Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

O objetivo geral dos experimentos a seguir é produzir eficientemente quantidades de miligramas de Miran Kinlin três e cultura de células de insetos, que não podem ser produzidas em outros hospedeiros de expressão. Isso é conseguido por transecção COT, um vetor de transferência KINLIN três junto com um vírus bao projetado para criar um vírus bao recombinante carregando o gene KINLIN três. Como segunda etapa, o vírus é amplificado dentro das células do inseto para produzir uma quantidade suficiente de vírions para etapas futuras.

Em seguida, as células dos insetos são infectadas para produzir grandes quantidades de proteína Kinlin três, a fim de nos permitir a purificação por cromatografia líquida rápida. São obtidos resultados que mostram que o kinlin três funcional de alta pureza pode ser produzido em quantidades de miligramas com base na análise de página SDS e cromatografia de exclusão de tamanho. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a expressão de três em bactérias, é que a expressão de células de insetos infectadas por vírus maculares aumenta o rendimento de proteínas recombinantes em dez vezes.

As nove células SF para este procedimento são cultivadas e mantidas em suspensão usando meio SF 902 suplementado com 100 microgramas por mililitro de penicilina e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina. Para a geração do vírus bao, as células devem ser cultivadas em uma faixa de densidade de cinco vezes 10 a cinco a um vezes 10 a seis células por mililitro. Para preparar as nove células SF para transfecção, veja aproximadamente uma vez 10 elevado a seis células por poço de uma placa de cultura de tecidos estéril de seis poços em dois mililitros de meio SF 902 suplementado com penicilina e estreptomicina deixe as células SF nove por cerca de 20 minutos à temperatura ambiente na capela para aderir à base dos poços de plástico e, assim, formar uma geração de vírus balo recombinante de monocamada é alcançada por transecção de plasmídeo, DNA e DNA BMid em uma cultura SF nove monocamada.

O vetor de expressão neurônio papino empresa T três tem o camundongo KINLIN três gene empresa T três. Sob o controle do promotor viral P 10 BAO possui sequências virais bao flanqueadoras para permitir a recombinação com o meio traseiro e codifica uma etiqueta C terminal de seis chiados para purificação a jusante para cada transfecção faz um a dois microgramas de MFI T purificado três com 0,5 microgramas de B purificado e 100 microlitros de SF 902 SFM sem antibióticos. Esta é a solução A em um tubo separado, diluir seis microlitros de efeito celular em dois reagentes com 100 microlitros de SF 902 SFM sem antibióticos.

Para cada reação de transfecção, uma mistura principal pode ser criada aqui para reduzir o manuseio de líquidos se muitos transfectos forem necessários. Esta é a solução B. Misture as duas soluções A e B usando aproximadamente 200 microlitros de cada uma por transfecção e incube em temperatura ambiente por 20 minutos para formar complexos de DNA lipídico após 20 minutos, dilua os complexos de DNA lipídico com 800 microlitros por transfecção de SF 902 SFM sem antibióticos. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio monocamada de nove células SF e pipete cuidadosamente a solução AB e a mistura de meios em cima da monocamada SF nove.

Incube as células transfectadas em uma incubadora umidificada a 27 graus Celsius durante a noite, a fim de criar um ambiente umidificado para evitar que as células sequem. Coloque o prato de seis poços em um recipiente de plástico ao lado de uma toalha de papel úmida. No dia seguinte, adicione mais um mililitro de SF 900 ao SFM sem antibióticos Para cada cultura de monocamada, incube as células a 27 graus Celsius por mais cinco dias.

Após cinco dias, colha o vírus bao recombinante diretamente do meio de cultura e transfira-o para um tubo de centrífuga limpo. Clarificar quaisquer restos de células SF nove por centrifugação a 1000 Gs durante cinco minutos. À temperatura ambiente, pode-se supor que a geração de vírus tenha um título viral esperado de um vezes 10 elevado a sete PFU por mililitro.

