Name: Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a isolar células T duplamente negativas purificadas de rim murino usando digestão com colagenase e seleção magnética. Este protocolo permite estudar a função imunológica dessas células em lesão renal aguda.

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Este trabalho é apoiado pelo NIH PBS (R21 AI095484). Agradecemos NHI tetramer instalação do núcleo para CD1d tetrâmero.

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e Reagentes <ol><li> Instrumentos: Preparar os reagentes em condições estéreis e usar em uma capela de fluxo laminar. </li><li> Prepare 1 litro de meio de cultura RPMI tecidos, adicionam-se 5% de soro fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato de 100 vezes, 10 mg de HEPES, piruvato de sódio 1 mg e 10 ml de 100x de penicilina / estreptomicina. Nota: o meio de cultura de tecidos recomendados, RPMI, é intercambiável com DMEM. </li><li> Preparar a solução de 5% de colagenase &quot;D&quot; (5 ml de colagenase &quot;D&quot; a 9 ml de meio de cultura de tecido). </li><li> Adicione uma solução de Percoll a três concentrações diferentes: 100%, 80% e 40%. As seguintes concentrações são calculados para um amostra. Manter as soluções à temperatura ambiente. <ol><li> Solução de Percoll: adicionar 9 ml de Percoll (não diluído de solução estoque); adicionar 1 ml de PBS 10x. </li><li> Solução de Percoll: adicionar 8 mL de Percoll a 100%; adicionar 2 ml de PBS 1x. </li><li> Solução de Percoll:adicionar 4 ml de Percoll a 80%; adicionar 4 mL de PBS 1x. </li></ol></li><li> Adicione 1 L de células activadas por fluorescência tampão (FACS); adicionar 5 ml de 10% BSA (0,1% BSA), azida de sódio a 1 ml a 10% (0,1%), 2 ml agente EDTA, fazer até 1.000 ml com PBS 1x. </li></ol> 2. Preparação de rim Digestão <ol><li> Tendo adquirido qualquer aprovação institucional necessário, sacrificar e desangrar os ratos com métodos padronizados e seguindo as normas vigentes e orientações de cuidados de animais. <ol><li> Anestesiar o mouse com pentobarbital (0,07 mg / kg). </li><li> Vá para a sangria. </li><li> Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica. </li><li> Pulverizar a área abdominal com etanol a 70%. </li></ol></li><li> Adicionar 10 ml de solução de colagenase D para a placa de Petri. </li><li> Retire e decapsulate ambos os rins de cada rato. <ol><li> Abrir a cavidade abdomimal fazendo uma incisão na linha média abdominal através da pele e do peritoneu do esternoo púbis. </li><li> Expor o rim esquerdo movendo o intestino lateralmente para o lado. </li><li> Cuidadosamente deixou separar a cápsula com a pinça. Nota: A cápsula aparece como uma camada transparente em torno do rim e parcialmente coberta por tecido adiposo perirrenal. </li><li> Remover o rim esquerdo cortando os vasos do pedículo usando uma tesoura cirúrgica. </li><li> Repita o mesmo procedimento para o rim direito. Nota: O rim direito é mais cranial e mais perto da linha média (pedicelos são mais curtas). </li></ol></li><li> Coloque o rim para a placa de Petri. </li><li> Cortar o tecido renal em pedaços pequenos (1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de moldagem de metal regular e colocar as peças na solução de colagenase durante 30-45 minutos na incubadora a 37 ° C (Figura 1). </li></ol> 3. Preparação de células mononucleares do rim (KMNC) da Digestão rim <ol><li> Se obter uma suspensão de células do rimdigestão por disrupção mecânica do tecido com um filtro (70 mm) e ressuspender em 25 ml de meio de cultura de tecidos e misturar. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar a suspensão de células. </li><li> Re-suspender o sedimento em 4 ml de solução de Percoll a 40% e suavemente sobrepor em 4 ml de uma solução de Percoll a 80% com uma pipeta de transferência de plástico, muito lentamente e cuidadosamente. Isto irá resultar em duas fases claramente separadas por uma camada translúcida. Na parte superior vai ser uma camada amarela correspondente aos lípidos. </li><li> Centrifugar a 1.500 xg durante 30 minutos à temperatura ambiente com a centrífuga no freio modo. </li><li> Remover por aspiração a camada superior amarela e espessa (cerca de 1-2 ml). </li><li> Recolhe apenas uma ligeira camada translúcida esbranquiçado a partir da interface das duas fases, com uma pipeta de transferência. Transferir muito cuidadosamente esta suspensão em um tubo de 15 ml contendo 2 ml de meio de cultura de tecido e, em seguida, adicionar 13 ml de meio para perfazer um volume total de15 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as amostras em 1 ml de meio. </li><li> Contar o número de KMNC usando exclusão com azul de tripano em um hemocitómetro e exprimir os resultados como o número de KMNC por ml por rim. </li><li> Lavar uma vez como acima. </li></ol> 4. Isolamento de hematopoiéticas (CD45 +) Células de KMNC (Passo I) <ol><li> Ressuspender as células até 10 7 em 90 ul de tampão de corrida. </li><li> Adicionar 10 ul de microesferas de CD45 e incubar durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de corrida para parar a reacção. