Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

O objetivo geral dos seguintes experimentos é produzir com eficiência quantidades na faixa de miligramas de Miran Kinlin três e cultura de células de inseto, que não podem ser produzidas em outros sistemas de expressão. Isso é alcançado por meio da transfeção COT, utilizando um vetor de transferência KINLIN três juntamente com um vírus bao modificado para gerar um vírus bao recombinante que carrega o gene KINLIN três. Como segundo passo, o vírus é amplificado dentro de células de inseto para produzir uma quantidade suficiente de viriões para etapas futuras.

A seguir, células de inseto são infectadas para produzir grandes quantidades da proteína kinlin três, permitindo sua purificação por meio de cromatografia líquida rápida. Os resultados obtidos mostram que kinlin três funcional com alta pureza pode ser produzida em quantidades miligramas, com base na análise por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão por tamanho. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a expressão de kindling três em bactérias, é que a expressão em células de inseto infectadas por vírus baculovírus aumenta o rendimento da proteína recombinante em dez vezes.

As células SF nine para este procedimento são cultivadas e mantidas em suspensão utilizando meio SF 902 suplementado com 100 microgramas por mililitro de penicilina e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina. Para a geração do vírus bao, as células devem ser cultivadas até uma faixa de densidade de cinco vezes 10 à potência de cinco a um vezes 10 à potência de seis células por mililitro. Para preparar as células SF nine para transfeção, semeie aproximadamente um vezes 10 à potência de seis células por poço de uma placa de cultura de tecidos estéril de seis poços em dois mililitros de meio SF 902 suplementado com penicilina e estreptomicina, deixando as células SF nine por cerca de 20 minutos à temperatura ambiente na cabine de segurança para aderirem à base dos poços de plástico e, assim, formarem uma monocamada. A geração do vírus balo recombinante é obtida por cotransfeção de plasmídeo de DNA e DNA BMid em uma cultura monocamada de células SF nine.

O vetor de expressão papina neurônio firm T três contém o gene de camundongo KINLIN três firm T três. Sob o controle do promotor viral P 10 BAO, possui sequências virais BAO flanqueadoras que permitem recombinação com o back mid e codifica uma etiqueta C-terminal hiss seis para purificação posterior. Para cada transfeção, prepare uma a duas microgramas de MFI T três purificado com 0,5 microgramas de back mid purificado e 100 microlitros de SF 902 SFM sem antibióticos. Esta é a solução A. Em um tubo separado, dilua seis microlitros do reagente cell effect in dois com 100 microlitros de SF 902 SFM sem antibióticos.

Para cada reação de transfeção, pode-se preparar uma mistura-mestra aqui para reduzir o manuseio de líquidos, caso muitas transfeções sejam necessárias. Esta é a solução B. Misture as duas soluções A e B utilizando aproximadamente 200 microlitros de cada por transfeção e incube em temperatura ambiente por 20 minutos para formar os complexos de lipídeo-DNA. Após 20 minutos, dilua os complexos de lipídeo-DNA com 800 microlitros por transfeção de meio SF 902 SFM sem antibióticos. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio do monocamada de células SF nine e pipete cuidadosamente a mistura da solução AB e meio sobre o monocamada de células SF nine.

Incube as células transfectadas durante a noite em uma incubadora umidificada a 27 graus Celsius para criar um ambiente umidificado e evitar que as células sequem. Coloque a placa de seis poços em um recipiente plástico com tampa, juntamente com uma toalha de papel úmida. No dia seguinte, adicione um mililitro adicional de SF 900 ao meio SFM sem antibióticos para cada cultura de monocamada e incube as células a 27 graus Celsius por mais cinco dias.

Após cinco dias, colete o vírus recombinante bao diretamente do meio de cultura e transfira-o para um tubo de centrífuga limpo. Clarifique quaisquer resíduos celulares SF nine por centrifugação a 1000 Gs durante cinco minutos. À temperatura ambiente, transfira o vírus, que se encontra no sobrenadante resultante e é denominado P um, para um tubo limpo. Pode-se considerar que a geração do vírus P um possui uma título viral esperado de um vezes 10 à sétima PFU por mililitro.

