Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

O objetivo geral deste procedimento é observar e caracterizar os movimentos do arco faríngeo na cabeça do peixe-zebra em desenvolvimento. Isso é feito primeiro incorporando um embrião de peixe-zebra transgênico em gel anestésico acrost. O segundo passo é montar o embrião embebido em agarose em uma gota de metilcelulose em uma lâmina de microscópio.

Em seguida, o embrião é selado entre duas lâminas de microscópio com graxa a vácuo. Em última análise, a microscopia confocal de lapso de tempo é usada para mostrar as diferenças entre o peixe-zebra selvagem e mutante e os movimentos morfogenéticos dos arcos faríngeos. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos de imagem estática é que ela captura o desenvolvimento do arco faríngeo em tempo real, permitindo que o investigador observe diretamente os movimentos do tecido que são críticos para a morfogênese.

Para fazer uma lamínula com ponte, super cola, uma tampa de vidro de 22 por 22 em cada extremidade de uma tampa de vidro de 24 por 60. Deixando o meio livre. Faça singles para embriões com menos de um dia de idade.

Duplas para embriões de um a quatro dias de idade ou triplas para embriões, com cinco dias ou mais. E para cada espécime, use duas lamínulas em ponte. Agora encha uma seringa de 10 mililitros com graxa de alto vácuo.

Prepare o anestésico fresco em 0,2% de aros líquido e mantenha em um bloco de aquecimento de 42 graus Celsius. Para desmontar manualmente os embriões transgênicos não eclodidos, rasgue lentamente o Corian até que o embrião seja liberado. Agora transfira os embriões revestidos para meios limpos contendo MS 2 22 e estéticos.

Para preparar uma lamínula em ponte, empurre lentamente a graxa a vácuo para fora da seringa, fazendo um cordão contínuo liso que fica adjacente e dentro das pontes e da borda da lamínula. Espalhe um círculo de 4% de metilcelulose no meio da ponte para cobrir a lamínula. Quando o embrião estiver anestesiado, coloque-o em uma pipeta de vidro.

Segure a pipeta verticalmente para permitir que o embrião afunde até o fundo do líquido na pipeta. Em seguida, mova a pipeta para a solução agro e deixe o embrião cair no aros sem expelir o líquido. Desenhe um pouco de solução agrícola e o embrião na pipeta.

Em seguida, expulse o embrião em uma gota de solução aro. Em cima da metilcelulose. Empurre o embrião para baixo na metilcelulose e oriente o embrião conforme desejado para a imagem para selar a amostra.

Coloque uma lamínula em ponte em cima da montada voltada para baixo. Aplique pressão uniforme em ambos os lados das lamínulas imprensadas até que as pontes entrem em contato direto e os agros soltem vedações em ambas as lamínulas. Verifique se o embrião está devidamente orientado.

Esfregue um aplicador de madeira ao longo do vidro para suavizar rachaduras e lacunas na velocidade da graxa a vácuo. Limpe o excesso de gordura das bordas. Ative o microscópio confocal e quaisquer dispositivos a laser externos.

Ligue também o computador conectado ao microscópio confocal e selecione o sistema de inicialização e o software de imagem confocal. Em seguida, abaixe a plataforma de preparação do microscópio confocal e mova as lentes objetivas para fora da posição. Substitua o estágio padrão por um estágio aquecido eletrônico.

Ligue o controlador para o aquecido stage e defina a temperatura para 29.5 graus Celsius. Coloque a amostra montada no stage aquecido. Mova a lente objetiva de 20 x para a posição e levante a plataforma de preparação.

Em seguida, ative o emissor de luz visível e centralize a cabeça do embrião no campo de visão. Para ativar os canais de fluorescência, selecione o comprimento de onda fluorescente a ser detectado e escolha tabelas de pesquisa de cores para cada canal. Para cada canal de fluorescência, defina a intensidade do laser para 10.0 e a tensão do fotomultiplicador entre 600 e 700.

