Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

O objetivo geral do experimento a seguir é usar um ensaio de imunofluorescência indireta para rastrear anticorpos antinucleares. Isso é conseguido incubando o soro do paciente com lâminas de dois substratos. O soro do paciente não ligado é lavado, os anticorpos automáticos ligados são então incubados com conjugado marcado com fluoresceína específica e o reagente não ligado é lavado.

Quando vistas através de um microscópio de fluorescência, as amostras positivas para autoanticorpos exibirão uma fluorescência verde-maçã correspondente a áreas da célula ou núcleos onde o autocorpo se ligou em um padrão de fluorescência indicativo da presença do antígeno. Em última análise, a presença de arna pode ser usada para auxiliar no diagnóstico de doenças do tecido conjuntivo. A principal vantagem do método de imunofluorescência indireta sobre outros métodos, como o Eliza em fase sólida, é que o substrato de duas células Hep contém mais de 100 antígenos expressos em sua configuração nativa.

Isso permite a identificação de quase todos os anticorpos O clinicamente relevantes, o que não é possível com técnicas de face sólida, pois o método de imunofluorescência indireta é uma técnica muito especializada. Indivíduos novos neste método precisam de tempo e prática para se tornarem proficientes no procedimento de processamento de lâminas. Interpretar as imagens do microscópio e aprender a identificar padrões relevantes também é uma habilidade que leva tempo para dominar.

Com os reagentes e ferramentas certos, os resultados são mais consistentes e fáceis de interpretar. Demonstrando o procedimento estará Cassandra Bryant, tecnóloga do Laboratório de Desenvolvimento de Ensaios Imunofluorescentes. Remova os reagentes da embalagem e permita que cada item atinja a temperatura ambiente, prepare os reagentes e dilua o soro do paciente de acordo com a direção em que as lâminas de inserção são codificadas com código de barras e podem ser facilmente integradas em sistemas automatizados.

Este procedimento ilustra o processamento manual de slides. Laboratórios de alto rendimento, no entanto, podem optar por equipamentos automatizados de processamento de lâminas com recursos de leitura de código de barras. Os instrumentos Inova são conectados por meio de uma rede inteligente centralizada que fornece controle sobre os resultados e relatórios do fluxo de trabalho.

Para IFA. Isso resulta em identificação positiva do paciente a partir do processamento e eliminação de erros de transcrição e relacionados. Distribuir uma gota de controlo positivo e uma gota de controlo negativo na lâmina adequada.

Os poços pipetam 20 a 25 microlitros de soro diluído do paciente para os poços restantes. Processe um slide de cada vez. Coloque a lâmina em um recipiente de coloração com anúncioamp toalha de papel no fundo, cubra o recipiente e incube a lâmina por 30 minutos.

As condições úmidas evitarão que o substrato seque, o que pode resultar em manchas artificiais. Durante esse período de incubação, os anticorpos antinucleares no soro do paciente se ligam aos antígenos das células que são fixadas em cada poço. Após o período de incubação, enxágue o soro usando um jato suave de tampão de lavagem para evitar danificar o substrato.

Incline ligeiramente a lâmina para que o jato não aponte diretamente para o substrato. Essa orientação das lâminas também ajudará a evitar o cruzamento de amostras entre poços. Retire o excesso de tampão de lavagem e coloque a lâmina em um frasco Copeland contendo tampão de lavagem.

O tempo de incubação para a etapa de lavagem deve ser de aproximadamente cinco minutos. Remova as lâminas do tampão de lavagem e bata suavemente. Para remover o excesso de tampão de lavagem, aplique uma gota de conjugado fluorescente em cada poço.

Para um teste de NA, recomenda-se o uso de um conjugado específico de IgG FC. Incube as lâminas por 30 minutos no recipiente umidificado e certifique-se de recolocar a tampa de coloração. O conjugado é sensível à luz e a tampa protegerá os slides da exposição à luz.

Durante este período de incubação, o conjugado se ligará aos anticorpos antinucleares do paciente que se ligaram aos antígenos celulares. Essa ligação conjugada resulta na presença de fluorescência nos poços após a incubação. Lave a lâmina com tampão de lavagem.

Como antes, coloque uma lamínula em uma toalha de papel e aplique o meio de montagem em uma linha contínua na borda inferior da lamínula. Remova cada lâmina do tampão de lavagem e bata suavemente na lâmina. Para remover o excesso de tampão de lavagem, toque a borda inferior da corrediça na borda da lamínula.

Abaixe suavemente o slide na lamínula de forma que o meio de montagem na lamínula flua para a borda superior da corrediça sem que a tampa da bolha de ar escorregue, incluindo a quantidade ideal de meio de montagem é uma técnica que requer prática para uma visão perfeita. Lâminas com microscópio fluorescente localizado em uma sala escura, a varredura de todo o poço deve ser realizada com uma objetiva de 20 x ou 25 x. Para avaliar a distribuição celular e a uniformidade da fluorescência, mude para uma objetiva de 40 x.