Embora um SA de placa possa ser realizado se necessário, armazene o estoque viral P a quatro graus Celsius, no escuro, até o uso. As células SF nove utilizadas para a amplificação do vírus balo recombinante em suspensão devem apresentar densidade de 1,4 vezes 10 à sexta células por mililitro, e o cultivo deve ocupar um vigésimo do volume total do frasco. Por exemplo, 50 mililitros em um frasco de dois litros. Geralmente, para amplificação ideal do vírus vao e produção proteica, a célula SF nove deve ser uniforme em tamanho e esférica.

Infecte a cultura celular SF9 com o estoque viral P1 em uma multiplicidade de infecção ou MOI de 0,1 utilizando a seguinte fórmula. Incube a cultura de inseto infectada com P1 a 27 graus Celsius com agitação a 100 rpm por 72 horas. Três dias depois, recolha o vírus separando as células do meio por centrifugação a 1000 ×g por cinco minutos.

À temperatura ambiente, transfira o meio enriquecido com vírus clarificado para um tubo limpo. Este estoque viral é denominado P dois, e o título viral esperado é de dois vezes 10 à oitava PFU por mililitro. Armazene este estoque viral a quatro graus Celsius, ao abrigo da luz, até o uso; conserve os pellets celulares resultantes a vinte graus Celsius negativos para posterior confirmação da produção de vírus recombinante.

Para iniciar este procedimento, cultive um volume adequado de células SF nine em suspensão em SF 902 s fm suplementado com 100 microgramas por mililitro de penicilina e 100 microgramas por mililitro de estreptomicina. A proporção entre o volume total de cultura e o volume do frasco deve ser de um para cinco.

Incube as culturas em suspensão a 27 graus Celsius com agitação a 100 RPM até atingirem uma densidade celular de dois vezes 10 à sexta células por mililitro. Quando as culturas de SF nine atingirem uma densidade de dois vezes 10 à sexta células por mililitro, estarão prontas para infecção pelo vírus balo. Suplemente as culturas com uma concentração final de 1% de soro bovino fetal, seguido pelo estoque viral P dois.

Para obter uma MOI de um, incubar as culturas infectadas a 27 graus Celsius com agitação a 100 RPM. Após 72 horas da infecção, colher as células SF9 que expressam a lin proteína recombinante com marcação poli-histidina por centrifugação a 1000 ×g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Armazenar o pellet celular resultante a menos 20 graus Celsius até o uso ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Este procedimento inicia com o descongelamento em gelo.

Os pellets congelados de células SF9 infectadas com o vírus vao, expressando a quinase recombinante três e Resus, suspender os pellets com tampão de lise. Após incubar as células re-suspensas com o tampão de lise por cinco a 10 minutos, agitar em vórtex até obter uma suspensão homogênea para posterior rompimento celular. Sônica a amostra em banho de gelo.

Clarifique o lisado por centrifugação a 48.000 ×g durante uma hora a quatro graus Celsius. Carregue o sobrenadante resultante em uma coluna Histrap de cinco mililitros pré-equilibrada com tampão de lise a quatro graus Celsius, a uma taxa de um mililitro por minuto. Os passos subsequentes para troca do tampão de eluição proteica e concentração proteica não serão demonstrados aqui, mas estão detalhados no manuscrito suplementar.

Uma vez obtida a solução proteica após a troca de tampão, aplique-a em uma coluna de heparina HP de cinco mililitros, previamente equilibrada, utilizando um sistema ACTA FPLC a uma taxa de 0,5 mililitros por minuto. A KINLIN três retida é eluída usando um gradiente linear de cloreto de sódio no mesmo tampão, aumentando a uma taxa de 10 milimolar por mililitro, com base nas etiquetas de histidina recombinantes. Espera-se que a KINLIN três seja eluída em torno de 0,6 molar de cloreto de sódio. Após concentrar a proteína, a etapa final consiste em realizar a troca de tampão da proteína utilizando cromatografia de exclusão por tamanho: aplique a proteína purificada em uma coluna SUEx S 210 30 e purifique as proteínas de acordo com o tamanho, aplicando o tampão na coluna a uma taxa de 0,5 mililitros por minuto.

