Name: Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprenda a técnica de imunofluorescência indireta para triagem de anticorpos antinucleares em soro humano usando células HEp-2. Este método auxilia no diagnóstico de doenças reumáticas autoimunes sistêmicas.

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Agradecemos Cassandra Bryant para a realização do experimento IIF e Carol Buchner para ela especialista revisão técnica.

1. Preparação de amostras e Substrato Seleção <ol><li> Remover reagentes de embalagem e permitir que cada item para voltar à temperatura ambiente. Preparar os reagentes e diluir o soro do paciente de acordo com a direcção de inserção. Nota: NOVA Lite slides estão com código de barras e pode ser facilmente integrado em sistemas automatizados em conjunto com o Sistema de Informação do Laboratório LIS. Este procedimento ilustra o processamento de slides manual; laboratórios de alto rendimento, no entanto, pode optar por equipamentos automatizados de processamento de slide. </li></ol> 2. Adição de controles e amostras <ol><li> Dispensar uma gota de controlo positivo, e 1 gota de controlo negativo para os poços de deslizamento apropriados. Pipeta de 20-25 ul de soro de um paciente diluída aos poços restantes. Processe um slide de cada vez. </li><li> Colocar a lâmina (s) em um recipiente de coloração com uma toalha de papel húmido no fundo. Cobrir o recipiente e incubar a lâmina (s), durante 30 min. Nota: As condições de umidade vaievitar que o substrato de secar. A secagem dos poços pode resultar em fluorescência artificial. Durante este período de incubação, os anticorpos anti-nucleares em soro do paciente, ligam-se a antigénios das células que estão fixos em cada poço. </li><li> Após o período de incubação, enxaguar o soro utilizando uma corrente suave de tampão de lavagem. A fim de evitar danos no substrato e evitar cross-over de amostras entre os poços, o ângulo de deslize ligeiramente para evitar a dirigir o fluxo directamente nos poços. Toque fora tampão de lavagem em excesso e coloque o slide em uma jarra de Coplin contendo tampão de lavagem por cerca de 5 min. </li></ol> 3. Adição de Fluorescente Conjugado <ol><li> Um por um, remova os slides da tampão de lavagem e bata suavemente para remover o excesso de tampão de lavagem. Aplicar uma gota de conjugado fluorescente (FITC IgG anti-humano) em cada poço. Incubar as lâminas por 30 min no recipiente umidificado, e não se esqueça de substituir a coloraçãotampa do recipiente. Nota: Para o teste ANA, é recomendado o uso de um conjugado específico IgG Fc. O conjugado é sensível à luz, e a tampa irá proteger as lâminas da exposição à luz, além de manter o ambiente humidificado. Durante este período de incubação, o conjugado irá ligar-se a anticorpos anti-nucleares do paciente que se ligaram aos antigénios celulares. Resultados da ligação deste conjugado na presença de fluorescência nas cavidades. </li><li> Lavar e lavar a lâmina, como descrito acima. </li><li> Coloque uma lamela sobre uma toalha de papel e aplicar o meio de montagem numa linha contínua para a extremidade inferior da lamela. </li><li> Retire cada slide da tampão de lavagem e bata suavemente a lâmina para remover o excesso de tampão de lavagem. Tocar a borda inferior da lâmina para a extremidade da lamela. </li><li> Cuidadosamente, baixe a lamela na lâmina, de tal forma que o meio de montagem na lamela flui para a extremidade superior da lâmina, sem a formação de bolhas de ar. Nota: Coverslipping, inclusive usando a quantidade ideal de meio de montagem, é uma técnica que requer prática para aperfeiçoar. </li></ol> 4. Identificação de resultados positivos e negativos Interpretação manual <ol><li> Ver slides com um microscópio de fluorescência, localizada em um quarto escuro. Realizar a verificação da totalidade do poço com uma objectiva 20X ou 25X para avaliar a distribuição de células e uniformidade de fluorescência </li><li> Mudar para uma objetiva de 40X para fazer a interpretação final sobre positividade e padrão. </li><li> Olhe para os controles positivos e negativos. Grau positividade usando uma escala de classificação de reatividade de 1 + a 4 +. Nota: O controle negativo não pode aparecer completamente escuro, mas muitas vezes irá exibir baixo nível de fluorescência inespecífica. O controle positivo irá exibir fluorescência verde maçã brilhante no núcleo (Figura 1). </li></ol> Interpretação automatizada Nota: Em comum, alémsobre a interpretação manual, carga e digitalizar slides pela Nova Visão Automated microscópio de fluorescência ou outro instrumento automatizado de imagem digital; nenhuma câmara escura é necessária. Depois de criar um projeto, selecionando o tipo de slide for o caso, o instrumento adquire e armazena imagens digitais de alta resolução de células em cada poço. Além disso, a NOVA Ver mede a intensidade da luz fluorescente, e classifica os resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões de amostras positivas. As imagens são visualizadas pelo operador em um monitor de computador de alta resolução, permitindo a interpretação final, revisão e confirmação da NOVA Ver resultado. Os relatórios podem ser gerados em resultados confirmados. Microscopia digital deve ser usado em conjunção com um técnico de laboratório experiente, pois destina-se a ajudar na interpretação dos resultados.

