Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

O objetivo geral do procedimento a seguir é examinar a capacidade dos progenitores hematopoiéticos purificados de dar origem a células dendríticas plasmocitóides em manchas de pire intestinal após a transferência adotiva. Isso é feito realizando primeiro a transferência hidrodinâmica de genes do plasmídeo, codificando o fator de crescimento da célula dendrítica. FLIT três ligantes em camundongos com deficiência de células dendríticas plasmocitóides de PI.

Na segunda etapa, as células progenitoras dendríticas comuns são isoladas da medula óssea do tipo selvagem por separação de esferas magnéticas e classificação por fluxo. Na etapa final, as células progenitoras são transferidas adotivamente por injeção intravenosa em camundongos com deficiência de células dendríticas plasmocitoides que foram tratados por transferência hidrodinâmica de genes. Em última análise, a população de células dendríticas plasmocitoides do PI derivada de células progenitoras hematopoiéticas do doador pode ser avaliada por citometria de fluxo.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como qual é a origem do desenvolvimento das células plasmáticas Cy Dendri que se localizam dentro das manchas piratas. Embora este método possa fornecer informações sobre a origem das células dendríticas plasmocitoides de manchas de piras. Também pode ser aplicado para entender como as células dendríticas plasmocitoides afetam as populações de linfócitos dentro desses tecidos.

Dois dias antes da transferência adotiva, dilatar os vasos sanguíneos de cinco camundongos receptores nocaute para receptor de interferon alfa CD 45 2 positivo sob uma lâmpada de calor por cinco a 10 minutos. Em seguida, para cada camundongo, coloque o animal em uma contenção e desinfete a cauda com etanol 70%. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 para injetar cinco microgramas de plasma e revestimento de três ligantes e dois mililitros de PBS estéril na veia da cauda de cada animal.

Para a coorte de controle, injete cinco microgramas de vetor vazio. Depois de monitorar os ratos por 15 a 30 minutos, devolva-os ao seu alojamento. No dia do experimento, colocar o fêmur e a tíbia dissecados de 10 camundongos CD 45 1 C 57 pretos congênicos em uma placa de cultura contendo meios completos.

Em seguida, insira uma agulha de calibre 27 em uma extremidade de cada osso e use um meio completo para lavar a medula óssea no prato três vezes por osso. Certifique-se de que as células da medula óssea estão sendo removidas, confirmando se a mídia expelida parece turva. Faça uma suspensão de célula única pipetando suavemente o meio para cima e para baixo três a cinco vezes na placa de cultura.

Em seguida, remova os detritos passando as células da medula óssea por um filtro de células de 40 micrômetros e interrompa quaisquer aglomerados de células aplicando suavemente a extremidade de um êmbolo de seringa estéril. No filtro, gire as células, remova os sobrenadantes e piolhos os glóbulos vermelhos em dois mililitros de tampão de lise por quatro a seis vezes 10 elevado às sétimas células por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de fax às células da medula óssea e gire por quatro minutos a 500 vezes G em temperatura ambiente.

Depois de aspirar suavemente o supnatin, lave o pellet em 10 mililitros de tampão de fax. Em seguida, core as células com o marcador de linhagem hematopoiética reconhecendo anticorpos após a coloração e lavagem de anticorpos. Incube as células com microesferas magnéticas anti-rato de cabra.

Durante a incubação de microesferas, carregue uma coluna LD máxima em um separador de células MIDI max e pré-enxágue a coluna com dois mililitros de buffer de fax. Em seguida, coloque um tubo cônico de 15 mililitros sob a coluna e carregue até cinco vezes 10 até as oitavas células em 2,5 mililitros de buffer de fax na coluna. Lave a coluna três vezes com dois mililitros de tampão de fax por lavagem, coletando as células negativas de linhagem que passam pela coluna no tubo de 15 mililitros.

Conte as células iludidas. Em seguida, depois de corar as células com os anticorpos conjugados fluorescentes apropriados, transfira a amostra para um tubo de fax para classificar os progenitores dendríticos comuns com base no perfil de marcador desejado. Colete as células purificadas por fax em um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de mídia completa e, no final da execução do fax, registre o número absoluto de células classificadas.

Depois de girar, as células diluem uma vez 10 elevado a um quinto dos progenitores dendríticos comuns purificados por 100 microlitros de volume total de PBS estéril por camundongo e aspiram as suspensões celulares em uma seringa equipada com agulhas de calibre 27. Em seguida, injete as células progenitoras positivas CD 45 1 na veia da cauda de cada camundongo nocaute do receptor CD 45 2 positivo para o receptor de interferon alfa, conforme demonstrado sete a 10 dias após a transferência adotiva. Remova os intestinos dos camundongos injetados progenitores de células dendríticas comuns, colocando os tecidos em toalhas de papel embebidas em PBS.