Para fazer a interpretação final sobre positividade e padrão, observe os controles positivos e negativos. O controle negativo pode não parecer completamente escuro, mas geralmente exibirá fluorescência não específica de baixo nível. O controle positivo exibirá fluorescência verde maçã brilhante no núcleo.

A positividade pode ser classificada usando uma escala de classificação de reatividade de um a quatro mais. Além da interpretação manual, as lâminas podem ser carregadas e digitalizadas pelo microscópio de fluorescência automatizado. Nenhuma sala escura é necessária.

Depois de criar um projeto selecionando o tipo de slide apropriado, o instrumento adquire e armazena imagens digitais de alta resolução das células em cada poço. Além disso, o Nova View mede a intensidade da luz fluorescente e categoriza os resultados como positivos ou negativos e fornece reconhecimento de padrões para amostras positivas. As imagens são visualizadas pelo operador em um monitor de computador de alta resolução, permitindo a interpretação final, revisão e confirmação do Nova View.

Relatórios de resultados podem ser gerados em resultados confirmados. A ligação do auto-anticorpo nas estruturas proteicas constituintes dentro do núcleo resulta em cinco padrões nucleares principais, incluindo centrômero homogêneo, salpicado, nucleolar e ponto nuclear. Para identificar um padrão homogêneo como mostrado aqui, identifique as células mitóticas ou em divisão.

As células mitóticas mostram fluorescência uniforme sólida, que geralmente é mais pronunciada do que nas células em repouso. Os núcleos das células em repouso devem ser uniformes com coloração difusa. Esse padrão característico é provavelmente o resultado de autoanticorpos para DNA de fita dupla.

Uma característica chave do padrão salpicado é a aparência de slot de moeda das células mitóticas metafásicas. A região cromossômica dessas células é negativa. As células em repouso exibem um padrão de manchas em todos os núcleos.

O salpicado pode ser definido como grosso ou fino. O speckling do curso é o resultado de autoanticorpos para SM e RNP. O salpicamento fino pode ser devido a autoanticorpos contra S-S-A-S-S-B, bem como RNA polimerase.

O padrão DFS é referido como denso, salpicado fino e é indicativo de anticorpos automáticos para DFS 70. As células mitóticas mostram coloração salpicada, enquanto as células em repouso exibem manchas finas uniformemente distribuídas por todo o núcleo. Nesses casos, testes confirmatórios devem ser realizados, pois os autoanticorpos DFS 70 são prevalentes em indivíduos saudáveis versus pacientes com doença do tecido conjuntivo.

Para identificar o padrão do centrômero, escaneie os poços e identifique as células mitóticas ou em divisão. As células em divisão têm numerosas manchas discretas em estreita associação umas com as outras, muitas vezes chamadas de barra metafásica. As células em repouso mostram aproximadamente 40 a 60 manchas discretas distribuídas por todo o núcleo.

O padrão de centrômero está associado a autoanticorpos para proteínas de centrômero com o padrão nucleolar. A coloração da região cromossômica nas células mitóticas é variável. O padrão nucleolar está associado à coloração homogênea ou salpicada dos núcleos, juntamente com a coloração fraca, salpicada ou homogênea do nucleoplasma dos núcleos das células em repouso.

Esse padrão está associado a autoanticorpos para RNA polimerase três fibrilina e anticorpos PM SCL. O padrão de pontos nucleares está associado a metáfases negativas, células mitóticas e poucos pontos discretos nos núcleos das células em repouso. Esse padrão característico é frequentemente o resultado de autoanticorpos para SP 100 PML ou P 80 colan.

Esses anticorpos estão associados à cirrose biliar primária e à hepatite autoimune. Na imagem mostrada, o padrão de pontos nucleares exibe coloração citoplasmática devido a autoanticorpos para antígenos mitocondriais. A detecção de anticorpos antinucleares e o reconhecimento de padrões servem como uma ferramenta importante para auxiliar no diagnóstico do paciente.

Compreender o significado de vários padrões permite que os médicos e o pessoal do laboratório realizem testes de acompanhamento apropriados. Os fatores mais importantes para identificar corretamente os padrões de anticorpos antinucleares são selecionar um substrato celular de alta qualidade e processar as lâminas com uma boa técnica consistente. A leitura de lâminas é tradicionalmente realizada por microscopia fluorescente em salas escuras e é feita por tecnólogos treinados que estão familiarizados com os vários padrões no contexto do ciclo celular e da morfologia celular.

Nos últimos anos, sistemas de imagem digital foram desenvolvidos para a leitura automatizada das lâminas, tais instrumentos automatizaram o fluxo de trabalho e aumentaram a consistência da leitura e interpretação. Além disso, com o uso de lâminas com código de barras, a rastreabilidade da amostra em todo o processo elimina possíveis erros de transcrição e aumenta a integridade dos dados e a segurança do paciente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar cada etapa do procedimento de imunofluorescência indireta e como identificar padrões de anticorpos antinucleares clinicamente relevantes.