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<li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li>
<li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li>
<li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis%2Fscleroderma+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li>
<li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li>
<li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li>
</ol>

Os autores Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, e Anna Eslami são funcionários da INOVA Diagnostics.

A triagem por células HEp-2 é um primeiro passo crítico no diagnóstico de pacientes com SARD. No entanto, os métodos de IFI carecem de harmonização. As fontes de variabilidade incluem preparação de lâminas, especificidade conjugada e eficiência do microscópio fluorescente e experiência do leitor. Apesar dessas preocupações, o IIF continua sendo o "padrão ouro" para testes de ANA. As células HEp-2 contêm uma grande variedade de autoantígenos e fornecem o substrato ideal para a detecção desses autoanticorpos. Em alguns laboratórios, a IFI foi substituída por métodos de triagem em fase sólida, como ensaio multiplex ou ELISA. A deficiência de tais testes é que eles não exibem toda a gama de antígenos para serem suficientemente sensíveis. Como consequência, pacientes verdadeiros positivos podem ser perdidos, o que pode ter consequências deletérias Além dos problemas de atraso no tratamento e diagnóstico incorreto, podem ocorrer custos adicionais de saúde devido à repetição de testes confirmatórios ou investigações diagnósticas desnecessárias. Dados os desafios inerentes à IFI, é fundamental realizar essa técnica adequadamente para evitar subjetividade nos resultados.
Para garantir uma interpretação precisa e relatar os resultados da triagem de FAN, é vital usar o substrato da mais alta qualidade. Ao selecionar um substrato HEp-2, é fundamental que as células sejam otimizadas para expressar epítopos clinicamente relevantes em seu estado de proteína nativa. As linhagens celulares HEp-2 transfectadas ou modificadas podem não permitir a ligação adequada anticorpo-antígeno. Além disso, quando vários autoanticorpos diferentes estão presentes simultaneamente, as células recombinantes podem mascarar um ou mais padrões. Um alto número de células mitóticas também deve estar presente no substrato. O número adequado de células mitóticas permite a identificação rápida e precisa dos padrões. 
Além dos atributos do substrato, o objetivo deste protocolo de vídeo é descrever a técnica de IFI, mostrando etapas críticas, como adição de amostra, lavagem de lâminas, adição de conjugado, deslizamento de cobertura e determinação de resultados positivos e negativos. Os resultados podem ser comprometidos se a técnica adequada não for usada para cada uma dessas etapas. A lavagem adequada é importante para remover todos os anticorpos não ligados. Alguns pacientes apresentam quantidades muito altas de autoanticorpos e, nesses casos, é importante lavar o soro dos poços para que não contamine outros poços. 
Embora a IFI tenha sido tradicionalmente um método laboratorial subjetivo e muito trabalhoso, novas tecnologias, como processadores de lâminas, lâminas com código de barras e microscopia digital automatizada, podem simplificar muito o fluxo de trabalho, aumentar a consistência e reduzir as fontes de variabilidade da interpretação.

