Name: Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Aprenda a sintetizar um hidrogel proteico altamente estável mediado por intein dividido para imobilização de proteínas. Este método utiliza reações de trans-splicing para formar um polipeptídeo auto-organizável com elevada estabilidade.

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Os autores gostariam de agradecer o Dr. David Tirrell (Caltech), pelo seu dom tipo de plasmídeo pQE9 AC 10 ATRP 12, o Dr. Tom Muir (Universidade de Princeton), pelo seu dom tipo de plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japão), pelo seu dom tipo de plasmídeo pET30-cuta-Tip1 10, e Dr. Jay Keasling D. (UC Berkley) pelo seu dom tipo de plasmídeo pJD757 13 . Este trabalho foi apoiado em parte pela National Science Foundation CARREIRA, EUA Força Aérea YIP e Norman Hackman Programa Advanced Research.

1. Plasmídeo Construção NOTA: Todos os genes foram amplificados em reações de PCR padrão usando Phusion High-Fidelity DNA polimerase por especificações do fabricante. Os iniciadores utilizados para a clonagem foram descritas anteriormente 9. Todas as construções estão listadas na Tabela 1. <ol><li> Para gerar cuta-NpuN (N, Tabela 1): <ol><li> PCR amplificar genes CUTA e NpuN de plasmídeos pET30-cuta-Tip1 10 e KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados. </li><li> Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma marca de 6xHistidine C-terminal para gerar N (Figura 2A). </li></ol></li><li> Para gerar NpuC-S-cuta (C, Tabela 1): <ol><li> PCR amplificar NpuC, Cuta e S fragmentaçãoT [AG 3 (PEG)] 10 a partir do plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, pET30-cuta-Tip1 10 e pQE9 AC 10 PRTA 12, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados. </li><li> Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri sequencialmente estes fragmentos no vector pET26b entre o promotor T7 e uma 6xHistidine C-terminal para gerar C (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para gerar NpuC-S-SH3 lig-Cuta (C-SH3 lig, Tabela 1): <ol><li> PCR amplificar Cuta usando primers contendo um lig SH3 (PPPALPPKRRR) e um ligante flexível (GGGGS) 2 para gerar fragmento SH3 lig-cuta. </li><li> Substitua o gene Cuta de C com fragmento SH3 lig-cuta. </li></ol></li><li> Para gerar SH3-GFP (Tabela 1): <ol><li> Amplificar o gene a partir do plasmídeo SH3 pJD757 13 usando oiniciadores apropriados. </li><li> Fundir este fragmento com o gene GFP e inseri-la no vector pET26b entre o promotor T7 (Figura 2C) e uma etiqueta de 6xHistidine C-terminal. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression <ol><li> Transformar 50 ul de quimicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) com o plasmídeo de expressão apropriado. </li><li> Após a transformação, serialmente diluídas estas células, e placa-los em meio Luria-Bertani (LB) / placas de agar contendo 50 ug / ml de canamicina. </li><li> Incubar as placas que contêm células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas. </li><li> Após a incubação, pegar uma placa que contém 50-100 colônias e ressuspender todas as colônias em 5 ml de caldo LB. </li><li> Transferência de suspensão de 1 L de caldo LB contendo canamicina (50 ug / ml) e as células crescer a 37 ° C com agitação a 250 rpm. Monitorar a absorvância a 600 nm (OD 600). Crescer cultura até OD 600 ~ 0,8. <ol><li> Para C e C-SH3 lig, induzir a expressão da proteína por adição de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura (1 mM concentração final) e incubar a cultura a 37 ° C durante 4 horas, agitando a 250 rpm. </li><li> Para N e SH3-GFP, arrefecer a cultura a ~ 18 ° C por imersão do frasco de cultura em um banho de água gelada durante ~ 5 min. Induzir a expressão da proteína por adição de IPTG à cultura (concentração final 1 mM) e incuba-se a cultura a 18 ° C durante 14-18 h, agitando a 250 rpm. </li></ol></li><li> Após expressão de proteína, centrifugar a cultura a 6.000 x g durante 20 min a 4 ° C para recolher o sedimento. Pellet celular armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Purificação de Proteínas <ol><li> Purificação de N (condições de desnaturação) <ol><li> Os sedimentos de células ressuspender em tampão A (Tabela 2) em 10 ml / g de sedimento húmido. </li><li> Immerso e a suspensão da pelota em um banho de gelo-água e romper as células por ultra-sons (10 Amp, com um segundo pulso e 6 seg pausa durante 1 min). </li><li> Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em tampão