Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected ⁺ As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um Ex vivo Co-cultura do sistema.

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar a detecção inata de células T positivas para HIV V um, CD quatro infectadas por células dendríticas plasmocitóides, ou PDCs. Isso é feito primeiro infectando quatro células T positivas para CD com H HIV V um. Na segunda etapa, as células T infectadas são co-cultivadas com PDCs.

Após 18 a 22 horas, os sobrenadantes das coculturas são recuperados para quantificação da produção de interferon tipo um de PDC. Em última análise, a produção de interferon tipo um pode ser usada para avaliar a sensibilidade do sangue humano, PDC isolado para CD quatro células T positivas H HIV uma infecção. Este método pode ser útil para estudar o fator viral e do hospedeiro que governa a resposta imune inata inicial no reconhecimento do patógeno, como o reconhecimento de células T CD quatro infectadas pelo HIV por células líticas plasmocitóides.

Embora esses protocolos tenham como objetivo medir o interferon tipo um, eles podem ser facilmente modificados para detectar outras moléculas bioativas liberadas por PCs após o reconhecimento de células T infectadas, como interfer gama, TNF alfa ou parentes Para a infecção de DC primário, quatro células T positivas começam ativando o sangue periférico humano, CD isolado quatro células T positivas com PHAL por 48 horas. Mantenha as células em meio completo, suplementado com IL dois recombinante por pelo menos três dias antes da infecção. Em seguida, em um laboratório de nível de biossegurança três, infectar as células T com vírus HIV um usando diferentes multiplicidades de infecção, dois dias após a infecção.

Avalie as culturas de células quanto à expressão de GFP, BST dois e CD quatro. Use apenas culturas com positividade de 20 a 50% de GFP para os experimentos de co-cultura em uma instalação de nível dois de biossegurança. Em seguida, isolar as células mononucleares de uma amostra de sangue periférico humano por centrifugação por gradiente de densidade dentro de meia hora após a colheita de sangue.

Em seguida, core as células com os anticorpos apropriados para confirmar que as linhagens celulares desejadas foram isoladas em proporções fisiológicas. Trabalhando rapidamente para manter as células frias. Use um kit de seleção negativa de PDC para enriquecer os PDCs dentro do PBMC isolado seguindo as recomendações do fabricante.

Em seguida, confirme a porcentagem de pureza de enriquecimento e as quantidades relativas de marcadores de superfície específicos do PDC, como I LT sete e BDCA dois por citometria de gripe. As amostras enriquecidas devem conter pelo menos 40% de PDCs agora co-cultivando 220 microlitros das células de detecção com 30 microlitros de células T infectadas por poço em uma placa inferior em U de 96 poços Inclua poços de controle contendo apenas as células de detecção ou alvo, ajustando esses poços para um volume final de 250 microlitros com meio completo. Para avaliar as respostas do PDC a agonistas conhecidos do receptor do tipo toll, adicione um agonista TLR sete ou TLR nove aos poços apropriados e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 18 a 22 horas.

No final da co-cultura, transferir as células para uma placa inferior em V de 96 poços e centrifugar a placa durante cinco minutos a 400 Gs e à temperatura ambiente. Em seguida, transfira os sobrenadantes para uma placa de fundo plano de 96 poços. Resus suspende os pellets celulares em aldeído paraforme a 2% e analisa-os por citometria de fluxo usando seu tamanho e granulação para distinguir as células em um gráfico de dispersão direta versus lateral.

Para medir o interferon tipo um bioativo usando células repórter alfa beta de interferon hcbl, primeiro coloque as células repórter a uma densidade de 50.000 células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços até um volume final de 180 microlitros. Em seguida, adicione 20 microlitros do sobrenadante de cocultura recém-colhido a cada poço em duplicata, inclua um conjunto de controles de padrão interno e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 18 a 22 horas para determinar os níveis de fosfatase alcalina liberada das células repórter a 180 microlitros de solução azul quântica para cada poço de uma nova placa de fundo plano. Em seguida, adicione 20 microlitros dos sobrenadantes de células beta de interferon alfa induzidas HEC PLU a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius até que a cor se desenvolva nos poços de controle de interferon padrão.

A solução de azul quântico muda de rosa para azul púrpura na presença da enzima. Finalmente, use um espectrofotômetro para avaliar os níveis de fosfatase alcalina secretada em 620 a 655 nanômetros e determine a concentração de interferon tipo um por extrapolação da parte linear da curva padrão do interferon. Devido à natureza variável das células primárias, é importante que as proporções normais de células T mielóides positivas para CD 14 e células T positivas para CD três sejam observadas, conforme mostrado nesses gráficos de pontos representativos.

Além disso, apenas um baixo número de células T ativadas identificadas por seus níveis mais altos de dispersão direta e CD três são desejáveis nas culturas de PBMC recém-isoladas. Mais importante, a porcentagem relativa de PDCs precisa ser determinada, embora essa porcentagem possa variar de 0,2 a 1,2%Um fenótipo de detecção anormal também é observado em ambos os extremos dessa faixa. O enriquecimento dos PDCs usando seleção negativa geralmente produz 50 a 95% de pureza de PDC, como visto nesses dois gráficos de pontos representativos de diferentes doadores.

Um exemplo prototípico do experimento geral é demonstrado nas próximas figuras. Neste estudo representativo. Quatro células MT foram infectadas com P e l 4,3 GFP, tipo selvagem IRIS NF ou VPU delta para atingir 30% de infecção no momento da co-cultura.

Conforme descrito anteriormente, apenas as infecções com vírus do tipo selvagem resultaram em uma regulação negativa significativa do BST dois de superfície. Devido às suas diferenças de tamanho e granularidade, as células MT quatro podem ser facilmente distinguidas das p BMCs por citometria de fluxo após a co-cultura apenas pbmc na presença de agonistas TLR sete ou TLR nove conhecidos ou pbmc em contato com células infectadas pelo HIV um liberaram quantidades significativas de interferon tipo um. Nenhum interferon foi detectado em pbmc sozinho em co-cultura de Pbmc com quatro células MT infectadas simuladas ou quatro células MT infectadas sozinhas no exemplo apresentado aqui, a detecção inata de HIV uma MT infectada quatro células por pbmc foi significativamente reduzida na presença de VPU.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar todas as fontes de contaminação. Sempre use soluções livres de endotoxinas. Lembre-se de verificar rotineiramente se há contaminações por micoplasma e manter suas células em cultura sem antibióticos, pois até mesmo infecções bacterianas controladas podem ser detectadas por PBMs.

Não se esqueça de que os PCs são células muito frágeis. Eles têm uma vida útil limitada e sua capacidade de resposta pode ser afetada se o procedimento não for realizado em tempo hábil.