Embora uma placa SA possa ser realizada, se necessário, armazene o estoque viral P um a quatro graus Celsius no escuro até que as células SF nove usadas para a amplificação do vírus balo recombinante em suspensão estejam em uma densidade de 1,4 vezes 10 elevado a seis células por mililitro e a cultura ocupe um 20º do volume total do frasco. Por exemplo, 50 mililitros em um frasco de dois litros. Geralmente, para uma amplificação ideal do vírus vao e produção de proteínas, a célula SF nove deve ser uniforme em tamanho e esférica.

Infecte a cultura de células SF nove com o estoque viral P one em uma multiplicidade de infecção ou MOI de 0,1 usando a seguinte fórmula. Incubar a cultura de insetos infectados com P a 27 graus Celsius com agitação a 100 RPM por 72 horas. Três dias depois, colher o vírus separando as células do meio por centrifugação a 1000 Gs por cinco minutos.

Na transferência de temperatura ambiente, o meio enriquecido do vírus clarificado em um tubo limpo. Este estoque viral é denotado como P dois e o título viral antecipado é duas vezes 10 elevado a oito PFU por mililitro. Armazene este estoque viral a quatro graus Celsius no escuro até o uso, guarde os pellets celulares resultantes a 20 graus Celsius negativos para confirmação posterior da produção de vírus recombinantes.

Para iniciar este procedimento, cultive um volume adequado de culturas de células SF nove em suspensão e SF 902 s fm. Suplementado com 100 microgramas por mililitro de penicilina e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina. A relação entre o volume total da cultura e o volume do frasco deve ser de um para cinco.

Incubar as culturas em suspensão a 27 graus Celsius com agitação a 100 RPM até atingirem uma densidade celular de duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Quando as nove culturas de SF estão em uma densidade de duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro, elas estão prontas para a infecção pelo vírus balo. Suplementar as culturas com uma concentração final de 1% de soro fetal bovino seguido do estoque viral P dois.

Para dar um MOI de uma incubar as culturas infectadas a 27 graus Celsius com agitação a 100 RPM 72 horas após a infecção, colha poli-histamina recombinante marcada com lin três expressando SF nove células por centrifugação a 1000 GS por 20 minutos à temperatura ambiente. Armazene o pellet de célula resultante a 20 graus Celsius negativos até o uso ou a 80 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo. Este procedimento começa com o descongelamento no gelo.

Os pellets congelados do vírus vao infectaram SF nine expressando kinlin recombinante três e Resus suspendendo os pellets com tampão de lise. Depois de incubar as células ressuspensas com o tampão de lise por cinco a 10 minutos, vórtice até que uma suspensão resus homogênea seja alcançada para posterior ruptura celular. Sonicar a amostra em banho de gelo.

Clarificar o lisado por centrifugação a 48 000 GS durante uma hora a quatro graus Celsius. Carregue os supernomes resultantes em uma coluna de armadilha de cinco mililitros de volume pré-equilibrada com tampão de lise a quatro graus Celsius a uma taxa de um mililitro por minuto. As etapas subsequentes para troca de tampão de eluição de proteínas e concentração de proteínas não serão demonstradas aqui, mas são detalhadas no manuscrito anexo.

Uma vez obtida a solução de proteína de troca tampão, aplique-a em uma coluna HP de heparina de alta armadilha de volume pré-equilibrado de cinco mililitros usando um ACTA FPLC a uma taxa de 0,5 mililitros por minuto. O KINLIN três ligado é aludido usando um gradiente linear de cloreto de sódio no mesmo tampão, aumentando a uma taxa de 10 milimolares por mililitro de etiquetas de histamina recombinantes. Espera-se que o KINLIN três elua em torno de 0,6 molar cloreto de sódio após a concentração da proteína, a etapa final é trocar a proteína usando cromatografia de exclusão de tamanho, aplique a proteína purificada em uma coluna SUEx S 210 30, purifique as proteínas de acordo com o tamanho aplicando tampão na coluna a uma taxa de 0,5 mililitros por minuto.

