Name: Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a visualizar a maturação de fagossomos em macrófagos de medula óssea de camundongo usando microscopia confocal de lapso de tempo. Este método permite quantificar a entrega de conteúdo lisossômico com alta resolução temporal em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a membros do Laboratório de Biologia phagosome para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa e os fundos de rede da Associação Helmholtz) e um Programa Prioritário SPP1580 Grant do Conselho de Pesquisa Alemão (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Na seção seguinte, vamos discutir as etapas críticas do método apresentado e as suas limitações. Além disso, iremos ligar alguns dos problemas comuns com as suas soluções, introdução de modificações possíveis e considerar as vantagens de nosso método, bem como métodos complementares adequadas para esta abordagem. A preparação dos grânulos, incluindo o acoplamento de IgG para a superfície do grânulo, é essencial e deve ser evitado o uso de preparações unfresh. Em adição a isso, também é funda...

Fagócitos profissionais, incluindo macrófagos, desempenham um importante no sistema imune. Para além de ser a primeira linha de defesa do sistema imune inato, eles também desempenham um papel crítico na activação da imunidade adaptativa através da sua sinalização e apresentação de antigénio papel 1-3. Enquanto a função de fagócitos profissionais é multifacetada, maturação do fagossoma é crítica a espinha dorsal da função de processamento de antigénio e bactericida dos fagócitos profissionais 4,5. Após a imersão e absorção de um alvo fagocíticas, tais como bactérias receptor mediada, o fagossomo nascente passa por uma seqüência complexa e bem orquestrada de interação e intercâmbio com compartimentos da rede endocítica e várias outras organelas celulares 6. A natureza dos compostos trocados com essas entidades celulares, bem como a regulação e do calendário de eventos de fusão determina a phagosomal meio luminal e as phagoscomposição omal membrana e, portanto, 7, o destino do phagosome amadurecimento 8. A relevância fisiológica da maturação do fagossoma é exemplificado pelas diversas estratégias empregadas por vários patógenos intracelulares para escapar, prender ou subverter maturação phagosome 9. A maioria destas estratégias directamente ou indirectamente impedir a fase final e crítica do processo de maturação do fagossoma: a fusão do fagossoma com tardias compartimentos endossomal / lisossomal, que lhes confere, com a maior parte das enzimas hidrolíticas e factores anti-bacteriana de um fagossoma madura 7 , 8,10. A análise desta etapa final e crítico, portanto, pode fornecer-nos com fortes indicadores sobre o estado de maturação das phagosomes e se o estado fisiológico natural está a ser positiva ou negativamente afetados nas configurações experimentais particulares que estão sendo utilizados. O compartimento final endossomal / lisossomals são geralmente considerados como os compartimentos de terminais da via endocítica, definidos e distintos dos compartimentos endocíticas início com a presença de vários, Palco, moléculas marcadoras específicas. Por exemplo enzimas hidrolíticas ou componentes de membrana tais como proteínas de membrana Lysosomal associados (lâmpadas), entre outros 11. O terminal endocítico compartimentos-doravante referidos simplesmente como lisossomos-também servir como o principal local para as fases finais da digestão no final do fagocitária / endocítico caminho 12. Deste modo, as sondas não digeríveis podem ser carregados através de endocitose e macropinocitose do meio extracelular e transportado através da via endocítica para os lisossomas, onde se acumula 13,14 depois de seguir um ciclo de absorção definido e perseguição. Sondas fluoróforos para a microscopia de fluorescência, tais como o dextrano não digerível polímero orgânico são geralmente usados ​​como endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Neste método, que descrevem a utilização de micro-esferas revestidas com IgG como carga fagocítica investigar maturação do fagossoma, analisando a entrega do conteúdo luminal lisossomal para fagossomas. Ao usar uma sonda dextrano fluoróforo conjugado como um marcador facilmente detectável dos lisossomos na medula óssea ao vivo macrófagos derivados (BMM) e imagens de vídeo time-lapse com um microscópio de varredura a laser confocal, acompanhamos o processo dinâmico de entrega da carga em phagosomes com alta resolução temporal. Em seguida, descrevem como os dados de imagens de lapso de tempo coletados podem ser avaliados usando o código-fonte aberto e software de análise de imagens disponíveis gratuitamente, Fiji (ou ImageJ), e analisados ​​estatisticamente usando o Microsoft Excel e apresentados utilizando software GraphPad Prism 14,18. Após a descrição do nosso método, experiências análogas podem ser projetados usando as configurações e os fatores modificados para investigar sua influência na maturação phagosome; praticamente qualquer otseu tipo de células fagocíticas primárias ou de linha de células aderentes, perda genética de experimentos de função, incluindo gene knock-out e knock-down, mutantes ou expressão de proteínas de fusão, fagocíticas-alvos, compostos de revestimento microbead, sondas endosomal / lisossomais e fatores de citocinas, inibidores químicos, ou siRNA entre outros, são todos variáveis ​​que podem ser aplicadas à abordagem básica deste método. Definimos o objetivo e os requisitos básicos deste método da seguinte forma: <ul type="disc"><li> Objetivo do método: para permitir a observação directa, quantitativa e qualitativa e análise de maturação do fagossoma com alta resolução temporal em células fagocíticas vivo. </li><li> Carga fagocítica: Uma micropartícula apropriadamente revestidos ou alvo biológico. Aqui usamos IgG-revestido 3 mM micropartículas de poliestireno esféricas que são rapidamente internalizados através do receptor de Fc-γ fagocitose mediada. Alternativamente, qualquer microrganismo ou microfone revestidoroparticle para o qual um receptor de fagocítica está presente nas células pode ser utilizado. </li><li> As células fagocíticas: células fagocíticas aderentes que expressam os receptores apropriados fagocíticas. Aqui usamos primários BMMs rato que abundantemente expressam os receptores Fc-γ. Alternativamente, as células dendríticas (DC), monócitos ou células epiteliais fagocíticas ou seus mutantes ou variantes genéticas knock-out podem ser usados. </li><li> Carga Lysosomal: Uma sonda fluorescente etiquetado lisossômico. Aqui, conjugado com vermelho do Texas 70000 kDa dextrano (Dex70kD) é usado como carga o lúmen dos lisossomos. Alternativamente, qualquer marcador detectável por fluorescência de um compartimento celular ou organelo, ou uma sonda adequada para propriedades phagosomal como acidez ou de degradação da capacidade, pode ser utilizado para estudar a progressão da maturação do fagossoma. </li><li> Fatores que influenciam: Por exemplo, moléculas de sinalização, compostos químicos, gene knock-down, ou expressão transitória de proteínas mutantes poderia. Aqui, nós Forgum uso de tal fator para uma questão de simplicidade, mas para um exemplo recente com a expressão da proteína mutante e knock-down que influenciam fatores por favor ver Kasmapour et al. 18 Qualquer fator que pode afetar a fagocitose ou as circunstâncias e mobilidade dos phagosomes e / ou os compartimentos que interagem com phagosomes maturação poderia potencialmente ser usada. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (D-MEM)</td> <td>PAA, Áustria</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagles Modificado de Dulbecco sem vermelho de fenol (D-MEM)</td> <td>PAA, Áustria</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td> <td>PAA, Áustria</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>PAA, Áustria</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Áustria</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>PAA, Áustria</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Prato de fundo de vidro (35 mm &vazio;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Holanda</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro CELLviewTM, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Alemanha</td><td>627871</td><td>Alternativa: Disponível como</td></tr><tr><td>microesferas de látex carboxilado</td> segmentadas <td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Disponível em diferentes diâmetros, usamos 3 &mu; m</td></tr><tr><td>Micropartículas de poliestireno</td><td>Kisker Biotech, Alemanha</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Alemanha</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>camundongo inteiro IgG Rockland</td><td>, EUA</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador EDAC</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml Omnifix -F</td><td>B.Braun, Alemanha</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; Agulha G (0,45 * 25 mm)</td> <td>B.Baun, Alemanha</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Áustria</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Gibco, EUA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES hidrato</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; Filtro montado em seringa M</td><td>Sartorius, Alemanha</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