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul de tampão de corrida. </li><li> Prepare a coluna magnética, colocando no ímã e enxágüe com 3 ml de tampão de corrida. </li><li> Passar a suspensão de células através de uma coluna magnética e recolher as células não marcadas que passam através da coluna. </li><li> Lave as células três vezes com 3 ml de runnção tampão. Em seguida, coletar o efluente. </li><li> Remova a coluna do separador e pipeta de 5 ml de tampão de corrida para as colunas e expulsar a fração rotulado imediatamente. Esta fracção contém as células CD45 +. Contar as células. </li><li> Para calcular o número absoluto de células T diferentes subconjuntos em rins multiplicar o número total de KMNC pela percentagem de células positivas determinada por citometria de fluxo (Figura 2). </li></ol> 5. Isolamento de DN celular T de CD45 + Preparação de selecção negativa (Etapa II) <ol><li> Adicionar 2,5 mL (0,5 mg / mL, 1,25 ng) de cada um dos seguintes: anticorpos biotinilados anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor de Fc (CD16/32), anti-MHC classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrâmero para cada 10 células hematopoiéticas 7. </li><li> Incubar as células durante 30 minutos em câmara fria. </li><li> Adicionar 1 ml de microesferas anti-biotina. </li><li> Incubar durante 30 minutos numa sala fria. </li><li> Colocar o tubo no tele ímã e proceder ao esgotamento. </li><li> Contagem de células viáveis ​​para determinar o número total de células T DN na fracção negativa, utilizando um hemocitómetro. </li><li> Verifique a pureza das células T DN com citometria de fluxo, seguindo esta estratégia de propagação: primeiro portão CD45 +, segundo portão TCRαβ +. Excluir células CD1d +. Lote T CD4 + contra CD8 + para identificar células DN T (Figura 3). </li><li> Multiplicar o número total determinado pela percentagem em pureza. Nota: O uso deste protocolo resulta em uma população de mais de 90% de células T DN puros. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Há cada vez mais interesse em células T DN, uma vez que estão sendo implicados em diferentes condições patológicas, como doenças auto-imunes, câncer, tolerância enxerto e doenças primárias do rim, incluindo lesão renal aguda (LRA), glomerulonefrite 8, 13. Portanto, há necessidade de melhor compreender e caracterizar as funções fisiopatológicos de células T DN. No entanto, atualmente há uma falta de compreensão da função dessas células, em comparação com CD4 e células T CD8. Uma das principais razões é escasse...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Peripheral αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double-negativo células (DN) T são divididos em vários subgrupos que possuem fenótipos e funções 1-4 distintas. DN células T são pouco compreendidos mas cada vez mais a ser implicadas nas respostas imunes fisiopatológicas em diferentes modelos de doença 4-6. Células DN T são um tipo de célula imunológica única que é cada vez mais implicados na regulação de várias respostas imunes e auto-imunes ea modulação da tolerância alotransplante. 4-6, 9 Eles são raros no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos ). No entanto, eles são os principais moradores do rim e intestino epitélio normal 10-12. Muito pouco se sabe sobre sua função 7 no rim no estado estável e em condições patológicas como lesão renal aguda (LRA), associados com transpl renalformiga. Devido às funções complexas de células imunes diferentes na regulação de respostas imunes, incluindo alloresponses, a definição do papel de cada jogador é fundamental na compreensão alloresponses e concepção de novas terapias. Dado o número significativo de células T DN presentes no rim em condições fisiológicas e de doenças diferentes, as células T DN são susceptíveis de desempenhar um papel crítico na regulação das respostas imunológicas e auto-imunes em ratos e seres humanos, e alloresponses em receptores de transplante. Acumulando embora a evidência ainda espalhados implica células T DN em ambas as funções patogênicos e imunossupressores, mas é mal compreendido por que e como eles exibem uma função prejudicial ou supressiva específico e como o ambiente influencia-los. Devido à sua fraca abundância no rim, métodos melhorados de isolamento são necessárias. Não há atualmente nenhum protocolo padrão para isolamento de células T DN de the tecidos não linfóides. Nosso protocolo descreve um novo método para o isolamento de células T DN do rim; No entanto, o método também pode ser utilizado para vários tecidos não linfóides.

