Name: A sorotipagem capsular de Streptococcus pneumoniae Usando o Reaction Quellung (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Aprenda a sorotipagem capsular de Streptococcus pneumoniae usando a reação de Quellung com microscopia de contraste de fase. Este método padrão ouro permite identificar sorotipos em cerca de 10 minutos.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (projeto PneuCarriage, Grant 52099) e Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria. Graças à Eileen Dunne, Janet Strachan, e Kim Hare para a leitura crítica do manuscrito.

1. Preparação da suspensão de células para digitação <ol><li> Usando um circuito descartável 1 ml estéril, dê uma pequena varredura de fresco durante a noite pura cultura de pneumococos cultivadas em ágar sangue de cavalo não seletivo sólida e inocular 100 mL Heart Infusion (HI) caldo. A suspensão deve aparecer para ser apenas visivelmente turva. Agite suavemente o tubo para emulsionar. Nota: Outras mídias, como caldo Brain Heart Infusion também podem ser adequados. A adição de soro (por exemplo, uma concentração final de 10% (v / v) de soro de cavalo) e incubação a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora antes da utilização pode ser usado para aumentar a reacção. </li></ol> 2. Verificando densidade de suspensão celular A suspensão de células, preparado no passo 1.1, também irá ser utilizada como controlo negativo, e deve ser verificada a densidade de células antes da adição de soros de digitação. <ol><li> Utilizando um ciclo de 1 ml, transferem uma gota de inoculo, preparado no passo 1.1 para um coposlides s microscópio. </li><li> Utilizando um par de pinças, colocar uma pequena lamela circular sobre a suspensão. </li><li> Usando o ajuste de contraste de fase, a preparação observar microscopicamente com uma ampliação de 400x, para verificar a densidade da suspensão (Figura 1A). <ol><li> Se o inoculo é demasiado pesada (Figura 2A), adicionar mais caldo para a suspensão de células feitas no passo 1.1 para a diluir. Delicadamente misture novamente. </li><li> Se o inóculo é muito leve, por exemplo, existem &lt;50 células visíveis no campo microscópico (Figura 2B), adicionar mais bactérias para a preparação da suspensão de células feitas no passo 1.1 e misturar suavemente. Nota: Com a experiência, a densidade da suspensão de células pode ser julgada pelo tremendo e segurando-se para a luz, onde ele deve aparecer para ser apenas visivelmente turva. </li></ol></li><li> Repita os passos 2,1-2,3 até que um número adequado de células estão disponíveis no campo do microscópio. Nota: lâminas de vidro e coverslips apresentar um risco de farelos. Após o uso, lâminas e lamínulas estão contaminados com material infeccioso e deve ser descartado em um recipiente biohazard farelos. </li></ol> 3. Datilografia <ol><li> Transferir ~ 1 ul do inoculo preparado (por exemplo, utilizando um ciclo de pi 1) sobre a lâmina de vidro de microscópio. Descarte o loop para o recipiente biohazard farelos. </li><li> Adicionar um volume igual (1 ml ansa cheia) de temperatura ambiente anti-soro para o slide e misturar os dois cai bem com o loop. </li><li> Usando um par de fórceps, coloque uma pequena lamela circular sobre a suspensão, tomando cuidado para não tocar a queda. Coloque a lamela sobre a suspensão imediatamente após a adição de anti-soros para impedir o líquido no diapositivo de secar. </li><li> Usando um microscópio, observe a suspensão nos termos de contraste de fase com aumento de 400X. Uma reacção negativa Quellung é observada quando pouco ou nenhum &quot;inchaço&quot; das células de pneumococos pode ser visto em 40Ampliação 0X, semelhante ao que é observado na suspensão de células de pneumococo, com anti-soros não adicionado (controlo negativo). Observou-se uma reacção positiva Quellung quando as células parecem alargada ou &quot;inchado&quot; e mais visível quando comparado com as células do controlo negativo. Nota: As reacções ambíguos devem ser investigada, por exemplo, examinando a reacção após 5-10 min de incubação à temperatura ambiente, ou por repetição da reacção com mais soro. </li><li> Conduzir sorotipagem pneumocócica com testes sucessivos de piscinas anti-soros individuais até uma reação positiva é observada. Alternativamente, piscinas pode ser aplicado em &#39;rodadas&#39;, dependendo da incidência local dos sorotipos. Nota: Testes em &#39;rodadas&#39; garante que as piscinas que contêm anticorpos para os sorotipos mais comuns são testados primeiro, minimizando o esforço e custo. Teste simultâneo de várias piscinas também fornece controles negativos adicionais, o que pode ser útil em interpretation. Se todas as piscinas em um &#39;round&#39; em particular são negativos, testar o isolado com rodadas subseqüentes de piscinas. </li><li> Testar o isolado usando o apropriado tipo ou grupo de soro contida na piscina reactivo. Se for o caso, use fator anti-soros para diferenciar ainda mais o sorotipo. Nota: Chaves para o anti-soros pneumocócica fornecidos pelo fabricante são usados ​​na seleção de piscina adequada, tipo, grupo ou fator anti-soros e interpretação dos resultados (incluindo quaisquer reações cruzadas). </li><li> Se os resultados negativos são obtidos com todas as piscinas, testar o isolado com reagente Omniserum (contém anticorpos contra 91 sorotipos 21). Se uma reacção positiva Quellung ainda não se observa ao testar uma pneumocócica isolar com o reagente omniserum, isto pode ser porque o isolado está expressando pouca ou nenhuma cápsula, ou que os anticorpos contra o serotipo não estão representados na omniserum. Esta última categoria pode incluir novos sorotipos. </li> &lt;/ Ol&gt;