de DA (contendo 8 M de ureia) e centrifugar a suspensão a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Passe o sobrenadante através de uma coluna de 5 ml de ácido Ni-nitrilotriacético (NTA) previamente equilibrada com DA buffer. </li><li> Lavar coluna com 30 ml de tampão DA suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão DA suplementado com 150 mM de imidazole. </li><li> Reduzir a concentração de ureia na amostra de proteína para &lt;1 mM, por qualquer um dos métodos a seguir indicados no 3.1.7.1 ou 3.1.7.2: <ol><li> Dializar proteína em tampão de DPBS (Tabela 2), a 4 ° C durante a noite utilizando tubos com &lt;20 kDa de corte. </li><li> Centrífuga proteína purificada em um 30 &amp; #160; kDa ultra-filtração coluna de centrifugação a 2,800 xg, 4 ° C até que o volume é inferior a 1 ml. Adicionar 14 ml de tampão de DPBS à coluna para diluir a amostra de proteína. Repita a centrifugação / diluição passos mais três vezes. </li></ol></li><li> Após troca de tampão, adicionar o ditiotreitol (DTT) para a proteína purificada (final 2 mM) e concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml por centrifugação através de uma ultra-filtração coluna de centrifugação de 30 kDa a 2800 xg, a 4 ° C. </li><li> Alíquota da proteína concentrada e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Purificação de C e C-SH3 lig (condição nativa) <ol><li> Os sedimentos de células ressuspender em tampão B (pH 6,0) (Tabela 2) suplementado com 1x cocktail inibidor de protease a 10 ml / g de sedimento húmido. Utilize tampão acidico para minimizar a degradação proteolítica da proteína alvo. </li><li> Interromper a suspensão de células por ultra-sons como descrito em 3.1.2. Centrifugar as lisComeram a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter-se o sobrenadante. </li><li> Passar o lisado solúvel por meio de uma de 5 ml de coluna de Ni-NTA, previamente equilibrada com tampão B. </li><li> Lavar a coluna com tampão B complementado com imidazole 45 mM, e elui-se a proteína alvo em 20 ml de tampão B complementado com imidazole 150 mM. </li><li> Para C, pule para o passo 3.2.6. Para C-SH3 lig, realizar uma etapa de purificação de troca iônica adicional para remover proteína parcialmente degradada como dado em passos 3.2.5.1 para 3.2.5.3 <ol><li> Reduzir a concentração de NaCl no C-SH3 lig a &lt;1 mM, seguindo o procedimento descrito em 3.1.7. </li><li> Carregar a proteína alvo em um permutador de aniões 5 ml de contas de agarose a coluna de matriz, previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,0). </li><li> Proteína alvo eluem a partir da coluna, executando um gradiente a partir de uma solução contendo 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer a uma solução contendo o mesmo tampão suplementado com 1 M de NaCl. Retirar amostras durante a eluição da proteína e amostras de piscina com a pureza mais elevada com base em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS, como descrito em 3.1.7. </li><li> Adicionar DTT para a proteína purificada (concentração final 2 mM) e concentra-se a proteína a ~ 100 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8. Alíquotas e armazenamento de concentrado de proteína de -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Purificação de SH3-GFP <ol><li> Os sedimentos de células Ressuspender utilizando tampão A, a 10 ml / g de sedimento húmido. </li><li> Disrupt suspensão pellet por sonicação como descrito no ponto 3.1.2. </li><li> Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante. </li><li> Passa-se o sobrenadante (lisado solúvel) por meio de um 5 ml de coluna de Ni-NTA equilibrada previamente comTampão A. </li><li> Lavar coluna com 30 ml de tampão A suplementado com 45 mM de imidazole. Eluir a proteína purificada, utilizando 20 ml de tampão A suplementado com 150 mM de imidazole. </li><li> Troca de tampão a proteína purificada em tampão de DPBS utilizando uma metodologia semelhante ao descrito no 3.1.7 e concentrar a proteína de ~ 150 mg / ml, utilizando uma coluna de spin de ultra-filtração de 30 kDa, tal como descrito em 3.1.8. </li><li> Alíquotas e armazenamento de proteína purificada a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> A análise de SDS-PAGE de amostras purificadas contendo CUTA <ol><li> Dilui-se cada proteína purificada em água duplamente destilada para reduzir a concentração de NaCl para ~ 1 mM. A esta concentração de NaCl, a maioria das proteínas CUTA trímeros executado como monómeros sobre