Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

O objetivo geral deste procedimento é esticar células padronizadas sobre uma membrana elástica de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS. Isso é realizado por meio da ação de uma folha de PDMS, seguida pela aplicação de um padrão microestruturado sobre o PDMS. A folha de PDMS com padrão microestruturado é então montada no dispositivo de alongamento e uma câmara de retenção de meio é colocada em cima.

Em seguida, as células são semeadas na superfície da lâmina de PDMS com microdesenho e deixadas aderirem ao padrão antes da lavagem para remoção das células não aderidas. O passo final consiste em aplicar uma elongação ao PDMS contendo as células, para esticar as células. Em última análise, a microscopia de vídeo é utilizada para demonstrar que a aplicação de forças nas fibras de retração de células mamíferas mitóticas durante o estiramento celular resulta em deformação da célula.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de biomecânica, como quais são os efeitos de forças externas sobre processos celulares como a divisão? Tivemos a ideia inicial deste método ao querer aplicar forças sobre uma célula em divisão para iniciar o corte de um pedaço de PDMS com aproximadamente 35 por 20 milímetros a partir de uma folha pré-fabricada. Aqui, utiliza-se uma folha fina de PDMS disponível comercialmente porque é mais reprodutível e tem menor probabilidade de romper em comparação com o PDMS feito sob encomenda.

Remova as camadas protetoras superior e inferior de plástico e use pinças para colocar o PDMS em uma placa de petri de plástico. Em seguida, lave o PDMS com etanol 70% por cinco minutos em um agitador rotativo a 30 oscilações por minuto. Após a lavagem, seque a superfície passando ar sobre ela.

A seguir, ilumine o PDMS com luz ultravioleta profunda por cinco minutos, a uma distância de aproximadamente cinco centímetros das lâmpadas ultravioleta. Enquanto isso, prepare uma solução de E-D-C-N-H-S conforme descrito no protocolo no texto. A solução deve ser preparada imediatamente antes do uso, pois a reatividade da solução decai em algumas horas.

Transfira as lâminas de PDMS da placa de Petri para a tampa da placa de Petri, que não foi iluminada. Isso garantirá que o ambiente ao redor do PDMS seja altamente hidrofóbico e facilitará o próximo passo.

Pipete a solução E-D-C-N-H-S sobre o PDMS e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue o excesso de E-D-C-N-H-S com água.

Em seguida, adicione a solução de PEG enxertado com PLL e incube de três horas a durante a noite à temperatura ambiente. Após a incubação, lave o excesso de PEG enxertado com PLL da superfície do PDMS com água. O PDMS agora está passivado ou funcionalizado com PEG enxertado com PLL e pode ser armazenado por vários dias a quatro graus Celsius. Para fazer o padrão no PDMS, coloque uma folha de PDMS sobre uma máscara fotolitográfica de quartzo sintético contendo as microestruturas para padronização.

Posicione o lado de PDMS com o PEG enxertado com PLL voltado para o lado cromado da máscara fotográfica. Em seguida, ilumine por sete minutos através da máscara fotográfica a uma distância de cerca de cinco centímetros das lâmpadas de luz ultravioleta. Após a iluminação.

Adicione água sobre a máscara e o PDMS, em seguida, retire lentamente o PDMS da máscara. Monte o PDMS previamente passivado no dispositivo de alongamento. Fixe um lado do PDMS à parte fixa do esticador. Prenda o outro lado à parte móvel do esticador sem prender excessivamente a folha de PDMS.

Se o PDMS for fixado em excesso, ele se torna mais curto e isso pode levar à ruptura, pois a tensão será maior para a mesma distância de alongamento. Certifique-se de que os parafusos estejam bem apertados, caso contrário, a lâmina de PDMS irá deslizar assim que o alongamento começar, ou posteriormente durante o experimento. Em seguida, incube o PDMS com a solução de fibronectina por uma hora.

À temperatura ambiente, é possível usar outras proteínas da matriz extracelular, mas estas não foram testadas com este protocolo. Como etapa final, enxágue o PDMS com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, corte um retângulo de PDMS em um bloco grosso de PDMS.

Em seguida, recorte um outro retângulo no interior. Para obter uma câmara que retenha as células e o meio, adicione graxa de silicone sob este recorte retangular de PDMS e coloque-o sobre a folha de PDMS para criar uma câmara que retenha o meio. A graxa permitirá o deslizamento da câmara sobre a folha de PDMS durante o alongamento, possibilitando o padronamento das células.

Primeiro, desprenda as células de um frasco de cultura com 50% de confluência. Uma vez que as células estejam em suspensão, pipete-as várias vezes com uma ponteira de 200 microlitros para dissociar agregados, o que garantirá que células individuais se liguem ao padrão. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão celular na câmara.

Deixe as células se ligarem aos padrões por 10 a 30 minutos, dependendo do tipo celular, em um incubador a 37 graus Celsius. Uma vez que as células tenham aderido aos padrões, lave suavemente as células não aderidas com meio equilibrado para remover as células flutuantes.

Remova o meio com uma pipeta de aspiração enquanto adiciona simultaneamente meio. É fundamental manter um fluxo suficiente para remover as células não aderidas, ao mesmo tempo em que mantém as células submersas no meio. Em seguida, coloque um lamínula sobre a poça para evitar evaporação e vazamento do meio caso o PDMS se rompa, e deixe as células se espalharem por algumas horas sobre os padrões.

Em seguida, coloque o dispositivo em um microscópio invertido e inicie a aquisição de imagens. Evite o uso de objetivas de imersão a óleo, pois elas não funcionarão devido a problemas de foco. Para esticar as células do padrão microestruturado, gire o parafuso micrométrico enquanto corrige a posição da platina nos eixos x, y e Z.

A posição do estágio precisa ser corrigida para contrabalançar o alargamento do PDMS e a perda de foco. A técnica apresentada neste protocolo em vídeo permitiu a aplicação de forças sobre as fibras de retração de células mamíferas mitóticas mediante o alongamento do substrato no início da metáfase. Algumas dessas fibras de retração foram puxadas para longe do corpo celular, resultando em uma força mecânica aplicada sobre o córtex de células mitóticas antes do alongamento; para isso, a célula é cultivada sobre um padrão oval.

O padrão é feito com o PDMS sendo esticado durante a impressão de padrões circulares por meio da máscara fotográfica. Após o estiramento, o substrato é alongado de modo que o padrão se torne um círculo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como pode semear células em padrões macroscópicos e, em seguida, aplicar forças de estiramento ao substrato.