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical%2C+genetic%2C+and+serological+characterization+of+two+capsule+subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+strains%3A+discovery+of+a+new+pneumococcal+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype.</a> J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Johnson, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+serotypes+causing+invasive+pneumococcal+disease+among+children+under+five%3A+the+pneumococcal+global+serotype+project%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project.</a> PLoS Med. 8, (2010).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+pneumococci+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 348, 271-272 (1996).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Austrian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quellung+reaction%2C+a+neglected+microbiologic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mt.+Sinai.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The quellung reaction, a neglected microbiologic technique.</a> Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).</li>
<li>Konradsen, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe.</a> Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).</li>
<li>Lovgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+international+external+quality+assurance+model+to+support+laboratory+investigation+of+Streptococcus+pneumoniae%2C+developed+for+the+SIREVA+project+in+Latin+America%2C+from%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).</li>
<li>Reasonover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+International+Circumpolar+Surveillance+interlaboratory+quality+control+program+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).</li>
<li>Hare, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDodgy+6As%26%2334%3B%3A+differentiating+pneumococcal+serotype+6C+from+6A+by+use+of+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">#34;Dodgy 6As&#34;: differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cpsA-cpsB+sequence+polymorphisms+and+serotype-%2Fgroup-specific+PCR+to+predict+51+Streptococcus+pneumoniae+capsular+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes.</a> J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).</li>
<li>Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Methods+for+the+Diagnosis+of+Meningitis+caused+by+Neisseria+meningitidis%2C+Streptococcus+pneumoniae%2C+and+Haemophilus+influenzae.+2nd+ed%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae.</a> Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).</li>
<li>Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene-technological+and+conventional+methods+in+the+identification+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).</li>
<li>SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Sorensen, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+pneumococci+by+using+12+pooled+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+to+pneumococcal+factor+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Key to pneumococcal factor antisera.</a> , (2013).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+antisera+for+in+vitro+diagnostic+use%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use.</a> , (2011).</li>
<li>Lund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+Pneumococcus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections.</a> Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).</li>
<li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%3A+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. 32, 165-179 (2013).</li>
<li>Vernet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-based+diagnosis+of+pneumococcal+pneumonia%3A+state+of+the+art+and+unmet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs.</a> Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).</li>
<li>Casewell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiences+in+the+use+of+commercial+antisera+for+the+capsular+typing+of+klebsiella+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species.</a> J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um passo essencial na presente técnica é garantir uma cultura pura é usado para preparar a suspensão, juntamente com a adição de um número adequado de células bacterianas para o caldo. Deve notar-se que o crescimento da colónia e morfologia em placas de agar varia entre os diferentes isolados de pneumococos. Alguns produzem colônias seca e áspera, o que pode ser difícil de apanhar com um laço e não emulsionar bem no caldo. Por este motivo, uma varredura maior de bactérias pode ser requerida quando se prepara a suspensão de células. Em qualquer dos casos, é imperativo que as células individuais e não agregados, são evidentes no controlo negativo assim o seu tamanho relativo pode ser comparado com as células com anti-soro adicionado. Para além disso, muitas células bacterianas podem resultar numa reacção de falso negativo, onde um excesso de antigénio capsular podem inibir a reacção de Quellung 