por meio da coleta de swab dos animais com um cotonete estéril.

Rodando suavemente o swab durante e entre os movimentos. Realize cinco passagens na região ventral em cada lado, em cada coxa e em cada um dos quatro membros, totalizando 45 passagens. Armazene os swabs em tubos microcentrífuga de 1,5 mililitro a menos 20 graus Celsius.

Extraia o DNA genômico dos cotonetes usando um kit comercialmente disponível de isolamento de DNA e realize a QPCR conforme descrito no protocolo do texto. Prepare três banhos de tratamento, um para cada uma das três doses de itraconazol conforme descrito no protocolo do texto. Em seguida, coloque individualmente os anfíbios em desinfetados.

Recipientes de 50 mililitros com 35 mililitros da solução de tratamento. Lembrando-se de trocar as luvas entre os animais, agite suavemente o recipiente ocasionalmente para garantir que os animais fiquem completamente cobertos durante cinco minutos. Após cinco minutos, devolva os animais à sua área desinfetada.

Repita o tratamento de cinco minutos diariamente por mais cinco dias. Teste os animais novamente para infecção por BD uma semana após a conclusão do tratamento e uma vez por semana durante quatro semanas para garantir que a infecção foi eliminada. Observe que, mesmo após a conclusão do tratamento, os animais devem ser tratados como se ainda representassem um risco de contaminação.

Os animais precisam ser mantidos em áreas separadas por pelo menos um mês após a infecção. Se o tratamento for bem-sucedido, ele deve ser repetido. Espécies diferentes e diferentes estágios de vida respondem de maneira distinta à infecção e aos regimes de tratamento, e, portanto, o tratamento deve ser testado antes de ser amplamente implementado.

Como o BD é um agente biológico perigoso, desinfete semanalmente o terrário individual imergindo o terrário e os recipientes de tratamento em uma solução de água sanitária a 10%. Mergulhe por pelo menos 30 segundos, remova a água sanitária com duas lavagens com água e deixe os recipientes secarem por 24 horas antes da reutilização para sobrevivência dos sapos. A seguir, são mostrados os resultados após 11 dias de tratamento com BD ou seis dias de tratamento com BD.

As setas pretas indicam o último dia do tratamento. As linhas contínuas indicam a sobrevivência dos grupos controle. As linhas pretas contínuas referem-se aos animais que foram positivos para BD, mas não receberam o tratamento com BD.

As linhas cinza sólidas representam animais que foram BD negativos e não receberam tratamento com BD. As linhas tracejadas mostram a sobrevivência dos grupos tratados que receberam a concentração indicada de econazol. Todos os animais tratados com 0,0025% em nebulizador por seis dias foram BD negativos quatro semanas após o término do tratamento, sendo assim considerado este tratamento bem-sucedido.

Além disso, esta dose de tratamento com econazol não diferiu significativamente na mortalidade quando comparada aos controles positivos de BD. Observe que os tratamentos com econazol a 0,01% e 0,005% durante 11 dias resultaram em um aumento significativo da mortalidade em comparação com os controles positivos de BD. Não se esqueça de que o patógeno fúngico BD é um agente biológico perigoso, exigindo precauções como o uso e troca de luvas, autoclavagem de todos os resíduos sólidos e desinfecção.

Todos os resíduos líquidos devem ser tratados ao seguir este procedimento.