<table><tbody><tr><td>Capuz de fluxo laminar&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora controlada por atmosfera</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37 &graus; C com 5% de CO2)</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo analítico</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% azida de sódio (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato tampão salino (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer&nbsp;</td><td>Colunas Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas CD45+ Microesferas</td> de Biotina <td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR Azul Pacífico&nbsp; (ab-cadeia, clone: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biotinilado (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 biotinilado&nbsp; (clone 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC CLASSE II (I-A b) biotinilada</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J camundongos</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Rins - Placa de Petri para Linfonodos</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; Filtro M&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Êmbolo&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos GeneMate 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos GeneMate 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galcer tetrâmero</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de duplas células αβ t negativa do rim

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Não existe actualmente nenhum protocolo padrão para o isolamento de células T DN dos tecidos não linfóides apesar do seu envolvimento cada vez relatada em diversas respostas imunitárias. DN células T são um tipo de células imunitárias única que tem sido implicado na regulação de respostas imunes e tolerância e auto-imunes a alotransplante 1-6. Células T DN são, no entanto, raro no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos), mas são os principais habitantes do rim normal. Muito pouco se sabe sobre sua função fisiopatológica 7, devido à sua escassez na periferia. Recentemente, descreveu uma análise fenotípica e funcional abrangente desta população no rim 8 em estado estável e durante a isquemia reperfusão. Análise da função das células T DN será consideravelmente reforçada através do desenvolvimento de um protocolo para o isolamento do rim. Aqui, descrevemos um novo protocolo que permite isolation de células altamente puros ab CD4 + CD8 + T e células T DN do rim murino. Resumidamente, podemos digerir tecido renal utilizando colagenase e isolamento de células mononucleares de rim (KMNC) por gradiente de densidade. Isto é seguido por dois passos para enriquecer as células T hematopoiéticas de 3% a 70% de KMNC. A primeira etapa consiste de uma selecção positiva de células hematopoéticas CD45 + usando um kit de isolamento. No segundo passo, as células T são DN negativamente isolado por remoção das células não desejadas usando CD4, CD8, e anticorpos monoclonais de MHC de classe II e CD1d α-GalCer tetrâmero. Esta estratégia conduz a uma população de mais do que 90% de células T DN puros. Coloração de superfície com os anticorpos acima mencionados, seguida por análise FACS é usado para confirmar a pureza.

Tipo selvagem C57BL / 6 (B6) rim contém aproximadamente 1,5-2,1 x 10 6 células mononucleares por rim. Cerca de menos de 10% são células hematopoiéticas CD45 +. Para a preparação de células mononucleares do rim (KMNC), os rins são cortadas em pedaços pequenos, como mostrado na Figura 1 seguido por digestão usando 5% de colagenase. Isto é seguido por realização de uma centrifugação de gradiente de densidade para recolher camada KMNC (Figura 2, pai...

DNabT células são raras entre as células T periféricas; no entanto, eles são abundantes em certos tecidos não linfóides. Dificuldade de isolar as células T DN a partir de tecidos não-linfóides dificulta a sua análise funcional, apesar do aumento reconhecida importância fisiopatológica. Descreve-se um novo protocolo para o isolamento de células altamente purificadas DN T de rim murino.