O termo anticorpos antinucleares (ANA) descreve uma variedade de auto-anticorpos que reagem com os componentes de núcleos de células, incluindo DNA, proteínas e ribonucleoproteínas 1, 2. A células HEp-2, um array de proteínas nativas com centenas de antigénios, fornece um substrato ideal para a detecção de ANA 1. A detecção de ANA no soro humano é uma importante ferramenta de triagem para doenças do tecido conjuntivo, e IIF é o método de referência para o teste ANA 1. Recentemente, IFI em células HEp-2 tem sido substituído, em alguns laboratórios com imunoensaios específicos para o antigénio e os métodos de multiplex. Devido a preocupações com resultados falsos negativos ea falta de transparência para os médicos, o Colégio Americano de Reumatologia formado um Grupo de Trabalho que concluiu que IFI utilizando células HEp-2 deve ser o &quot;padrão ouro&quot; para a ANA triagem 1. Devido à natureza subjetiva de triagem ANA, a qualidade das células HEp-2 éTegral de relatórios precisos e confiante dos resultados. A presença de um elevado número de células mitóticas, a morfologia óptima de células, confluência suficiente, e a expressão de antigénios relevantes são particularmente importantes. Reconhecimento de padrões IIF serve como uma importante ferramenta para auxiliar no diagnóstico do paciente. Compreender o significado de vários padrões permite que os médicos e pessoal de laboratório para realizar o teste apropriado de acompanhamento para confirmar o diagnóstico. Por exemplo, homogénea padrão ANA pode ocorrer na presença de anti-dsADN ou anticorpos de cromatina, e podem estar associados com lúpus eritematoso sistémico (LES) 3. Do outro lado, foi recentemente descrito que o assim chamado padrão pontilhado fino denso (DFS) que é frequentemente observado em até 12% de amostras de rotina, tem sido principalmente associada com anticorpos anti-DFS70. Esses auto-anticorpos, quando encontrado em isolamento (sem outra doença específica ANA) não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas &lt;sup&gt; 4-9. Assim, o teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis ​​economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente. Dado que IIF é a primeira metodologia de triagem linha para detectar auto-anticorpos, é fundamental que o usuário entenda como a selecção de reagentes e substratos de tecido podem afetar os resultados. Uma vez que a técnica de IFI é inerentemente subjectiva, é importante que os reagentes utilizados fornecer os resultados da mais alta qualidade. Este objetivo deste protocolo de vídeo é familiarizar o usuário com os passos corretos necessários para executar o método IIF, os padrões comuns associados com a ANA, e introduzir novos avanços que podem agilizar o fluxo de trabalho de laboratório e padronizar resultados.

<table><tbody><tr><td>NOVA Lite HEp-2 IgG (conjugado DAPI)</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>708102</td><td></td></tr><tr><td>NOVA View Instrument</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>NV2000</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK010</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation Licença</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK001</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de código de barras</td><td>INOVA</td><td>Diagnostics LINK019</td><td></td></tr></tbody></table>

anti-nuclear antibody triagem usando células hep-2

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

O Colégio Americano de Reumatologia declaração de posição sobre o teste ANA prevê o uso de IIF como o método padrão-ouro para ANA triagem 1. Embora IIF é um teste de rastreio excelente nas mãos de especialistas, as dificuldades técnicas de processamento e leitura IIF desliza - como o processamento intensivo trabalho de slides, leitura manual, a necessidade de experiente, tecnólogos formados eo uso de quarto escuro - tornar o método IIF difíceis de encaixar no fluxo de trabalho de, laboratórios automatizados modernos. O primeiro e fundamental passo para a alta qualidade de triagem ANA é o processamento de slides cuidado. Este procedimento é trabalhoso e requer uma compreensão completa do processo, bem como a atenção aos detalhes e experiência. A leitura das lâminas é realizada por meio de microscopia de fluorescência em salas escuras, e é feito por técnicos treinados, que estão familiarizados com os vários padrões, no contexto do ciclo celulare a morfologia de interfase e células em divisão. Desde que IIF é a primeira ferramenta de triagem linha para SARD, compreender as etapas para executar corretamente essa técnica é fundamental. Recentemente, sistemas de imagem digitais têm sido desenvolvidos para a leitura automática das lâminas de IFI. Estes sistemas, como o NOVA Ver Automated microscópio fluorescente, são projetados para simplificar o fluxo de trabalho IIF rotina. NOVA Ver adquire e armazena imagens digitais de alta resolução dos poços, separando assim a aquisição de imagem a partir de interpretação; imagens são visualizadas uma interpretadas em monitores de computador de alta resolução. Ele armazena as imagens para referência futura e apóia a interpretação do operador, fornecendo dados de intensidade de luz fluorescente nas imagens. Também categoriza preliminarmente resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões para as amostras positivas. Em resumo, o que elimina a necessidade de câmara escura, e automatiza e simplifica o readi IIFng / interpretação do fluxo de trabalho. Mais importante, ele aumenta a consistência entre leitores e leituras. Além disso, com o uso de lâminas com código de barras, os erros de transcrição, são eliminados pelo fornecimento de rastreabilidade da amostra e identificação positiva do paciente. Isto resulta num aumento da integridade e da segurança dos dados do paciente. O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o procedimento IIF, incluindo processamento de slide, identificação de padrões comuns IIF, ea introdução de novos avanços para simplificar e harmonizar esta técnica.

