Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é capturar o processo dinâmico em tempo real de maturação do fagossomo e biogênese do fagolisossomo em fagócitos. Isso é conseguido carregando os compartimentos lisossômicos das células com fita dex conjugada fluorescente para permitir a visualização dos compartimentos lisossômicos e a transferência de sua carga luminal para os fagossomos. Como segunda etapa, são adicionadas micropartículas, que atuam como um modelo fagocítico.

Em seguida, a entrega de material lisossômico aos fagossomos é analisada usando imagens de venda ao vivo e subsequente processamento de imagem digital. A fim de quantificar o processo de maturação do fagossomo, os resultados mostram o efeito de vários fatores no processo de maturação do fagossomo com base na entrega do conteúdo lisossômico aos fagossomos. A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes, como a avaliação da maturação de macrófagos em células fixas, é a leitura quantitativa com alta resolução temporal: Comece dissolvendo a fita Texas Red Labeled 70 kilodalton DExT ou Dex 70 KD em PBS a 20 miligramas por mililitro e armazene alíquotas a menos 20 graus Celsius.

Em seguida, dilua o estoque de Dex 70 KD em Docos de cultura de células completas, meio de águia modificado ou DMEM para aproximadamente um miligrama por mililitro. Sonicar a alíquota da fita DExT em banho-maria ultrassônico por cinco minutos. Em seguida, centrifugue a solução em uma microcentrífuga na velocidade máxima por cinco minutos para remover quaisquer aglomerados ou contaminantes da solução.

Mova cuidadosamente o SuperAgent para um tubo novo, evitando o pellet na parte inferior. Em seguida, diluir a solução até uma concentração final de trabalho de 20 microgramas por mililitro em cultura celular completa. DMEM e filtro.

Esterilize a solução através de um filtro montado em seringa de 0,22 micrômetro. Em seguida, veja dois mililitros de macrófagos de camundongos derivados da medula óssea a uma concentração de cinco vezes 10 elevado à quarta célula por mililitro. Em DMEM em um prato de fundo de vidro não revestido, incube as células por pelo menos 12 horas a 37 graus Celsius em uma atmosfera tamponada com 5% de dióxido de carbono.

Para garantir a fixação e aclimatação após a fixação, aspire o meio e adicione dois mililitros de fio DExT DMEM pré-guerra ao prato de fundo de vidro e, em seguida, incube as células por duas a oito horas após a incubação. Lave as células três vezes com DMEM completo pré-aquecido. Aspire o meio após o enxágue final e adicione dois mililitros de DMEM completo.

Incube as células por quatro a 12 horas. Em seguida, enxágue as células com DMEM completo sem vermelho de fenol pré-aquecido e adicione dois mililitros de DMEM completo filtrado sem vermelho de fenol pelo menos 30 minutos antes do início da imagem. Em seguida, leve à temperatura ambiente uma alíquota de suspensão de beterraba revestida com 1% de IgG preparada conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Sonicar a solução em banho-maria ultrassônico por dois a três minutos. Em seguida, sob um gabinete de biossegurança de classe dois, adicione de um a seis microlitros da suspensão do grânulo às células. Difundir a densa nuvem de contas usando uma pipeta para misturar suavemente a suspensão no prato de fundo de vidro.

Em seguida, leve a amostra ao microscópio e concentre-se na região de interesse. Antes da aquisição de imagens com lapso de tempo. Otimize as configurações, incluindo digitalização, ampliação de velocidade e resolução, para poder capturar um quadro a cada sete a 20 segundos.

Ajuste as configurações de emissão de excitação com base no sistema de imagem e nas sondas usadas e otimize as configurações para evitar o branqueamento excessivo da foto. Em seguida, capture o vídeo de lapso de tempo e salve-o no formato de arquivo nativo do seu microscópio. Evite exportar o vídeo em formatos compactados, como JPG ou PNG.

Em seguida, inicie a distribuição Fiji e Image J contendo um pacote de processamento de imagem com menus de ferramentas reorganizados e plug-ins nativos adicionais disponíveis gratuitamente. Baixar. Abra o arquivo em Fiji e selecione o vídeo que deve ser avaliado. Em seguida, defina as opções, filtros e parâmetros de medição conforme detalhado no protocolo de texto que acompanha.

Em seguida, examine as imagens observando o quadro no qual um fagossomo de grânulo nascente totalmente formado é formado e o copo ácido F é fechado. Use a ferramenta Seleção oval para selecionar uma região circular de interesse ou ROI no cordão internalizado. Certifique-se de que a seleção se encaixe bem na borda externa do cordão.

Em seguida, vá para analisar e clique em medir para executar a medição. O resultado será exibido em uma janela separada intitulada resultados. No próximo quadro de interesse, ajuste a posição do ROI caso o cordão tenha se movido e repita a medição, que será adicionada à lista na janela de resultados.

Cada quadro analisado pode ser identificado com base no valor na coluna de rótulo. Depois de concluir a medição de todos os quadros relevantes, copie os valores da coluna int den para um aplicativo de planilha. A coluna int den descreve as intensidades da área selecionada.

Usando esses métodos, imagens claras foram capturadas de macrófagos derivados da medula óssea que foram carregados com as sondas de fita DExT. Esta imagem é do tempo zero, que é exatamente quando a célula completou a captação do grânulo codificado de IgG apontado aqui. As imagens mostradas aqui foram pseudocoloridas para melhor visibilidade e retratam o fagossomo de zero a 85 minutos após a absorção.

O fagossomo medido, ROI é delineado com a linha tracejada e as instâncias de entrega e acúmulo de dextrana no fagossomo são apontadas pelas setas. Gráficos foram então gerados a partir dessas imagens e mostram uma clara tendência temporal de associação de sinal com o fagossomo ao longo do tempo. Este gráfico representa uma média de 10 fagossomos das duas células mostradas aqui.

Embora a intensidade absoluta do sinal varie frequentemente entre cada fagossomo analisado, a tendência temporal é normalmente muito semelhante. Entrega de Dex 70 KD aos fagossomos, um platô foi alcançado dentro de 35 a 40 minutos após a fagocitose. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a maturação do fagossomo usando microscopia confocal de lapso de tempo.