10. Por esta razão, é importante criar uma suspensão de bactérias com uma densidade de células adequada (Figura 1). A suspensão pode ser preservado por vários meses com a adição de algumas gotas de formol concentrado. Isso permite que os ensaios de lote mais fácil e também esteriliza o caldo reduzir o risco de infecções adquiridas em laboratório, embora isso deve ser pesado contra o risco de segurança de lidar com formol, que é tóxico, corrosivo, cancerígenas, sensibilizando e inflamável. Além disso, observou-se que alguns isolados mostram reacções fracas na presença de formalina (dados não mostrados). Reacções Quellung são examinados usando um microscópio. A utilização de contraste de fase aumenta a visibilidade da cápsula. Em alguns laboratórios, a reação é visto usando de imersão em óleo a 1.000 ampliação X 14, 16. Além disso, alguns laboratórios utilizam uma mancha contador (azul de metileno), para aumentar ainda mais a visibilidade de uma reacção positiva 10, 16, 22. O método aqui apresentado é visto sem óleo-immersion e sob aumento de 400X 15, 17. Este método é rápido, simples e relativamente fácil de ler 23. É importante manter bons procedimentos de controle interno de qualidade para garantir que os procedimentos de anti-soros, testes estão em ordem. A participação em um programa de garantia de qualidade externa é muitas vezes benéfico. Uma das principais limitações da reacção de Quellung para serotipagem de pneumococos é o elevado custo dos anti-soros é necessária. No entanto, este é minimizado no protocolo de cima, devido à pequena quantidade de anti-soro utilizado para cada reacção. Vários outros métodos têm sido descritos para serotipagem de pneumococos 23, 24. No entanto, Quellung continua sendo o padrão ouro eo desenvolvimento de novos métodos requer padronização contra a reação Quellung 23. Utilizando anti-soro apropriado, a reacção de Quellung, também pode ser utilizado para identificar e tipo de outros tampõesule bactérias produtoras 25. A reação Quellung é fundamental para a caracterização de sorotipos de pneumococo atuais e emergentes, bem como a prestação de informações sobre a eficácia da vacina e do impacto a longo prazo da vacinação no transporte e na doença.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é responsável pela morte de cerca de 800 mil crianças menores de cinco anos de idade, anualmente, com o fardo da doença caindo predominantemente em países com poucos recursos 1. Doenças pneumocócicas variar em gravidade de infecções localizadas, como a otite média aguda a infecções fatais graves, como septicemia, meningite e pneumonia 2. Mais de 90 serótipos capsulares de pneumococos têm sido descritas 3, 4. Vacinas pneumocócicas actuais proporcionam protecção contra os serótipos que são responsáveis ​​pela maioria das doenças invasivas 5, 6. No entanto, o uso difundido de vacinas tem sido associada com a substituição de serotipos incluídos na vacina por serotipos não vacinais, tanto na nasofaringe e doença invasiva 7, 8. Isso ressalta a importância de sorotipagem para epidemiológicavigilância e impacto da vacina a longo prazo estuda 9. O método padrão-ouro para a digitação pneumocócica é o teste de reação capsular, conhecida como a reação Quellung, descrita pela primeira vez por Neufeld, em 1902 (ver austríaco 10). Foi encontrado um elevado grau de concordância entre laboratórios, e entre a reacção de Quellung e outros métodos de sorotipagem 11-13. Existem várias variações da reacção de Quellung, 10, 14-16. O método aqui descrito não requer a utilização de um contador de manchas ou a lente de imersão em óleo, em vez disso, uma gota de amostra preparada é misturada com o soro de tipagem e examinadas imediatamente sob uma ampliação de 400X. A reacção de Quellung, é geralmente realizada usando anti-soros disponíveis comercialmente. O método descrito aqui utiliza anti-soros menos em comparação com alguns dos outros métodos 16, 17, tornando-se mais rentável. Uma vez que um isoladorComeram é identificado como um pneumococo, é sequencialmente testados com anti-soros piscinas até uma reacção positiva é observada. Cada soro piscina contém diferentes misturas de anti-soros produzidos contra 91 sorotipos de pneumococo 18. Uma vez que a piscina está estabelecido, o tipo de indivíduo e grupo anti-soros que são incluídos na associação reactiva são testados individualmente em sequência. Tipo soros geralmente reagem com um único sorotipo (por exemplo, tipo 1 soro reage com o sorotipo 1), enquanto que os anti-soros grupo reagir com todos os sorotipos de um grupo específico (por exemplo, Grupo 22 anti-soro reage com sorotipos 22F e 22A). Alguns sorotipos dentro dos grupos são mais diferenciadas com fator anti-soros (por exemplo sorotipo 22F reage com fator 22b, 22c, mas não). Neste caso o teste é continuado com todos os anti-soros factor relevante é determinada até serótipo 19, 20. A reacção de Quellung, é simples e rápida e 14 pode ser realizada em qualquer laboratory que está equipado com um microscópio de boa qualidade e um conjunto adequado de anti-soros.