A proteína eluída da coluna é fracionada e monitorada utilizando o absorbente em 280 nanômetros. O sucesso da geração do vírus recombinante foi verificado pela avaliação da presença do Kinlin recombinante três e das células SF9 TRANSFECTADAS CO em SDS-PAGE e análise por Western, conforme observado neste exemplo representativo de ensaio Western de seis culturas em pequena escala de células SF9 utilizando um anticorpo anti-His seis. Uma faixa distinta correspondente a uma proteína marcada com His de 75 kilodaltons foi visível em cada amostra após o vírus ter sido amplificado e utilizado para infectar células SF9 em experimentos em larga escala. O Kinlin recombinante três foi parcialmente purificado por cromatografia de afinidade com metal imobilizado.

A imagem principal do gel nesta figura mostra a eletroforese SDS-PAGE de quinase murina recombinante três purificada por afinidade ao níquel, expressa em células SF9 infectadas pelo vírus BAO. A proteína absorvida foi eluída utilizando um gradiente de ureia, mostrado acima da imagem do gel. MW indica o marcador de peso molecular, LYS é o lisado celular total, FT é o fluxo que passou, WI é a primeira lavagem e WII é a segunda lavagem. Também foi realizada análise por Western blot utilizando as frações de eluição para confirmar a presença da etiqueta his projetada na proteína recombinante.

Em seguida, a KINLIN três parcialmente purificada foi ainda mais purificada até uma quase homogeneidade por cromatografia de troca iônica utilizando uma coluna de heparina. Este painel mostra o perfil de eluição observado a 280 nanômetros em azul, exibindo um único pico simétrico eluindo sob um gradiente linear de cloreto de sódio indicado em verde, utilizando uma faixa de concentração de cloreto de sódio de 0,05 molar a 1,0 molar. O painel inferior mostra os resultados da análise por eletroforese SDS-PAGE das frações eluídas, demonstrando a presença da proteína de 75 quilodaltons, Kinlin três.

Como etapa final, a pureza da quinlina três foi refinada por cromatografia de exclusão por tamanho para remover agregados e alcançar homogeneidade. Este perfil representativo de eluição por filtração em gel é da quinlina três purificada utilizando uma coluna SUEx S 200 em Tris HCl pH 7,5, 150 milimolar de cloreto de sódio e 1 milimolar de DTT a 20 graus Celsius. Com base no volume de eluição, a quinlina três migra conforme esperado para uma proteína de 75 quilodaltons, sugerindo que ela é predominantemente monomérica.

A próxima figura mostra os resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS de quinina recombinante altamente purificada e concentrada, rotulada como K3, a 14,5 miligramas por mililitro. A produção de quantidades na ordem de miligramas de quinina murina completa e de alta pureza em cultura de células de inseto permitirá estudos estruturais extensivos e análises bioquímicas da proteína. Um ensaio de deslocamento térmico baseado em termofluorescência também foi realizado neste estudo para determinar quais tampões estabilizavam a quinina três.

KINLIN três foi diluído em diversos tampões, compreendendo uma tela bidimensional de pH versus concentração de cloreto de sódio. O painel superior é um histograma tridimensional das temperaturas de transição e o painel inferior mostra a variação da temperatura de transição em relação à média calculada de 50,4 graus Celsius. As barras são coloridas de acordo com a faixa de temperaturas às quais correspondem.

Observou-se que o Kinlin três era estável em altas concentrações de cloreto de sódio dentro da faixa de PA de 7,0 a 9,0, com uma temperatura de transição constante de 55 graus Celsius. Também foi observado que a temperatura de transição do Kinlin três era aproximadamente 55 graus Celsius dentro da faixa de PA de 7,0 a 7,5, independentemente da concentração de cloreto de sódio.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir cinetina recombinante funcional altamente pura, destinada à caracterização biofísica detalhada e a investigações adicionais. Abordagens semelhantes podem ser utilizadas com outras amostras proteicas difíceis de preparar, e recomendamos sua aplicação nesses casos.