Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome

O objetivo geral do experimento a seguir é alcançar o maior número de identificações de proteínas do epitélio sensorial coclear usando várias técnicas proteômicas. Isso é conseguido isolando a cóclea, o epitelial sensorial de camundongos adultos e o sonicado em tampão de lise para obter proteína como uma segunda etapa. Diferentes estratégias de digestão são aplicadas ao lisado inteiro ou ao lisado de proteína fracionado para aumentar a cobertura de peptídeos e sequências de proteínas.

Em seguida, diferentes técnicas de separação são utilizadas, incluindo forte troca catiônica e cromatografia de fase reversa para reduzir a complexidade da amostra antes da análise de espectrometria de massa. Os resultados mostram a identificação de um grande número de proteínas de membrana e solúveis para o epitélio sensorial da cóclea de camundongo usando várias abordagens proteômicas e um espectrômetro de massa de alta resolução. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como microarray de anticorpos e eletroforese em gel bidimensional, é que um grande número de proteínas solúveis e de membrana é identificado, aumentando assim os dados do proteoma coclear.

Embora esse método possa fornecer informações sobre biomarcadores relacionados a deficiências auditivas e lacrimejantes, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a identificação de biomarcadores relacionados à idade e câncer de mama ou pulmão. Este método também pode ser aplicado ao estudo de outras amostras biológicas, como sangue. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando observamos o conjunto de dados proteômicos limitado disponível no ouvido interno de mamíferos e, em particular, o número limitado de proteínas de membrana que foram identificadas antes de iniciar este procedimento.

Isole o epitélio sensorial coclear de camundongos pós-natais no dia 30. Depois de lavar o tecido com um tampão fosfato, adicione 100 microlitros de tampão de lise ao tecido e sonice a mistura por 30 segundos no gelo usando um desmembramento sônico. Resfrie o lisado em gelo por um minuto entre cada sonicação e, em seguida, sonice a amostra um total de três vezes.

A Centra fundiu a suspensão a 16.000 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Quando terminar, retenha o sobrenadante para digestão. Em seguida, adicione uma alíquota de 30 microlitros de extrato de proteína coclear diretamente a um filtro de rotação de 30 K e misture com 200 microlitros de uréia de oito molares na centrífuga Riss HCL.

A mistura a 14.000 vezes G por 15 minutos. Quando terminar, dilua o concentrado com 200 microlitros de solução de ureia de oito molares e repita a centrifugação nas mesmas condições de antes. Em seguida, adicione 10 microlitros de 10 XI oto acetamida e 90 microlitros de solução de ureia de oito molares ao concentrado no filtro e no vórtice por um minuto.

Depois de colocar o filtro de centrifugação em um rack de microcentrífuga, incubar por 20 minutos em temperatura ambiente no escuro após centrifugação a 14.000 vezes G por 10 minutos a 0,1 microgramas por microlitro de endo protease ly C em uma proporção de uma enzima para 50 para proteína, e incubar a mistura durante a noite a 30 graus Celsius. Quando terminar, adicione 40 microlitros de solução de bicarbonato de amônio 100 milimolar à unidade de filtro e centrifugue a mistura a 14.000 vezes G por 10 minutos Depois de repetir a etapa anterior, lave a unidade de filtro com 40 microlitros de uréia de oito molares. Em seguida, lave a unidade de filtro duas vezes com 40 microlitros de água mili Q.

Uma vez que a unidade de filtro tenha sido lavada três vezes com 100 microlitros de solução de bicarbonato de amônio 50 milimolares, adicione 0,4 microgramas por microlitro de tripsina em uma proporção de uma enzima para 100 proteínas e incube a mistura durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, eluir os peptídeos trípticos adicionando 40 microlitros de solução de bicarbonato de amônio 50 milimolares à unidade de filtro e centrifugar a mistura a 14.000 vezes G por 10 minutos. Em seguida, repita esta etapa mais uma vez.

Neste ponto, injete 50 a 100 microgramas de amostra de proteína digerida em uma coluna de troca catiônica forte de 200 por 2,1 milímetros e cinco micrômetros Para separar os peptídeos, monitore as frações peptídicas a 280 nanômetros e colete as frações em intervalos de dois minutos. Usando um coletor de frações, seque as frações em um concentrador a vácuo. Quando terminar, armazene as frações secas a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para uso em cromatografia líquida.

Análise de espectrometria de massa em tandem. Em outra abordagem, o fracionamento livre de gel foi usado para separar a mistura de proteínas. Uma vez que o sobrenadante da proteína coclear tenha sido dessalinizado por precipitação de acetona, adicione 30 microlitros de tampão de amostra cinco x à proteína dessalinizada previamente suspensa em 112 microlitros de água Milli Q.

Em seguida, adicione oito microlitros de um molar DTT e aqueça a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos para reduzir as ligações dissulfeto de proteína. Após o aquecimento, deixe a mistura esfriar. Adicione oito mililitros de tampão de corrida ao reservatório do ânodo, 150 microlitros de tampão de corrida à câmara de coleta de amostras e seis mililitros de tampão de corrida ao reservatório do cátodo.