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever como isolar linfócitos T puros e duplo negativos do rim de camundongo. Isso é realizado primeiramente digerindo o rim em uma solução de colagenase. Em seguida, as células mononucleares são separadas por gradiente de densidade, e as células hematopoéticas positivas para CD45 são coletadas por seleção positiva.No final, os linfócitos T duplo negativos podem então ser isolados por seleção negativa. Em 1998, nossa equipe descobriu que células imunes, particularmente linfócitos T, contrariamente à doutrina vigente, estavam mediando lesão renal aguda. Havia muito poucas dessas células no rim e no coração para estudo, então desenvolvemos uma técnica para melhor investigá-las.Ficamos surpresos ao encontrar uma população de células, os linfócitos T duplo negativo sem CD4 ou CD8, que estavam em alta proporção, tanto no rim normal quanto durante a lesão. A técnica detalhada e aprimorada para estudar essas células mais profundamente e investigar os mecanismos será descrita neste próximo vídeo. Temos estudado linfócitos T duplo negativo desde 2001, e recentemente nos unimos ao laboratório do Dr. Rob para modificar o método regional de isolamento dessas células, a fim de obter uma população pura que possa ser utilizada em diferentes respostas imunes biológicas.Embora este método possa fornecer uma visão sobre as células imunes no rim, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como tecidos não linfáticos. Antes de iniciar a cirurgia, primeiro adicione 10 mililitros de colagenase D a uma placa de Petri para coleta do tecido. Em seguida, pulverize a área abdominal de um camundongo eutanasiado com etanol 70%.Em seguida, faça uma incisão mediana na pele abdominal e no peritônio, da região esternal até a região púbica, e desloque o intestino lateralmente para expor o rim esquerdo. Identifique a cápsula esquerda, que aparece como uma camada transparente envolvendo o rim e está parcialmente coberta pelo tecido adiposo perirrenal, separando-a cuidadosamente do rim com pinça. Em seguida, corte o vaso pedículo com tesoura cirúrgica para remover o tecido e coloque o rim na placa de Petri.Em seguida, após remover o rim direito, utilize uma lâmina metálica comum para cortar o tecido renal em pequenos fragmentos de um a dois milímetros. Digerir os fragmentos na solução de colagenase por 30 a 45 minutos a 37 graus Celsius e, então, para isolar as células mononucleares renais, disruptar mecanicamente a suspensão renal por uma peneira de 70 mícrons. Resuspenda a suspensão celular em 25 mililitros de meio de cultura de tecidos.Em seguida, após uma rotação suave, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de solução de Percoll a 40%. A seguir, use uma pipeta de transferência de plástico para sobrepor suavemente a solução celular de Percoll a quatro mililitros de uma solução de Percoll a 80%, criando duas fases claramente separadas por uma camada translúcida. Incube as células por 30 minutos a 1500 ×g e temperatura ambiente com o freio desligado e, em seguida, aspire cerca de um a dois mililitros da camada superior espessa, amarela, rica em lipídios.Utilize uma pipeta de transferência nova para coletar a camada levemente esbranquiçada e translúcida da interface entre as duas fases em um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de meio de cultura de tecidos. Em seguida, adicione 13 mililitros de meio para completar o volume total a 15 mililitros. Após a lavagem e contagem, dilua as células a um vezes 10 à sétima em 90 microlitros de tampão de corrida.Em seguida, incubar as células em 10 microlitros de microesferas CD45 a quatro graus Celsius. Após 15 minutos, adicionar um mililitro de tampão de corrida para interromper a reação. Em seguida, centrifugar as células e reusar.Suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de corrida fresco. Em seguida, coloque uma coluna em um ímã de separação de microesferas e lave a coluna com três mililitros de tampão de corrida. Em seguida, passe a suspensão celular através da coluna magnética, coletando as células não marcadas que atravessam a coluna.Lave o tubo contendo as células três vezes com três mililitros de tampão de corrida, coletando o efluente a cada vez, e então remova a coluna do ímã. Pipete cinco mililitros de tampão de corrida na coluna e imediatamente elua a fração marcada contendo as células positivas para CD45. Em seguida, após contagem das células, incube-as em 2,5 microlitros de cada um desses anticorpos biotinilados para cada um vezes 10 à sétima potência de células hematopoéticas a quatro graus Celsius.Após 30 minutos, incubar as células por mais meia hora a quatro graus Celsius em um mililitro de microesferas antibiotina. Colocar uma nova coluna no ímã e, em seguida, aplicar as células na coluna conforme demonstrado anteriormente, coletando desta vez a fração negativa. Por fim, contar as células viáveis para determinar o número total de linfócitos T duplo negativos na fração negativa e multiplicar esse número pelo percentual de pureza determinado por análise citométrica de fluxo.Enquanto rins do tipo C 57, black six contêm aproximadamente 1,5 a 2,1 vezes 10 das seis células mononucleares por rim, menos de 10% são células hematopoiéticas positivas para CD 45. Após a centrifugação em gradiente de densidade para coletar a camada de células mononucleares renais, as células positivas para CD 45 podem ser ainda mais purificadas para cerca de 80 a 95% por separação com microesferas magnéticas positivas para CD 45. Dentre as células hematopoiéticas enriquecidas positivas para CD 45, cerca de 30 a 60% são linfócitos T duplo negativos.Seleção negativa de células CD45 positivas para remover as células positivas para CD4, positivas para CD8, positivas para classe II do MHC e positivas para tetrâmero resulta em células T duplo negativas altamente purificadas, com pureza de 90 a 95%. Utilizando este protocolo, é possível obter até 0,5 × 10⁶ células hematopoéticas CD45 positivas marcadas magneticamente por camundongo. Este procedimento proporcionará uma melhor compreensão das funções biológicas e mecanismos das frações de células T duplo negativas em diferentes doenças.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