Ao avaliar os resultados da coloração de células de HEp-2, cinco padrões nucleares são mais comumente relatados: homogênea, salpicadas centrômero, nucleolar e pontos nucleares. Estes padrões são o resultado da ligação de auto-anticorpos para componentes específicos do núcleo. Embora o teste de ANA é específico para estruturas nucleares, padrões citoplasmáticos associados à auto-anticorpos contra estruturas citoplasmáticas também podem ser observadas. Em alguns casos, vários auto-anticorpos podem estar presentes em uma amostra, e a imagem pode aparecer como um padrão misto. Há outros, menos freqüentemente observada, e muitas vezes padrões específicos do ciclo celular que podem ser detectados pelo método IIF; mais recentemente, um chamado padrão pontilhado fino denso, com significância clínica especial tem sido descrita em algum soros positivos ANA. Homogêneo Padrão Para identificar um padrão homogêneo, a varredura do bem e identificar mitótico ou divisóriacélulas. A cromatina condensada das células mitóticas (Figura 2, laranja seta) exibe fluorescência sólida, uniforme, o que é muitas vezes mais pronunciado do que na célula de repouso nuclei.In o padrão homogéneo, a células em repouso uniforme exposição, fluorescência difusa de todo o núcleo (Fig. 2, seta branca). Este padrão característico é muitas vezes o resultado de anticorpos anti-dsDNA 10. Padrão pontilhado No padrão salpicado grosseira, as células mitóticas não mostram coloração das regiões cromossómicas condensados ​​(Figura 3, laranja seta). As células em repouso exibem fluorescência granulado em todo o núcleo. O salpicar nuclear pode ser definida como grosso ou fino. O padrão salpicar Grosso é muitas vezes o resultado de anti-Sm e anti-RNP 11. No padrão pontilhado fino, as células em repouso mostrar salpicar multa ou difuso ao longo dos núcleos, geralmente em uniforme dISTRIBUIÇÃO (Figura 4, seta branca). O padrão pontilhado fino é muitas vezes o resultado de anti-SSAand anti-SSB 12. Densa Padrão Belas Speckled Sabe-se agora que o padrão pontilhado fino denso (DFS) é comum nos testes de rotina, e tanto quanto 12% de amostras positivas para autoanticorpos são anti-DFS70. No entanto, esses auto-anticorpos, quando encontrados isoladamente, não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas 4 -6. Estes anticorpos são prevalentes em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doenças não relacionadas com SARD 6 de rolamento. O teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis ​​economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente. Como o padrão DFS é difícil identificar e ANA positividade pode causar ansiedade para pacientes e médicos, é altamente recomendável realizar um teste confirmatório após identificação<html> car um padrão sugestivo de anticorpos anti-DFS70 para esclarecer o significado clínico da ANA positivty 5,6. Neste padrão, as células mitóticas (Figura 5, laranja de setas) apresenta coloração salpicada positivo da cromatina metáfase, enquanto descansa os núcleos das células (Figura 5, seta branca) apresentam manchas finas uniformemente distribuídas por todo o núcleo. Centromere Padrão Para identificar o padrão de centrômero, navegue pelos poços e identificar mitótico ou células em divisão. Em células mitóticas (Figura 6, seta laranja), essas