Para reduzir o fundo e aumentar as informações fluorescentes coletadas, defina a média para dois ou quatro e a profundidade de bits para 16 bits. Ative a pilha ZS e os módulos de série temporal. Ajuste o orifício, se necessário.

Defina o intervalo de tempo e a duração do experimento. Gire a câmera para o modo ao vivo. Ajuste o foco e aumente a intensidade do laser, se necessário.

Para ver a fluorescência. Defina o zoom digital para 0,6 para uma visão mais ampla. Se desejar.

Posicione o palco de forma que todas as estruturas de interesse sejam visíveis e haja espaço no campo de visão para crescimento. Foco dorsal e anterior através do embrião até os limites superior e inferior da fluorescência. Defina a primeira e a última posição da fatia Zack pelo menos 100 micrômetros ou mais além desses limites.

Em seguida, defina a tabela de pesquisa de exibição para indicadores de intervalo para que as estruturas fluorescentes apareçam em um tom de cinza e o resto do campo seja azul ou preto. Se necessário, aumente a tensão do multiplicador de fotos para um nível logo abaixo de onde aparecem os pixels vermelhos saturados. Se as estruturas fluorescentes parecerem vermelhas, reduza a intensidade do laser e/ou o ganho até que fiquem com um tom de cinza.

Se necessário, ajuste o deslocamento. Portanto, as áreas fora da amostra são azuis. Defina o para o menor diâmetro que permite que as imagens sejam coletadas em tempo hábil.

O intervalo Z deve sempre ser definido para a distância ideal sugerida para o diâmetro do orifício, realizar varreduras curtas para testar as configurações, sempre usando a menor intensidade de laser possível. Agora execute o experimento pelo período de tempo desejado. Em seguida, remova o embrião do estágio aquecido e separe lentamente as lamínulas, mergulhe a tampa, a lama e o embrião em uma placa de Petri de 30 milímetros.

Usando uma pipeta de vidro, lave suavemente o embrião da lamínula e remova a lamínula da placa de Petri. Coloque o embrião em uma incubadora de 28,5 graus Celsius para continuar a se desenvolver. No final dos experimentos, tire imagens individuais de Zack de embriões irmãos montados em agros que foram encenados de forma semelhante ao espécime no início dos experimentos, mas foram criados em um EM e uma incubadora de 28,5 graus Celsius.

Meça os arcos faríngeos conforme necessário usando software confocal ou outro software de processamento de imagem em embriões selvagens. Seguindo a população da crista neuro, os arcos faríngeos se alongam ao longo dos EAs ventrais posteriores e dorsais enquanto se movem na direção rostral. Em sua extremidade anterior, o primeiro arco faríngeo forma domínios maxilar e mandibular separados pelo ectoderma oral, os principais movimentos morfogenéticos são muito interrompidos em mutantes suavizados.

Aqui, o sétimo arco faríngeo não consegue migrar para se sobrepor a arcos mais anteriores 48 horas após a fertilização. Os cinco mutantes do peixe-zebra SM têm vários defeitos faciais cranianos. Nessas imagens confocais estáticas.

As fusões nos domínios ventrais do segundo e terceiro arcos são aparentes 32 horas após a fertilização. Usando microscopia confocal de lapso de tempo, analisamos a morfogênese dos arcos faríngeos. Em Smad, cinco fusões mutantes entre o segundo e o terceiro arcos aparecem primeiro 32 horas após a fertilização.

Consistente com a análise estática. Embora a expressão dos membros da família PDGF sugira que ela pode estar amplamente envolvida na morfogênese do arco faríngeo, o movimento dos arcos posteriores parece normal. Nos mutantes P-D-G-F-R-A, é a morfogênese do primeiro arco faríngeo que parece especificamente interrompida.

Este procedimento é passível de outras técnicas comumente usadas de peixe-zebra, como injeção de morfo ou a geração de mosaicos genéticos. As análises de lapso de tempo permitem a análise direta das consequências dessas manipulações. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imagens in vivo de lapso de tempo de embriões de peixe-zebra transgênicos, anestesiando e montando amostras adequadamente e definindo parâmetros ideais para microscopia confocal.