os géis de SDS-PAGE. </li><li> Misturar as amostras com tampão de amostra 2x SDS (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v de bromo-fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), incubados a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Carregue o sampios num gel de SDS-PAGE a 12%. Realizar eletroforese a uma tensão constante de 200 V para ~ 50 min. </li><li> Observar proteína nos géis por coloração com azul brilhante de Coomassie R250 a seguir os protocolos padrão (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 4. Formação Hidrogel NOTA: os hidrogéis de amostras efectuadas neste estudo contêm 1,6 mM de cada bloco de construção hidrogel salvo indicação em contrário. Esta concentração de proteína produz um hidrogel macia e estável. ATENÇÃO: A azida de sódio (NaN 3) é adicionado ao hidrogel para uma concentração final de 0,5% w / v para evitar a contaminação bacteriana. NaN 3 é altamente tóxico e deve ser manuseado com muito cuidado, como indicado na Ficha de Segurança. <ol><li> Calcular o volume de cada uma das proteínas concentradas necessários para alcançar uma concentração final de 1,6 mM em um hidrogel 100 ul de amostra. Por exemplo: A concentração de N:100 mg / mL Peso molecular de N: 26,3 kDa (ver Tabela 1) Concentração 100 l desejado:: volume desejado de 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Para tornar um hidrogel 100 ul (1,6 mM), mistura C (x ul, o volume calculado de acordo com 4.1) com 5% de NaN 3 (10 mL), DTT 100 mM (5 mL) e N (y ul, o volume calculado de acordo com a 4,1) dentro de um frasco de vidro de 2 ml. </li><li> Adicionar tampão de DPBS ((85 - x - y) ul) para o frasco de forma a alcançar um volume final de 100 ul, e misturar todos os componentes manualmente através de um movimento rotativo utilizando uma ponta de pipeta. Nota: A solução torna-se muito viscosa ao ser misturado. </li><li> Centrifugar a mistura durante 2 min a 8000 xg para remover as bolhas de ar. </li><li> Incubar a mistura de quartotemperatura durante a noite para permitir que a reacção de splicing trans intein para atingir a conclusão. Confirme formação hidrogel girando tubo de cabeça para baixo. As proteínas não fluirá se um hidrogel é formado. </li><li> Estimar o rendimento intein trans-splicing, verificando amostras (0,5 ul cada) recolhidos antes do passo 4.2 e após a etapa 4.5 em um gel de SDS-PAGE, como descrito no ponto 3.4 (Figura 1C). </li></ol> 5. Imobilização de GFP via proteína de ancoragem (DP) e Docking Station Peptide (DSP) Interação <ol><li> Para fazer com que um 50 ul funcionalizada-GFP hidrogel (1,2 mM), combinar C-SH3 de Nata (x ul, calculado de acordo com 4.1) e SH3-GFP (y ul, calculado de acordo com 4.1) em razão molar de 1:1 em um 1,7 ml tubo de microcentrífuga e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionam-se 5% de NaN3 (5 mL), DTT 100 mM (2,5 mL), (42,5 - x - &lt;em&gt; y) DPBS ul para o mesmo tubo. Adiciona-se N (y ul, calculado de acordo com a 4.1) para se atingir uma proporção de 1:1 molar de N e C-SH3 lig. Misturar a amostra usando uma ponteira por um movimento giratório. </li><li> Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante a noite no escuro. Um hidrogel encapsulando formas SH3-GFP durante a incubação. </li></ol> 6. Uso de Hidrogel 1,6 mM como um andaime para Imobilização Reação enzimática em solvente orgânico <ol><li> Use o HRP como uma enzima modelo. Prepara-se uma solução estoque de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) em DPBS. </li><li> Para tornar um hidrogel 30 ul (1,6 mM) aprisionamento HRP, combinam C (x ul, calculado de acordo com 4.1) com HRP (2 mL), 5% de NaN 3 (3 mL) e DTT (1,5 mL de 100 mM) no interior de um 1,7 ml tubo de centrifugação. </li><li> Adiciona-se N (y &lt;/ Em&gt; il, calculados de acordo com 4.1) e DPBS (23,5 - x - y) mL. Misture com a ponta da pipeta com um movimento giratório. </li><li> Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 2 min e incubar à temperatura ambiente durante a noite. ATENÇÃO: os regentes utilizados para o ensaio seguinte atividade são altamente tóxicos. Use as recomendações de segurança específicas das respectivas fichas de segurança. </li><li> Por reacção enzimática, submergir o hidrogel em 1 ml de cocktail de reacção contendo N, diamina de N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) em n-heptano 14. Interromper manualmente o gel utilizando uma ponteira para aumentar a área da superfície de contato do hidrogel e do solvente. </li><li> Detectar produto HRP, um corante do tipo indofenol, por medição da absorvância óptica de amostras tomadas a diferentes tempos a 546 nm num leitor de placas (Figura 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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</ol>