estudo da fagolisossomo biogenesis em macrófagos ao vivo

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

As células fagocíticas desempenhar um papel importante no sistema imune inato de remoção e eliminação de microrganismos invasores nas suas phagosomes. Maturação do fagossoma é o processo complexo e bem regulado durante o qual um phagosome nascente passa por uma transformação drástica por meio de interações bem orquestrados com diversas organelas celulares e compartimentos no citoplasma. Este processo, que é essencial para a função fisiológica das células fagocíticas, dotando phagosomes com suas propriedades líticas e bactericidas, culmina na fusão de fagossomos com lisossomos e biogênese de phagolysosomes que é considerada a última e crucial fase de maturação para phagosomes. Neste relatório, nós descrevemos um método baseado imagens de células vivas para a análise qualitativa e quantitativa do processo dinâmico de lisossoma para phagosome entrega de conteúdo, o que é uma característica da fagolisossomo biogênese. Esta abordagem utiliza microesferas IgG revestidas como um modelo para phagocytose e moléculas de dextrano fluoróforos como uma sonda de carga lisossômico luminal, a fim de acompanhar a entrega dinâmica de conteúdo lysosmal aos phagosomes em tempo real em macrófagos ao vivo usando imagens time-lapse e microscopia confocal a laser. Aqui vamos descrever em detalhe o plano de fundo, as etapas de preparação e configuração passo-a-passo experimental para permitir a implantação fácil e preciso desse método em outros laboratórios. Nosso método descrito é simples, robusta, e mais importante, pode ser facilmente adaptado para estudar as interações phagosomal e maturação em diferentes sistemas e em várias configurações experimentais, tais como uso de vários tipos de células fagocíticas, experiências de perda de função, as diferentes sondas e partículas fagocíticas.