manchas tornam-se intimamente associado discretos no que é muitas vezes descrito como um &quot;bar metaphase&quot;. No padrão centrómero, descansando células (Figura 6, seta branca) mostram aproximadamente 40-60 manchas discretas distribuídas por todo o núcleo. O padrão de centrómero é o resultado de anti-CENP A, B, C de anticorpos 13. passo &quot;&gt; Nucleolar Padrão Alguns padrões de nucléolos estão associados com a coloração citoplasmática difusa em células mitóticas (Figura 7, laranja seta) e região cromossómica negativo, enquanto que outros padrões nucleolear exibir coloração positiva da região cromossómica. O padrão nucleolar está associado com a coloração homogénea ou salpicado dos nucléolos (Figura 7, seta branca), juntamente com salpicado fraco ou coloração homogénea do nucleoplasma. Estes padrões estão associados a anti-RNA polimerase III, anti-fibrilarina, anti-Th/To e anti-PM/Scl anticorpos 14,15. Dot Nuclear Padrão O padrão de ponto nuclear está associada com as células mitóticas metafase negativos (Figura 8, laranja de seta) e com poucas manchas discretas nos núcleos de células de repouso (Figura 8, seta branca). Este padrão característico é muitas vezes o resultado de sp-100, PML, ou auto-anticorpos p80 Colin. Estes anticorpos são tão<html> associada com cirrose biliar primária e hepatite auto-imune 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figura 1 controle negativo (esquerda): células apresentam baixo nível de fluorescência não específica, mas nenhuma marcação nuclear específica de controle positivo (direita):. Células apresentam fluorescência nuclear maçã verde. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Padrão Figura 2. Homogênea. Células mitóticas (orangearrow) mostram fluorescência sólida. Células em repouso mostrar mesmo, coloração difusa (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Grosso salpicado padrão. Células mitóticas (seta laranja) mostram coloração negativa. Células em repouso mostram uma mancha salpicado distinta (seta branca). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Padrão pontilhado fino. Células mitóticas (seta cor de laranja) mostram coloração negativa. Células em repouso mostram uma coloração pontilhado fino distinta (seta branca). <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Padrão pontilhado fino denso. Células mitóticas (seta cor de laranja) mostram uma coloração sólida granular bem. Células em repouso mostram uma muito fina, salpicado mancha difusa (whitearrow). Padrão Figura 6. Centromere. Células mitóticas (orangearrow) mostram uniforme, manchas discretas. Descansando células (whitearrow) mostra 40-60 manchas discretas por núcleo celular. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Padrão Figura 7. Nucleolar. Células mitóticas (orangearrow) aparecem como grandes aglomerados de coloração granular. Descansando célula nucleishows fluorescência no nucléolo (whitearrow). <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Padrão Figura 8. Ponto Nuclear. Células mitóticas (orangearrow) aparecem negativo. Células em repouso mostrar alguns DISCRmanchas ete no núcleo (whitearrow). Além disso, o padrão de pontos nucelar pode coexistir com coloração citoplasmática associada com auto-anticorpos contra antígenos mitocondriais (seta vermelha).