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Neste trabalho, nós demonstramos a síntese de uma proteína de hidrogel intein mediada altamente estável. O uso de uma divisão permite intein o hidrogel ser condicionalmente formada em resposta à mistura de dois componentes em fase líquida. Especificamente, a divisão intein covalentemente liga dois blocos em fase líquida através de uma reação de trans-splicing, produzindo uma unidade polipeptídeo ladeado por reticulação unidades que, por sua vez auto monta em um hidrogel. A formação induzida por mistura do hidro...

Os hidrogéis feitos inteiramente de proteínas carregam o potencial para avançar significativamente campos tão diversos como a engenharia de tecidos, distribuição de medicamentos e biofabrication 1. Eles oferecem vantagens sobre os hidrogéis de polímero sintético tradicionais, incluindo biocompatibilidade e o potencial para apoiar de forma não invasiva a incorporação de proteínas globulares bioactivos. Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um novo hidrogel de proteína formada por meio de uma resposta mediada intein dividida proteína reacção de splicing trans e sua aplicação como suporte de imobilização de proteína (Figura 1). Os blocos de construção para esta hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteína, compreendendo cada fragmento o N-ou C-terminal de uma divisão intein (IN e IC) e uma subunidade de uma proteína multimérica reticulador. O DNAE intein de Nostoc punctiforme (NPU) foi usada como o grupo intein 2,3 e uma pequena proteína trimérica (12 kDa) a partir de CUTA Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; foi usado como o agente de ligação cruzada de proteínas a 4,5. Diferentes agentes de reticulação são unidas por meio de reacção de splicing trans intein catalisada, levando à formação de uma rede de proteínas altamente reticulado (hidrogel). NPU intein foi escolhido por causa de sua cinética de reação rápida (t 1/2 = 63 seg) e alto rendimento trans-splicing (perto de 80%) 2,3. A proteína CUTA foi escolhido como o agente de ligação cruzada, devido à sua elevada estabilidade. Trímeros CUTA têm uma temperatura de desnaturação de perto de 150 ° C e manter a estrutura quaternária trimérico em soluções contendo tanto como 5 M de cloridrato de guanidina 4,6. Desde subunidade troca entre os diferentes agentes de reticulação é um dos principais contribuintes da superfície hidrogel físico erosão 7, a interação entre subunidade muito forte em Cuta deve desencorajar tais trocas de subunidades, levando a um hidrogel mais estável. Um desses blocos de construção também contém um peptídeo S-fragmento altamente hidrofílico como o meio-bloco para facilitar a águaretenção 8. A mistura dos dois blocos de construção de hidrogel inicia uma reacção de splicing trans entre a IN e IC intein fragmentos, gerando uma corrente mais polipeptídeo com agentes de ligação cruzada em ambos os terminais. Reticuladores de várias de tais unidades moleculares interagir uns com os outros, formando uma rede de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Um específico &quot;encaixe estação péptido&quot; (DSP) é incorporado um dos blocos de construção de hidrogel a fim de facilitar a imobilização estável de uma &quot;proteína de ancoragem&quot; (DP) marcado com proteína alvo no hidrogel. O uso de uma divisão intein para mediar a montagem de hidrogel não só fornece flexibilidade adicional para a síntese de proteína de hidrogel, mas também permite alta densidade, carga uniforme da proteína alvo ao longo de todo o hidrogel, tal como as proteínas alvo são carregados antes da formação do hidrogel. O hidrogel de proteínas mediada por intein é altamente stable em solução aquosa, com pouco ou nenhuma erosão detectável após 3 meses à temperatura ambiente. A estabilidade é mantida numa vasta gama de valores de pH (6-10) e de temperaturas (4-50 ° C), e o hidrogel é também compatível com solventes orgânicos. Este hidrogel é utilizado para a imobilização das duas proteínas globulares: a proteína fluorescente verde (GFP) e a peroxidase de rábano (HRP). Hidrogel aprisionando a última proteína é usada para executar biocatálise em um solvente orgânico.