A proteína alusiva da coluna é fracionada e monitorada usando o absorvente a 280 nanômetros. O sucesso da geração do vírus recombinante foi verificado avaliando a presença de células recombinantes de Kinlin três e COT TRANSFECTADO SF nove por página SDS e análise ocidental, como visto neste sangue ocidental representativo de seis culturas SF nove em pequena escala usando um anticorpo anti-chiado seis, Uma faixa clara correspondente a uma proteína marcada com chiado de 75 kilodalton era visível em cada amostra, uma vez que o vírus foi amplificado e usado para infectar SF nove células em experimentos de grande escala. O KINLIN três recombinante foi parcialmente purificado por cromatografia de afinidade de metal imobilizado.

A imagem principal do gel nesta figura mostra a página SDS de afinidade de níquel purificada murina murina recombinante três expressa em SF infectada com vírus BAO nove células absorvidas proteína foi aludida usando um gradiente ole mostrado acima da imagem de gel. MW indica o marcador de peso molecular LYS é o lisado de células inteiras, FT é o fluxo através de WI é a lavagem um e WII é a lavagem dois. A análise de Western blot também foi realizada usando as frações de eluição para confirmar a presença da marca His projetada na proteína recombinante.

Em seguida, o KINLIN três parcialmente purificado foi purificado até quase homogeneidade por cromatografia de troca iônica usando uma coluna de heparina. Este painel mostra o perfil eluciano observado em 280 nanômetros em azul, exibindo um único pico simétrico escapando sob um gradiente linear de cloreto de sódio indicado em verde, usando uma faixa de concentração de cloreto de sódio de 0,05 molar a 1,0 molar. O painel inferior mostra os resultados da análise da página SDS da eluição fracionada, demonstrando a presença da proteína Kinlin três de 75 kilodaltons.

Como etapa final, a pureza KINLIN three foi polida por cromatografia de exclusão de tamanho para remover agregados e obter homogeneidade. Este perfil elúcio de filtração em gel representativo é de Kinlin três purificado usando um SUEx S 200 em Tris HCL pH 7,5 150 milimolar cloreto de sódio e um milimolar DTT a 20 graus Celsius. Com base no volume de eluição, o KINLIN três migra conforme o esperado para uma proteína de 75 kilodaltons, sugerindo que ela é predominantemente monomérica.

A próxima figura mostra os resultados da página SDS de kinlin recombinante purificado altamente concentrado três rotulado K três a 14,5 miligramas por mililitro. A produção de quantidades de miligramas de kinlin three de camundongo de comprimento total de alta pureza e cultura de células de insetos permitirá extensos estudos estruturais e análises bioquímicas da proteína. Um ensaio de deslocamento térmico baseado em piso térmico também foi realizado neste estudo para determinar quais tampões estavam se estabilizando para o KINLIN três.

O KINLIN três foi diluído em vários tampões, compreendendo uma tela bidimensional de pH versus concentração de cloreto de sódio. O painel superior é um histograma 3D das temperaturas de transição e o painel inferior mostra a mudança na temperatura de transição da média calculada de 50,4 graus Celsius. As barras são coloridas de acordo com a faixa de temperaturas a que correspondem.

Observou-se que o KINLIN três é estável em altas concentrações de cloreto de sódio dentro da faixa de PA de 7,0 a 9,0 com uma temperatura de transição consistente de 55 graus Celsius. Também foi observado que a temperatura de transição do Kinlin três foi de aproximadamente 55 graus Celsius dentro da faixa de PA de 7,0 a 7,5. Independentemente da concentração de cloreto de sódio.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir gravetos recombinantes funcionais altamente puros. Três para caracterização biofísica aprofundada e investigação adicional. Abordagens semelhantes podem ser usadas com outras amostras de proteínas difíceis de preparar, e recomendamos sua aplicação nesses casos.