O vídeo explica uma maneira de purificar as células B por direcionamento imunomagnético e separação da suspensão de células mononucleares do sangue periférico. O método envolve a marcação de tipos de células indesejadas com anticorpos ou ligantes específicos (ligados a partículas magnéticas) direcionados a proteínas específicas da superfície celular, a serem esgotadas da suspensão celular heterogênea por separação magnética.

Seleção Imunomagnética Negativa: Um Método para Purificar Células B de Células Mononucleares do Sangue Periférico

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento baseado em marcação magnética de uma população de baixa concentração de células T CD4+Vδ1+γδ de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Usando uma combinação de anticorpos anti-Vδ1 conjugados com FITC, microesferas magnéticas anti-FITC e esferas superparamagnéticas revestidas com anticorpos anti-CD4, as células T CD4 + Vδ1 + podem ser purificadas com sucesso da população PBMC.

Isolamento seletivo de células T CD4+ Vδ1+ γδ de células mononucleares do sangue periférico humano

Aqui, fornecemos um protocolo otimizado para o isolamento e clonagem da escassa entidade de células T Vδ1+CD4+ periféricas que é, como mostramos recentemente, um progenitor de células T αβ extratímicas. Esta técnica permite isolar quantitativamente, clonar e expandir eficientemente essas células em cultura ex vivo.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Células T, γδ um Extrathymic αβT de células progenitoras

Técnicas confiáveis e eficientes para o isolamento de células imunes renais são necessárias para aplicações a jusante. Isso requer a marcação de anticorpos de superfície de um pequeno número de células imunes renais. Aqui, descrevemos um método conciso para isolamento de células imunes renais que aparentemente atinge esse objetivo.

Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Aqui nós apresentamos um método de isolamento e cultura de romance grau clínico para rim perivasculares células do estroma (kPSCs) com base na perfusão de órgão inteiro com enzimas digestivas e enriquecimento de NG2-célula. Com este método, é possível adquirir o número suficiente de células para terapia celular.

Um método de isolamento do romance grau clínico para rim humano Perivascular de células do estroma

Apresentamos um protocolo simples para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico de sangue inteiro obtidos de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sézary, seguido pela seleção de células T CD4+, sua estimulação com phorbol12-myristate13-acetato e ionóforo A23187, e preparação de RNA para perfil transcriômico.

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

Esse protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada.

Linfodenectomia Renal Bilateral Murina

Aprenda a isolar células T duplamente negativas purificadas de rim murino usando digestão com colagenase e seleção magnética. Este protocolo permite estudar a função imunológica dessas células em lesão renal aguda.

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

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