<table><tbody><tr><td> Phusion High Fidelity DNA polimerase </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Competente Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </td></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td>VWR</td><<td>p>90003-350</td><td> </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>sulfato de canamicina</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><<td>p>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> Imidazol </td><td>VWR</td><<td>p>EM-5720</td><td> </td></tr><tr><td> Ureia </td><td>VWR</td><<td>p>EM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td> </td></tr><tr><td> Coquetel de inibidores de protease </td><td>Roche Applied Science</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><<td>p>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td>Acros Organics</td><td>A0297990</td><td> </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td>Fisher</td><td>AC190380050</td><td> Cuidado, altamente tóxico </td></tr><tr><td> Peroxidase de rábano </td><td>Sigma</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-dimetil-p-fenilenodiamina</td><td>Fisher</td><td>AC408460250</td><td> Cuidado, altamente tóxico </td></tr><tr><td> fenol </td><td>Fisher</td><td>AC149340500</td><td> Cuidado, altamente tóxico </td></tr><tr><td>terc-butil hidroperóxido</td><td>Fisher</td><td>AC180340050</td><td> Cuidado, altamente tóxico </td></tr><tr><td> n-heptano </td><td>Acros Organics</td><td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td> Shaker/Incubator </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> Tubos de Ultrafiltração </td><td>Amicon Ultra</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td> &nbsp; Coluna Ni Sepharose High Performance HisTrap </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP Sepharose FF coluna de troca iônica </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Leitor de placas </td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

síntese de uma proteína artificial intein mediada hidrogel

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Apresentamos a síntese de uma proteína de hidrogel altamente estável mediada por um catalisado-intein dividida proteína reacção de splicing trans. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. Uma bobina aleatório altamente hidrofílico é inserida em um dos copolímeros em bloco de retenção de água. A mistura dos dois copolímeros em bloco a proteína desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de polipeptídeo com agentes de reticulação em ambas as extremidades que rapidamente auto-monta em um hidrogel. Este hidrogel é muito estável tanto em condições ácidas e básicas, a temperaturas até 50 ° C, e em solventes orgânicos. O hidrogel rapidamente reformas após ruptura induzida por cisalhamento. Incorporação de um &quot;encaixe estação peptídeo&quot; para o bloco de construção de hidrogel permite incorporação conveniente de &quot;proteína de ancoragem&quot;, marcado proteínas-alvo.O hidrogel é compatível com o meio de crescimento de cultura de tecidos, suporta a difusão de moléculas de 20 kDa, e permite a imobilização de proteínas globulares bioactivos. A aplicação do hidrogel proteína intein-mediada como um biocatalisador compatível com solvente orgânico foi demonstrada por encapsular a enzima peroxidase de rábano silvestre e corroborar a sua actividade.

Um esquema para a formação do hidrogel de proteína intein mediada é apresentado na Figura 1A. Os blocos de construção de hidrogel são os copolímeros de proteína cuta-NpuN (N) e NpuC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabela 1). NpuN / C são os N-/C-fragments do DNAE dividir naturalmente intein de Nostoc punctiforme (NPU). Cuta é uma proteína trimérica estável de Pyrococcus horikoshii 4,5. Mistura de purificada N e C, na presença do agente redutor DTT induz a formação de uma terc...

Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e temperatura estáveis, compatíveis com solventes orgânicos, e facilmente incorpora proteínas globulares funcionais.

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

O objetivo geral deste procedimento é sintetizar um hidrogel proteico altamente estável que possa ser usado como um esqueleto geral para imobilização de proteínas. Isso é realizado primeiramente sintetizando dois blocos estruturais de hidrogel proteico em um hospedeiro bacteriano. Cada bloco estrutural contém uma subunidade de uma proteína quimérica que atua como um reticulador e uma metade do sistema NPU dividido por reação ene.Essas proteínas são então purificadas por cromatografia de afinidade na segunda etapa. Os blocos de construção proteicos purificados são misturados, iniciando reações de splicing trans em dezesseis, que reconstituem um polipeptídeo autoagregável flanqueado por ligantes cruzados, desencadeando a formação de hidrogel. Esse hidrogel é altamente estável em solução pela incorporação de um motivo de ligação apropriado no bloco proteico.Copolímeros permitem a incorporação conveniente e específica no local de proteínas funcionais modulares nos blocos constituintes do hidrogel, resultando na formação de um hidrogel, no qual as proteínas imobilizadas exibem baixa taxa de lixiviação ao longo de três semanas em temperatura ambiente. Por fim, enzimas imobilizadas neste hidrogel proteico são protegidas contra desnaturação por solventes orgânicos. Assim, este hidrogel também pode atuar como um biorreator para síntese orgânica.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de imobilização estável de proteínas, incluindo aqueles que envolvem a ligação cruzada da superfície LI ou a encapsulação de enzimas em suportes sólidos porosos ou ligação cruzada interenzimática, é a capacidade de imobilizar estavelmente proteínas-alvo em um ambiente poroso e altamente hidratado, sem qualquer modificação química da cadeia lateral da proteína. Esta tecnologia também permite a montagem de múltiplas enzimas dentro de uma via metabólica em uma disposição tridimensional predeterminada, o que pode facilitar o canalização de substratos entre as enzimas. Antes de iniciar este procedimento, gere os dois copolímeros proteicos N e C por meio de construção de plasmídeo utilizando tecnologias de DNA recombinante, seguida de expressão proteica e purificação em *E. coli* B 21 de três para ressuspender os pellets celulares em tampão A na proporção de 10 mililitros por grama de pellet úmido.Em seguida, mergulhe a suspensão do pellet em um banho de gelo e água e rompa as células por sonicação a 10 A com um pulso de um segundo e uma pausa de seis segundos, durante um minuto. Centrifugue o lisado a 6.000 × g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Após remover o tubo da centrífuga, descarte o sobrenadante S e ressuspenda o pellet em tampão DA, seguindo a centrifugação nas mesmas condições anteriores, passando o sobrenadante por uma coluna de NTA de cinco mililitros previamente equilibrada com tampão DA, utilizando um sistema de cromatografia de baixa pressão.Em seguida, lave a coluna com 30 mililitros de tampão DA suplementado com 45 milimolares de ole, elua a proteína purificada usando 20 mililitros de tampão DA suplementado com 150 milimolares de ole. Transfira a proteína purificada para um tubo de centrífuga contendo uma coluna de filtração ultra-rápida de 30 kilodaltons. Centrifugue a amostra a 2.800 × g e 4 °C até que o volume seja inferior a um mililitro.Quando terminar, adicione 14 mililitros de tampão DPBS à coluna para diluir a amostra proteica. Repita as etapas de centrifugação e diluição mais três vezes após a troca de tampão, e adicione DTT à proteína purificada para obter uma concentração final de dois milimolares. Em seguida, concentre a proteína até cerca de 100 miligramas por mililitro por meio de centrifugação através de uma coluna de ultrafiltração de 30 kilodaltons a 2.800 × g a quatro graus Celsius por aproximadamente 45 minutos a uma hora.Para preparar uma mistura de hidrogel de 100 