Imunofluorescência indireta (IFI) ensaios têm sido tradicionalmente utilizados para a detecção de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ajudar no diagnóstico de doenças reumáticas sistémicas auto-imunes (SARD). Este protocolo demonstra como executar efetivamente a técnica IIF para detectar com precisão essas auto-anticorpos.

Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar um ensaio de imunofluorescência indireta para triagem de anticorpos antinucleares. Isso é realizado incubando soro de paciente com lâminas de substrato hep-2. O soro de paciente não ligado é removido por lavagem, e os autoanticorpos ligados são então incubados com um conjugado específico marcado com fluoresceína, seguido pela remoção por lavagem do reagente não ligado.Quando visualizadas por meio de um microscópio de fluorescência, amostras positivas para autoanticorpos exibirão uma fluorescência verde-maçã correspondente às áreas da célula ou do núcleo onde os autoanticorpos se ligaram, em um padrão de fluorescência indicativo da presença do antígeno. Em última análise, a detecção de ARNA pode ser utilizada para auxiliar no diagnóstico de doenças do tecido conjuntivo. A principal vantagem do método de imunofluorescência indireta em comparação com outros métodos, como o ELISA em fase sólida, é que o substrato de células Hep-2 contém mais de 100 antígenos expressos em sua configuração nativa.Isso permite a identificação de quase todos os anticorpos O clinicamente relevantes, o que não é possível com técnicas de fase sólida, já que o método indireto de imunofluorescência é uma técnica muito especializada. Indivíduos novos nesse método precisam de tempo e prática para se tornarem proficientes no procedimento de processamento das lâminas. Interpretar as imagens microscópicas e aprender a identificar os padrões relevantes também é uma habilidade que exige tempo para ser dominada.Com os reagentes e ferramentas adequados, os resultados são mais consistentes e mais fáceis de interpretar. O procedimento será demonstrado por Cassandra Bryant, uma tecnologista do Laboratório de Desenvolvimento de Ensaios de Imunofluorescência. Retire os reagentes da embalagem e deixe cada item atingir a temperatura ambiente, prepare os reagentes e dilua o soro do paciente de acordo com as instruções. As lâminas possuem código de barras e podem ser facilmente integradas a sistemas automatizados.Este procedimento ilustra o processamento manual de lâminas. Laboratórios de alto rendimento, no entanto, podem optar por equipamentos automatizados de processamento de lâminas com capacidades de leitura de códigos de barras. Os instrumentos Inova são conectados por meio de uma rede inteligente centralizada que fornece controle sobre os resultados do fluxo de trabalho e a geração de relatórios.Para IFA. Isso resulta na identificação positiva do paciente mediante o processamento e eliminação de erros de transcrição e relacionados. Dispense uma gota do controle positivo e uma gota do controle negativo sobre a lâmina apropriada.Pipete de 20 a 25 microlitros de soro diluído do paciente nos poços restantes. Processe uma lâmina por vez. Coloque a lâmina em um recipiente para coloração com uma toalha de papel úmida no fundo, cubra o recipiente e incube a lâmina por 30 minutos.As condições úmidas impedirão que o substrato seque, o que poderia resultar em coloração artefactual. Durante este período de incubação, os anticorpos antinucleares no soro do paciente se ligarão aos antígenos das células que estão fixadas em cada poço. Após o período de incubação, remova o soro com um fluxo suave de tampão de lavagem para evitar danos ao substrato.Incline ligeiramente a lâmina de modo que o fluxo não incida diretamente sobre o substrato. Essa orientação das lâminas também ajudará a prevenir a contaminação cruzada entre as amostras nos poços. Remova o excesso de tampão de lavagem batendo levemente e coloque a lâmina em um frasco Copeland contendo tampão de lavagem.O tempo de incubação para a etapa de lavagem deve ser de aproximadamente cinco minutos. Remova as lâminas do tampão de lavagem e bata levemente. Para remover o excesso de tampão de lavagem, aplique uma gota de conjugado fluorescente em cada poço.Para um teste de AN, recomenda-se o uso de um conjugado específico para a fração FC da IgG. Incube as lâminas por 30 minutos em recipiente umidificado e certifique-se de substituir a tampa de coloração. O conjugado é sensível à luz e a tampa protegerá as lâminas da exposição à luz.Durante este período de incubação, o conjugado se ligará aos anticorpos anti-nucleares do paciente que se ligaram aos antígenos celulares. Essa ligação do conjugado resulta na presença de fluorescência nas cavidades após a incubação. Lave a lâmina com o tampão de lavagem.Como antes, coloque uma lamínula sobre uma toalha de papel e aplique o meio de montagem em uma linha contínua na borda inferior da lamínula. Retire cada lâmina do tampão de lavagem e toque levemente na lâmina. Para remover o excesso de tampão de lavagem, encoste a borda inferior da lâmina na borda da lamínula.Abaixe suavemente a lâmina sobre a lamínula de forma que o meio de montagem na lamínula flua até a borda superior da lâmina sem formar bolhas de ar. Incluir a quantidade ideal de meio de montagem é uma técnica que exige prática para obter uma visualização perfeita. Observe as lâminas com microscópio de fluorescência em um ambiente escuro e realize a varredura de todo o poço utilizando uma objetiva de 20x ou 25x. Para avaliar a distribuição celular