A preparação correcta das células e as pérolas de imagiologia é crítica. Figura 1 mostra o contorno da semeadura, a sonda de carregamento e as etapas iniciais de imagem neste método, com base no nosso protocolo optimizado para BMMs. É, portanto, essencial que os parâmetros de protocolo ser testada e optimizada, dependendo do tipo de células e as sondas que são para ser usados. Após a adição dos grânulos revestidos com IgG às células pré-carregadas, é importante que o campo d...

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

O objetivo geral do experimento a seguir é capturar em tempo real o processo dinâmico de maturação do fagossomo e de biogênese do fagolisossomo em fagócitos. Isso é conseguido ao carregar os compartimentos lisossomais das células com dextrana fluorescente conjugada, permitindo a visualização dos compartimentos lisossomais e a transferência de sua carga luminal para os fagossomos. Como segundo passo, são adicionadas micropartículas, que atuam como um modelo fagocítico.Em seguida, analisa-se a entrega de material lisossomal aos fagossomos utilizando imagem viva e processamento digital subsequente de imagens. Para quantificar o processo de maturação fagossomal, os resultados demonstram o efeito de diversos fatores sobre esse processo com base na entrega de conteúdo lisossomal aos fagossomos. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a avaliação da maturação de macrófagos em células fixadas, é a leitura quantitativa com alta resolução temporal. Comece dissolvendo a dextrana marcada com Texas Red de 70 kilodaltons (DExT) ou Dex 70 kD em PBS a 20 miligramas por mililitro e armazene alíquotas a menos 20 graus Celsius.Em seguida, dilua o estoque de Dex 70 KD em meio de cultura celular completo Docos, meio de Eagle modificado ou DMEM até aproximadamente um miligrama por mililitro. Sonique a alíquota da fita DExT em um banho ultrassônico por cinco minutos. Em seguida, centrifugue a solução em uma microcentrífuga na velocidade máxima por cinco minutos para remover quaisquer aglomerados ou contaminantes da solução.Transfira cuidadosamente o SuperAgent para um tubo novo, evitando o pellet no fundo. Em seguida, dilua a solução até uma concentração final de trabalho de 20 microgramas por mililitro em meio completo de cultura celular. DMEM e filtre.Sterilize a solução por meio de um filtro acoplado a seringa de 0,22 micrômetros. Em seguida, semeie dois mililitros de macrófagos derivados de medula óssea de camundongo numa concentração de cinco vezes 10 à quarta células por mililitro. Em DMEM, em uma placa de vidro sem revestimento, incube as células por pelo menos 12 horas a 37 °C em uma atmosfera tamponada com 5% de dióxido de carbono.Para garantir a adesão e aclimatação após a adesão, aspire o meio e adicione dois mililitros de DMEM com DExT pré-aquecido ao recipiente de fundo de vidro e, em seguida, incube as células por duas a oito horas após a incubação. Lave as células três vezes com DMEM completo pré-aquecido. Aspire o meio após a lavagem final e adicione dois mililitros de DMEM completo.Incube as células por quatro a 12 horas. Em seguida, lave as células com DMEM completo sem vermelho de fenol pré-aquecido e adicione dois mililitros de DMEM completo filtrado sem vermelho de fenol pelo menos 30 minutos antes do início da aquisição de imagens. Em seguida, leve uma alíquota da suspensão de beterraba revestida com 1% de IgG, preparada conforme descrito no protocolo textual complementar, à temperatura ambiente.Sonicar a solução em banho ultrassônico por dois a três minutos. Em seguida, sob uma cabine de segurança biológica classe dois, adicione um a seis microlitros da suspensão de microesferas às células. Disperse a nuvem densa de microesferas utilizando uma pipeta para misturar suavemente a suspensão no fundo de vidro do recipiente.Em seguida, leve a amostra ao microscópio e foque na região de interesse. Antes da aquisição de imagens com lapso de tempo, otimize as configurações, incluindo varredura, velocidade, ampliação e resolução, de modo a conseguir capturar um quadro a cada sete a vinte segundos.Ajuste as configurações de excitação e emissão com base no sistema de imagem e nas sondas utilizadas, e otimize-as para evitar o excessivo desbotamento fotográfico. Em seguida, capture o vídeo em lapso de tempo e salve-o no formato de arquivo nativo do seu microscópio. Evite exportar o vídeo em formatos comprimidos, como JPG ou PNG.Em seguida, inicie o Fiji e a distribuição do ImageJ, que contém um pacote de processamento de imagens com menus de ferramentas reorganizados e plugins nativos adicionais disponíveis gratuitamente. Baixe, abra o arquivo no Fiji e selecione o vídeo que será avaliado. Em seguida, defina as opções, filtros e parâmetros de medição conforme detalhado no protocolo textual complementar.Em seguida, percorra as imagens observando o quadro em que um fagossomo inicial completamente formado é criado e a cúpula ácida F está fechada. Utilize a ferramenta de seleção oval para selecionar uma região de interesse ou ROI circular sobre o corpo interno. Certifique-se de que a seleção se ajuste firmemente à borda externa do corpo.Em seguida, vá até analisar e clique em medir para executar a medição. O resultado será exibido em uma janela separada intitulada resultados. No próximo quadro de interesse, ajuste a posição da ROI caso a esfera tenha se movido e repita a medição, que será adicionada à lista na janela de resultados.Cada quadro analisado pode ser identificado com base no valor na coluna de rótulo. Após concluir a medição de todos os quadros relevantes, copie os valores da coluna int den para um aplicativo de planilha eletrônica. A coluna int den representa as intensidades da área selecionada.Utilizando esses métodos, foram obtidas imagens nítidas de macrófagos derivados da medula óssea que tinham sido carregados com as sondas de fita DExT. Esta imagem é do tempo zero, ou seja, exatamente quando a célula concluiu a captação da microesfera codificada com IgG indicada aqui. As imagens mostradas aqui foram pseudocoloreadas para melhor visibilidade e representam o fagossomo de zero a 85 minutos após a captação.O fagossomo medido, ROI, é delimitado pela linha tracejada e as ocorrências de entrega e acúmulo de dextrano no fagossomo são indicadas pelas setas. Em seguida, gráficos foram gerados a partir dessas imagens e mostram uma tendência temporal clara da associação do sinal com o fagossomo ao longo do tempo. Este gráfico representa uma média de 10 fagossomos provenientes das duas células mostradas aqui.Embora a intensidade absoluta do sinal varie frequentemente entre cada fagossomo analisado, a tendência temporal é normalmente muito semelhante. A entrega de Dex 70 kD aos fagossomos atingiu um platô entre 35 e 40 minutos após a fagocitose. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a maturação de fagossomos utilizando microscopia confocal com registro temporal.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de alta resolução para visualização em tempo real da formação e fechamento de fagossomos durante a fagocitose mediada por macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados (RBCs) opsonizados por IgG presos à superfície de um prato de fundo de vidro. Os macrófagos estendem os pseudópodes ao redor das hemácias e os engolfam dentro dos fagossomos, destacando-os da superfície do vidro.

Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de...

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Descrevemos um método para medir a velocidade dos fagossomos que se movem em direção ao centro celular em células vivas infectadas com ou sem o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tipo 1, usando microscopia de fluorescência confocal de disco giratório para identificar células infectadas fluorescentes e microscopia de campo claro para detectar fagossomos.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Aqui descrevemos uma técnica baseada em microscópio para visualizar e quantificar as primeiras cascatas de eventos durante a fagocitose de patógenos como os fungos Candida albicans e partículas maiores que 0,5 μm, incluindo zimosana e grânulos revestidos de IgG.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.

Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal

Este estudo elucida o processamento fagocítico de partículas de Godanti Bhasma (GB) em células de mamíferos, caracterizando sua captação celular, dinâmica de vacúolos, acidificação e degradação. Essas descobertas não apenas avançam nossa compreensão dos mecanismos fundamentais de fagocitose, mas também estabelecem o GB como um sistema modelo promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Explorando os eventos celulares sequenciais de fagocitose desencadeados por Godanti Bhasma em células de mamíferos

Aprenda a visualizar a maturação de fagossomos em macrófagos de medula óssea de camundongo usando microscopia confocal de lapso de tempo. Este método permite quantificar a entrega de conteúdo lisossômico com alta resolução temporal em tempo real.

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Explorar mais vídeos