microlitros, adicione 42 microlitros de uma solução estoque de C a 100 miligramas por mililitro, 10 microlitros de azida de sódio a 5%, cinco microlitros de DTT a 100 milimolar e 42 microlitros de uma solução estoque de N a 100 miligramas por mililitro. Em um vial de vidro de dois mililitros, adicione um microlitro de tampão DPBS ao vial para atingir um volume final de 100 microlitros e misture manualmente todos os componentes por meio de um movimento circular utilizando uma ponteira de pipeta. Após centrifugar a mistura por dois minutos a 8.000 vezes G, incube-a durante a noite à temperatura ambiente para permitir que a reação de trans-splicing ENE atinja a conclusão. Após isso, confirme a formação do hidrogel virando o tubo de cabeça para baixo para obter 50 microlitros de um hidrogel funcionalizado com GFP a 1,2 milimolar.Combine 17 microlitros de uma solução estoque contendo 100 miligramas por mililitro do ligante CSH três e nove microlitros de uma solução de SH 3G FP a 230 miligramas por mililitro em uma proporção molar um para um em um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro e incube a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, adicione cinco microlitros de azida de sódio a 5%, 2,5 microlitros de DTT a 100 milimolar e 0,5 microlitros de DPBS ao mesmo tubo. Então, adicione 16 microlitros de N para obter uma proporção molar um para um de N e ligante CSH três e misture a amostra por meio de um movimento de vórtice usando a ponteira de uma pipeta; centrifugue a mistura a 8.000 ×g por dois minutos.Após finalizar, incubar a mistura à temperatura ambiente durante a noite, no escuro, para formar um hidrogel e encapsular a SH 3G FP. Para uma aplicação adicional, preparar uma solução estoque de 0,63 milimolar de peroxidase de rábano (HRP) em DPBS para obter 30 microlitros de um hidrogel de 1,6 milimolar e aprisionar a HRP combinando 12 microlitros de uma solução estoque de 100 miligramas por mililitro de C com dois microlitros de HRP, três microlitros de azida de sódio a 5% e 0,5 microlitros de DTT 300 milimolar em um tubo de centrifugação de 1,7 mililitro. Adicionar 12 microlitros de uma solução de 100 miligramas por mililitro de N e 0,5 microlitros de DPBS e misturar a solução por meio de movimento circular utilizando uma ponteira IPE. Após centrifugar a mistura a 8.000 × g durante dois minutos, incubar à temperatura ambiente durante a noite.Para a reação enzimática, submergir o hidrogel em um mililitro de uma mistura reacional contendo 5,8 milimolar de NN dimetil PPH fenol diamina, 5,8 milimolar de fenol e 2,9 milimolar de t-butil hidroperóxido em n-heptano; interromper manualmente o gel usando a ponta de uma pipeta para aumentar a área de superfície de contato entre o hidrogel e o solvente. Detectar o produto da HRP e o corante do tipo indol fenólico coletando amostras do solvente em diferentes momentos e medindo a absorbância óptica em 546 nanômetros em um leitor de placas. A mistura de N e C purificados na presença do agente redutor DTT induz a formação de uma terceira proteína, o produto ligado J individualmente. Os blocos constituintes do hidrogel, n NC, existem como fluidos viscosos; a mistura de n NC produz um material semissólido transparente que permanece no fundo de um frasco de vidro após inversão, indicando a formação de um hidrogel.Este hidrogel proteico mediado por ene exibe alta estabilidade em solução. Há pouca ou nenhuma perda do esqueleto do hidrogel reticulado após 21 dias a 22 graus Celsius em tampão DPBS. Como a quantidade total de proteína liberada no tampão DPBS excede apenas ligeiramente a quantidade teórica da ene clivada do hidrogel, a citometria densa revelou que, durante a formação do hidrogel, as reações de transclivagem foram cerca de 80% eficientes.A análise por gel de SDS-PAGE mostrou que apenas traços do produto trans-splicing estavam presentes no tampão ao redor do hidrogel, confirmando que a perda da estrutura reticulada do hidrogel por erosão é mínima. A principal proteína presente no tampão ao redor do hidrogel é a intérna removida por splicing.Nenhum sinal visível de erosão