<table><tbody><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) anti-soro</td><td>SSI Diagnostica</td><td></td><td><a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> Leve todos os anti-soros à temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Omni) anti-soro</td><td>SSI Diagnostica</td><td>2438</td><td>Leve todos os anti-soros à temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DML</td><td></td></tr><tr><td>Calibrado Descartável Inoculando Loops 1 &micro; l</td><td>Copan</td><td>CD175S01</td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar sangue de cavalo (HBA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td><a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au/</a> Leve à temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Caldo de infusão cardíaca (HI)</td><td>Unidade de preparação de mídia (MPU), Universidade de Melbourne</td><td>40HIN</td><td>Leve à temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro 76 mm x 26 mm</td><td>Lomb Scientific</td><td>7101</td><td>Perigo de perfurocortantes: Descarte em um recipiente de perfurocortantes de risco biológico</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro circulares</td><td>NeuVitro</td><td>GG-5</td><td></td></tr><tr><td>*Excluindo os anti-soros, todos os outros materiais podem ser adquiridos de fornecedores alternativos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Placas preparadas a partir de sangue de ovelha desfiado são adequadas, mas placas de sangue preparadas a partir de sangue citrado ou sangue humano não são</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a sorotipagem capsular de<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; usando o reaction quellung