Após essa carga, 150 microlitros da mistura de proteína coclear na câmara de carregamento da amostra, usando um cartucho de acetato de 8% tris com uma faixa de massa de 3,5 a 150 kilodaltons. Depois de iniciar a execução, colete a amostra da câmara de coleta de amostras em cada intervalo pausado no instrumento usando uma pipeta e adicione a um microtubo recém-rotulado. Em seguida, lave a câmara de coleta duas vezes com 150 microlitros de tampão corrido e descarte.

Após eletroforese em gel 1D das frações livres de gel. Adicione cada fração individual diretamente a uma unidade de filtro de 30 K. Em seguida, misture cada fração com 200 microlitros de ureia de oito molares em tris HCL após centrifugação a 14.000 vezes G por 25 minutos, adicione 10 microlitros de 10 XI oto acetamida em solução de uréia ao concentrado em cada unidade de filtro e vórtice por um minuto.

Depois de colocar os filtros de centrifugação em um rack de microcentrífuga, incube as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, adicione 0,1 microgramas por microlitro de LY C para uma proporção de uma enzima para 50 proteínas às unidades de filtro após incubação noturna a 30 graus Celsius, adicione 40 microlitros de solução de bicarbonato de amônio a 100 milimolares aos filtros de rotação e centrifugue as amostras a 14.000 vezes G por 10 minutos após repetir a etapa anterior uma vez, Lave os filtros de centrifugação três vezes com 100 microlitros de solução de bicarbonato de amônio 50 milimolares Adicione 0,4 microgramas por microlitro de tripsina em uma proporção de uma enzima para 100 proteínas após a lavagem final. Uma vez que as amostras tenham sido incubadas durante a noite a 37 graus Celsius, eluir os peptídeos trípticos de cada unidade de filtro adicionando 40 microlitros de solução de bicarbonato de amônio 50 milimolar e centrifugar as amostras a 14.000 vezes G por 10 minutos.

Depois de repetir isso, passo uma vez, analise as amostras por espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida. Foram utilizados dois procedimentos de dupla digestão. A primeira foi uma digestão tríptica, seguida por uma segunda digestão com tripsina, que foram agrupadas fracionadas em uma coluna de troca catiônica forte em 18 frações e analisadas por espectrometria de massa em tandem de cromatografia nano líquida.

Um total de 1.485 proteínas foram identificadas com 1% FDR ao realizar uma espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida de execução única. Usando esta abordagem experimental. Dentre as proteínas identificadas, 324 e 258 proteínas foram categorizadas em mitocôndria e membrana plasmática, respectivamente.

O segundo procedimento de dupla digestão consistiu na digestão de lis-C, seguida de digestão de tripsina. Cada digestão foi carregada individualmente e separada na coluna de troca catiônica forte em 18 frações e analisada por espectrometria de massa em tandem de cromatografia nano líquida. Os resultados das digestões LY C e tripsina produziram um total de 3.503 proteínas com 1%FDR.

Além disso, 605 e 617 proteínas foram categorizadas em mitocôndria e membrana plasmática, respectivamente. Essa abordagem forneceu o maior número de IDs de proteínas associadas à membrana. Análise duplicada do LY C e tripsina.

As frações mostraram que mais de 65 das proteínas identificadas foram compartilhadas entre os experimentos. No entanto, também havia proteínas recém-identificadas na análise de replicações. Os peptídeos e proteínas adicionais foram identificados devido a pequenas mudanças na cromatografia, levando a diferentes peptídeos para fragmentação.

Um gel de corante de prata foi preparado para visualizar os resultados do fracionamento sem gel conforme ilustrado. Aqui, o gel mostrou separação de proteínas aumentando o peso molecular para cada fração consecutiva. Portanto, as 12 frações líquidas livres em gel foram digeridas usando duas abordagens diferentes de digestão multifacetada e analisadas por espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida.

A primeira abordagem de digestão foi realizada usando uma digestão dupla de tripsina, o que levou à identificação de 2.165 proteínas com 1% FDR ao realizar uma espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida de execução única. Neste experimento, 516 e 399 proteínas foram categorizadas em mitocôndria e membrana plasmática, respectivamente. A segunda abordagem de digestão foi realizada usando endo proteinase ly C seguida de digestão de tripsina, cromatografia líquida de corrida única.

A análise de espectrometria de massa em tandem identificou 2.211 proteínas com 1% FDR. Esta abordagem mostrou um número semelhante de proteínas associadas à membrana como ao usar a abordagem tripsina tripsina, os dados proteômicos de espectrometria de massa foram depositados no Proteome Exchange Consortium com o identificador de conjunto de dados PXD 0 0 0 2 3 1. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a contaminação em todas as etapas e manter o tecido no gelo ao realizar a extração de proteínas para evitar a degradação das proteínas.