foi observado em um hidrogel não perturbado, submerso em solução aquosa à temperatura ambiente por mais de três meses. O hidrogel também é altamente estável a 37 graus Celsius e em tampões ácidos e básicos. Para facilitar a imobilização de proteínas, uma proteína e seu ligante peptídico foram utilizados para ancorar proteínas de interesse na estrutura do hidrogel.Escolhemos a proteína SH3, um domínio de homologia de SAR três proveniente da proteína adaptadora CRK, como proteína de ancoragem para fusão a uma proteína de interesse, e seu ligante como o peptídeo da estação de ancoragem para incorporação na matriz do hidrogel. Esse par de interação foi escolhido devido ao tamanho molecular relativamente pequeno e à alta afinidade. O ligante SH3 foi inserido entre NPUC e cut A para formar o CSH3 ligante.A proteína S SH três foi fundida ao término final de uma proteína alvo globular modelo, GFP. O processo descrito no protocolo produz um hidrogel contendo 1,2 milimolar de blocos de construção da estrutura do hidrogel com splicing trans e 1,2 milimolar de GFP. O hidrogel contendo GFP exibiu uma estabilidade semelhante à do hidrogel sem GFP, com cerca de 35% de perda total de proteína após 21 dias.No tamp&atilde;o DPBS, a maioria das prote&iacute;nas presentes no tamp&atilde;o de eros&atilde;o estava clivada nas teenas. A lixivia&ccedil;&atilde;o de SH 3G FP de um hidrogel contendo o ligante S SH tr&ecirc;s &eacute; de cerca de 30% ap&oacute;s tr&ecirc;s semanas, significativamente menor do que a de um hidrogel sem o ligante s sh tr&ecirc;s, conforme observado aqui no hidrogel contendo o pept&iacute;deo da esta&ccedil;&atilde;o de acoplamento. O ligante S SH tr&ecirc;s ret&eacute;m a maior parte da fluoresc&ecirc;ncia de GFP.Após três semanas, enquanto o hidrogel sem o ligante SSH torna-se essencialmente não fluorescente. A densidade de GFP imobilizada neste trabalho é de cerca de 33 por cento molar do hidrogel. Uma densidade de imobilização mais alta pode potencialmente ser alcançada quando múltiplos peptídeos de estação de ancoragem são incorporados ao bloco estrutural do hidrogel.Em seguida, a enzima HRP foi incorporada ao hidrogel proteico para demonstrar sua capacidade de suportar biocatalisadores em solventes orgânicos. A atividade enzimática foi medida por meio do monitoramento da reação de acoplamento oxidativo de NN-dimetil-p-fenilenodiamina e fenol com peróxido de t-butila ao longo do tempo. A hipótese era que o ambiente hidratado do hidrogel protegeria a enzima ligada dos efeitos desnaturantes do solvente orgânico.Após imersão em um solvente orgânico, o hidrogel contendo HRP foi manualmente fragmentado em pequenos aglomerados para aumentar a área da interface hidrofílica-hidrofóbica. O HRP incorporado ao hidrogel catalisou efetivamente a reação rápida de oxidação, gerando um produto colorimétrico. O acúmulo do produto segue uma inclinação linear, indicando pouca ou nenhuma inativação enzimática.Durante o experimento, a HRP dissolvida em DPBS primeiro, seguida pela adição ao solvente orgânico, foi capaz de catalisar a conversão, mas com uma taxa de reação muito reduzida. A baixa taxa de conversão das enzimas dissolvidas em DPBS é provavelmente devida à pequena área interfacial entre o DPBS e o solvente orgânico, o que limita a taxa de difusão do substrato e do produto. A incorporação do fragmento altamente hidrofílico s na cadeia principal do hidrogel, que efetivamente retém a água no interior do hidrogel e impede o acesso do solvente orgânico ao seu interior, permite que o hidrogel resista ao efeito desnaturante do solvente orgânico.Esses resultados indicam que o hidrogel proteico mediado por ene pode ser um suporte eficaz para reações enzimáticas em solvente orgânico. A flexibilidade estrutural e a alta estabilidade desse hidrogel autoagregado permitem que ele seja utilizado não apenas na imobilização proteica, mas também em outras aplicações, incluindo células a combustível biológicas, sistemas injetáveis de liberação de fármacos e suportes para engenharia de tecidos.

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