e a uniformidade da fluorescência, mude para uma objetiva de 40x.Para fazer a interpretação final quanto à positividade e ao padrão, examine os controles positivo e negativo. O controle negativo pode não parecer completamente escuro, mas geralmente exibirá fluorescência inespecífica de baixo nível. O controle positivo exibirá uma fluorescência verde-esmeralda intensa no núcleo.A positividade pode ser classificada utilizando uma escala de reatividade que varia de um mais a quatro mais. Além da interpretação manual, lâminas podem ser carregadas e escaneadas pelo microscópio de fluorescência automatizado. Nenhuma sala escura é necessária.Após criar um projeto selecionando o tipo apropriado de lâmina, o instrumento adquire e armazena imagens digitais de alta resolução de células em cada poço. Além disso, o Nova View mede a intensidade da luz fluorescente e classifica os resultados como positivos ou negativos, fornecendo reconhecimento de padrão para amostras positivas. As imagens são visualizadas pelo operador em um monitor de computador de alta resolução, permitindo a interpretação final, revisão e confirmação do Nova View.Relatórios de resultados podem ser gerados com base em resultados confirmados. A ligação de autoanticorpos às estruturas proteicas constituintes do núcleo resulta em cinco padrões nucleares principais, incluindo homogêneo, pontilhado, centromérico, nucleolar e ponto nuclear. Para identificar um padrão homogêneo como o mostrado aqui, identifique células mitóticas ou em divisão.As células em mitose apresentam fluorescência uniforme e intensa, que muitas vezes é mais acentuada do que nas células em repouso. Os núcleos das células em repouso devem ser uniformes, com coloração difusa. Esse padrão característico é provavelmente o resultado de autoanticorpos contra o DNA de dupla fita.Uma característica fundamental do padrão pontilhado é a aparência de fenda de moedas nas células mitóticas em metáfase. A região cromossômica dessas células é negativa. As células em repouso exibem um padrão pontilhado por todo o núcleo.O padrão em manchas pode ser definido como grosseiro ou fino. O padrão grosseiro é resultado de autoanticorpos contra SM e RNP. O padrão fino pode ser causado por autoanticorpos contra S-S-A-S-S-B, bem como contra a RNA polimerase.O padrão DFS é denominado pontilhado denso e fino, e é indicativo de autoanticorpos contra DFS 70. Células em mitose apresentam coloração pontilhada, enquanto células em repouso exibem pontilhados finos uniformemente distribuídos por todo o núcleo. Nestes casos, devem ser realizados testes confirmatórios, pois os autoanticorpos anti-DFS 70 são prevalentes em indivíduos saudáveis em comparação com pacientes que possuem doenças do tecido conjuntivo.Para identificar o padrão de centrômero, examine as cavidades e identifique células mitóticas ou em divisão. As células em divisão apresentam numerosos pontos discretos em estreita associação uns com os outros, frequentemente denominados barra de metáfase. As células em repouso mostram aproximadamente de 40 a 60 pontos discretos distribuídos por todo o núcleo.O padrão de centrômero está associado a autoanticorpos contra proteínas do centrômero com o padrão nucleolar. A coloração da região cromossômica em células mitóticas é variável. O padrão nucleolar está associado à coloração homogênea ou pontilhada dos núcleos, juntamente com coloração fraca, pontilhada ou homogênea do nucleoplasma dos núcleos de células em repouso.Esse padrão está associado a autoanticorpos contra a polimerase III de RNA, fibrilina e anticorpos PM-Scl. O padrão de pontos nucleares está relacionado a células metafásicas negativas, células mitóticas e poucos pontos discretos nos núcleos de células em repouso. Esse padrão característico é frequentemente resultado de autoanticorpos contra SP-100, PML ou colina P-80.Esses anticorpos estão associados à cirrose biliar primária e hepatite autoimune. Na imagem apresentada, o padrão de pontos nucleares exibe coloração citoplasmática devido a autoanticorpos contra antígenos mitocondriais. A detecção de anticorpos antinucleares e o reconhecimento de padrões servem como uma ferramenta importante para auxiliar no diagnóstico do paciente.Compreender a importância de vários padrões permite que clínicos e profissionais de laboratório realizem testes complementares apropriados. Os fatores mais importantes para identificar corretamente os padrões de anticorpos antinucleares são a seleção de um substrato celular de alta qualidade e o processamento das lâminas com técnica consistente e adequada. A leitura das lâminas é tradicionalmente realizada por microscopia de fluorescência em salas escuras e é feita por tecnologistas treinados, familiarizados com os diversos padrões no contexto do ciclo celular e da morfologia celular.Nos últimos anos, foram desenvolvidos sistemas de imagem digital para a leitura automatizada de lâminas, os quais automatizam o fluxo de trabalho e aumentam a consistência na leitura e interpretação. Além disso, com o uso de lâminas codificadas com códigos de barras, a rastreabilidade das amostras ao longo do processo elimina erros potenciais de transcrição e aumenta a integridade dos dados e a segurança do paciente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar cada etapa do procedimento de imunofluorescência indireta e de como identificar os padrões de anticorpos antinucleares clinicamente relevantes.

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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