Em seguida, use uma pinça fina e uma tesoura para coletar todas as manchas visíveis das piras ao longo da parede do intestino delgado. Observe que as manchas de piras geralmente são estruturalmente distintas, mesmo dentro de um único mouse, portanto, tome cuidado para garantir que todas as manchas de P'S sejam identificadas e dissecadas. Lave as manchas isoladas de P'S três vezes em uma placa de Petri contendo PBS usando uma pinça para remover as fezes.

Em seguida, digerir os adesivos P'S com um miligrama por mililitro, colagenase quatro em 10 mililitros de HBSS em um frasco de 50 mililitros com agitação vigorosa a 37 graus Celsius. Após uma hora, despeje os adesivos de PIs digeridos em um filtro de células de 40 micrômetros e use um êmbolo de seringa estéril para forçar as células em um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de girar a suspensão de células filtradas, ressuspenda o pellet em seis mililitros de solução de chamada de 37% e transfira-o para um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, coloque suavemente seis mililitros de solução de 70% por chamada embaixo para formar um gradiente por etapa de chamada. Agora separe as células por 20 minutos a 800 vezes G em temperatura ambiente com a quebra. Em seguida, colete a população de células mononucleares na interface.

Após peletizar as células coletadas, lave-as duas vezes em 50 mililitros de meio completo. Em seguida, core-os com os anticorpos apropriados para detectar o adesivo PYS positivo para CD 45 1. Células dendríticas plasmocitoides que derivam dos progenitores positivos CD 41 transferidos adotivamente.

Analise as células por citometria de fluxo. As células dendríticas plasmocitoides podem ser identificadas por seu fenótipo CD 11 C positivo clec H positivo, PDCA um B positivo, dois 20 fenótipo positivo CD 11 B negativo. Finalmente, determine o número absoluto de células dendríticas plasmocitóides usando esta equação.

Esses gráficos de pontos indicam a estratégia de passagem para o isolamento de progenitores dendríticos comuns. Para células da medula óssea de camundongos, como acabamos de demonstrar, os progenitores dendríticos comuns compreendem aproximadamente 0,1% do total de células da medula óssea e cerca de quatro a seis vezes 10 elevado ao quarto. Dessas células podem ser isoladas de um camundongo para identificar células dendríticas plasmocitoides de PI por citometria de fluxo.

Uma estratégia inicial de bloqueio de dispersão para frente e para o lado é usada, seguida de bloqueio para células positivas clec H CD 11 C positivas. Os camundongos nocaute para o receptor de interferon alfa exibem uma redução significativa nas células dendríticas plasmocitoides do patch pys em relação aos camundongos do tipo selvagem. As células progenitoras dendríticas comuns também se diferenciam em células dendríticas convencionais.

Em contraste com as células dendríticas plasmocitóides, as células dendríticas convencionais CD 11 C positivas clec H negativas são observadas em quantidades semelhantes em camundongos selvagens e knockout. Portanto, os camundongos knockout para o receptor de interferon alfa fornecem uma oportunidade de examinar a reconstituição de células dendríticas plasmocitoides do patch PS sem os efeitos da irradiação letal. A transferência adotiva de progenitores dendríticos comuns de tipo selvagem para camundongos nocaute para o receptor de interferon alfa, como acabamos de demonstrar, estimula um aumento nas células dendríticas plasmocitoides de patch PIs.

Além disso, o pré-tratamento com transferência hidrodinâmica de genes de três ligantes FL aumenta ainda mais a expansão das células dendríticas plasmocitóides em manchas de PIs, o que implica que progenitores dendríticos comuns transferidos e possivelmente progenitores positivos de FL três endógenos respondem ao ligante FL três induzindo células dendríticas plasmocitóides de remendo de. Ambas as condições também estimulam a produção de células dendríticas convencionais CD 11 C positivas clec H negativas consistentes com a origem do desenvolvimento das células dendríticas convencionais. As células dendríticas plasmocitóides do patch PYS expressaram marcadores tradicionais de células dendríticas plasmocitóides, incluindo clec H, PDCA um e B dois 20 e LAC CD 11 B.In Além disso, a análise dos adesivos PYS de camundongos nocaute para o receptor de interferon alfa que recebem transferência hidrodinâmica de genes de três ligantes FL e progenitores dendríticos comuns transferidos mostra que cerca de 70% das células dendríticas plasmocitóides são derivadas de progenitores dendríticos comuns positivos do doador CD 45 1

Coletivamente, esses dados demonstram que a transferência adotiva de progenitores dendríticos comuns induz a população de células dendríticas plasmocitóides do patch PIs em resposta a sinais mediados por três ligantes FL in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e identificar células D plasmocitoides pars patch.