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Há mais de 90 diferentes sorotipos capsulares de Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Além de ser uma ferramenta para a compreensão da epidemiologia pneumocócica, sorotipagem capsular pode fornecer informações úteis para os estudos de eficácia da vacina e de impacto. A reação Quellung é o método padrão-ouro para pneumocócica sorotipagem capsular. O método envolve o teste de uma suspensão de células com anti-soros de pneumococos em pool e específico dirigido contra o polissacarídeo capsular. As reacções antigénio-anticorpo são observadas ao microscópio. O protocolo tem três passos principais: 1) preparação de uma suspensão de células bacterianas, 2) mistura de células e anti-soros sobre uma lâmina de vidro, e 3) a leitura da reacção de Quellung, usando um microscópio. A reacção de Quellung é razoavelmente simples de realizar e pode ser aplicada sempre que um microscópio e os anti-soros adequados estão disponíveis.

<html> Uma reacção positiva ocorre quando Quellung anticorpo específico para o tipo de liga-se a cápsula do pneumococo, levando a uma mudança no seu índice de refracção 10. Quando visto sob um microscópio, as bactérias parecem &#39;inchado&#39; e mais visível 14. Figura 1A mostra células pneumocócicas em caldo de HI. Quando anti-soro específico do tipo é adicionada à suspensão bacteriana, os pneumococos aparecer &quot;inchado&quot;, de refracção e mais arredondada (Figura 1B). Muitas células bacterianas adicionados ao caldo pode resultar em agregação de células ou de uma reacção de falso negativo. Figura 2 mostra inóculos de células em caldo de IC pneumococos que são &quot;demasiado pesado&quot; (Figura 2A) ou &quot;muito leve&quot; (Figura 2B). 08fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quellung reação negativa e positiva. Preparações de sorotipo 9V pneumocócica isolar sem soro (1A) e com o grupo de 9 anti-soro (1B), eram vistos sob aumento de 400X. Este último mostra o &#39;inchaço&#39; e arredondamento das células bacterianas, tipicamente visto em uma reação positiva Quellung. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2.jpg" /> Figura 2. Inóculos muito pesado e muito clara. Preparações de suspensões de células de pneumococos que são demasiado pesadas (2A) ou muito clara (2B), quando vistos sob aumento de 400X.

A reação Quellung é a técnica padrão ouro para sorotipagem Streptococcus pneumoniae. Esta técnica utiliza um microscópio e anti-soros específicos pneumocócica e é comumente usado em referência e laboratórios de pesquisa em todo o mundo.

A sorotipagem capsular de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Usando o Reaction Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a sorotipagem da cápsula de Streptococcus pneumoniae ou pneumococo utilizando a reação de Quellung. Isso é realizado primeiramente inoculando caldo de infusão de coração com um cultivo puro fresco, incubado durante a noite, de pneumococos. Na segunda etapa, uma gota do inóculo é transferida para uma lâmina de microscópio de vidro.Em seguida, soro antissoro é adicionado em volume igual sobre a lâmina. Na etapa final, ambas as gotas são misturadas e uma lamínula é colocada sobre a suspensão. Por fim, a suspensão pode ser observada em contraste de fase para verificar a reação positiva ou negativa de quelação pulmonar.Este método demonstra o método padrão-ouro para syp pneumocócica. O método é simples, fácil de realizar e fácil de interpretar. A demonstração visual deste método é importante, pois indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldade em reconhecer qual é a densidade celular adequada para realizar o teste qualm.Inicie utilizando um laço estéril descartável de um microlitro para obter uma pequena alça de uma cultura pura fresca de pneumococos cultivada em uma placa de ágar-sangue de cavalo sólido e não seletivo, e inocule os pneumococos em 100 microlitros de caldo de infusão cardíaca. A suspensão deve apresentar turvação visível leve, e agite suavemente o tubo para emulsificar a solução celular. Utilize um novo laço de um microlitro para transferir uma gota do inóculo para um microscópio de lâmina de vidro.No próximo slide, coloque uma lamínula circular pequena sobre a suspensão e verifique a densidade da suspensão em contraste de fase com aumento de 400 vezes. Se o inóculo for muito denso, dilua a suspensão celular com mais caldo e misture suavemente as células novamente; se o inóculo for muito leve, por exemplo, se houver menos de 50 células visíveis, adicione mais bactérias à suspensão celular e misture suavemente novamente.Com experiência, a densidade da suspensão celular pode ser avaliada agitando-se o tubo e segurando-o contra a luz, momento em que deverá apresentar turvação visível, mas leve. Quando observada ao microscópio, a solução celular deverá ter aproximadamente essa densidade.Uma vez que a diluição ideal da célula bacteriana tenha sido alcançada, transfira cerca de um microlitro do inóculo para a lâmina de microscópio de vidro. Em seguida, usando um novo alça, adicione um volume igual à temperatura ambiente.Antissoro na lâmina e misturar bem as duas gotas. Com o laço, colocar imediatamente uma lamínula pequena sobre a suspensão, tomando cuidado para não tocar a gota com a pinça. Em seguida, observar a suspensão em contraste de fase conforme demonstrado anteriormente.Uma reação de Quellung negativa é observada quando há pouca ou nenhuma inchação das células pneumocócicas. Semelhante ao controle negativo, uma suspensão de células pneumocócicas sem adição de antissoros. Uma reação de Quellung positiva ocorre quando o anticorpo específico do tipo se liga à cápsula do pneumococo, levando a uma alteração em seu índice de refração.Quando visualizadas em contraste de fase, as bactérias aparecem inchadas e mais visíveis. Não se esqueça de que, ao realizar este procedimento, você está trabalhando com micro-organismos vivos. Por esse motivo, é necessário ter cuidado para seguir boas práticas de laboratório, usar roupas de proteção, o equipamento laboratorial apropriado e descartar todo o material e reagentes ao final do processo de forma segura.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 10 minutos, se realizada corretamente. Após visualizar este procedimento, você terá uma boa noção de como realizar a sorotipagem do pneumococo utilizando a reação de Quellung. Esta técnica é importante para compreender a epidemiologia pneumocócica, tanto na colonização nasofaríngea quanto em doenças invasivas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método eficiente para avaliar a exposição da superfície de proteínas leptospirose é descrito. O método é projetado especificamente para evitar a ruptura da membrana externa das células frágeis leptospirose. Esta técnica exige o emprego de vários controles negativos para avaliar a integridade da membrana externa e especificidade da reação de anticorpos.

Imuno-fluorescência Ensaio de Leptospirose superfície exposta Proteínas

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Demonstramos um ensaio de PCR multiplex simples para triagem e tipagem rápidas de Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tipos I-V para Staphylococcus aureus resistente à meticilina e fornecemos algumas das etapas vitais e nuances processuais que o tornam bem-sucedido na adaptação deste ensaio a laboratórios individuais.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Teste de aglutinação em látex é um método simples, rápido e barato para sorotipagem Streptococcus pneumoniae, e também tem sido amplamente aplicada em microbiologia de diagnóstico. Este manuscrito descreve a produção in-house de reagentes de aglutinação de látex, procedimentos de controle de qualidade e da aplicação desta técnica de sorotipagem pneumocócica.

Capsular sorotipagem de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por aglutinação em látex

Streptococcus pneumoniae forma lesões microscópicas discretas e não purulentas no coração. Está delineado o protocolo para um modelo murino de formação de microlesões cardíacas. São fornecidas instruções sobre visualização de microlesões usando microscopia, discriminação entre microlesões precoces e tardias e métodos para detectar remodelação cardíaca em corações de animais convalescentes.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

Este ensaio de matança de opsonophagocytic é usado para comparar a capacidade de células fagocíticas de imunes a responder e matar as bactérias com base em diferentes tratamentos e/ou condições. Classicamente, este ensaio serve como o padrão ouro para avaliar funções efetoras dos anticorpos produzidos contra uma bactéria como opsoninas.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A expansão do código genético é aplicada para a introdução de um aminoácido não natural com um grupo funcional biorthogonal em uma proteína portadora em um local definido. A função biorthogonal é ainda utilizada para o acoplamento seletivo local de um antígeno de carboidratos para fornecer uma vacina glicoconjugar homogênea.

Glicoconjugate homogêneo produzido por incorporação combinada de aminoácidos não naturais e click-química para fins de vacina

Aqui, descrevemos uma cepa 519/43 do sorotipo 1 de S. pneumoniae que pode ser geneticamente modificada usando sua capacidade de adquirir naturalmente DNA e um plasmídeo suicida. Como prova de princípio, um mutante isogênico no gene da pneumolisina (plys) foi feito.

Construindo Mutantes na Cepa 519/43 do Streptococcus pneumoniae do Serotipo 1

Na infecção por Mycoplasma pneumoniae, os exames de sorologia podem gerar bons resultados, porém com baixa especificidade devido à reação cruzada imunológica. O ELISA interno de captura de antígenos, descrito neste artigo, garante alta especificidade de espécies e tem se mostrado um teste de triagem confiável para o diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Ensaio de imunoadsorção enzimática de captura de antígenos para detecção específica de Mycoplasma pneumoniae

Aprenda a sorotipagem capsular de Streptococcus pneumoniae usando a reação de Quellung com microscopia de contraste de fase. Este método padrão ouro permite identificar sorotipos em cerca de 10 minutos.

A sorotipagem capsular de

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