Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar um ensaio de imunofluorescência indireta para triagem de anticorpos antinucleares. Isso é realizado incubando soro de paciente com lâminas de substrato hep-2. O soro de paciente não ligado é removido por lavagem, e os autoanticorpos ligados são então incubados com um conjugado específico marcado com fluoresceína, seguido pela remoção por lavagem do reagente não ligado.

Quando visualizadas por meio de um microscópio de fluorescência, amostras positivas para autoanticorpos exibirão uma fluorescência verde-maçã correspondente às áreas da célula ou do núcleo onde os autoanticorpos se ligaram, em um padrão de fluorescência indicativo da presença do antígeno. Em última análise, a detecção de ARNA pode ser utilizada para auxiliar no diagnóstico de doenças do tecido conjuntivo. A principal vantagem do método de imunofluorescência indireta em comparação com outros métodos, como o ELISA em fase sólida, é que o substrato de células Hep-2 contém mais de 100 antígenos expressos em sua configuração nativa.

Isso permite a identificação de quase todos os anticorpos O clinicamente relevantes, o que não é possível com técnicas de fase sólida, já que o método indireto de imunofluorescência é uma técnica muito especializada. Indivíduos novos nesse método precisam de tempo e prática para se tornarem proficientes no procedimento de processamento das lâminas. Interpretar as imagens microscópicas e aprender a identificar os padrões relevantes também é uma habilidade que exige tempo para ser dominada.

Com os reagentes e ferramentas adequados, os resultados são mais consistentes e mais fáceis de interpretar. O procedimento será demonstrado por Cassandra Bryant, uma tecnologista do Laboratório de Desenvolvimento de Ensaios de Imunofluorescência. Retire os reagentes da embalagem e deixe cada item atingir a temperatura ambiente, prepare os reagentes e dilua o soro do paciente de acordo com as instruções. As lâminas possuem código de barras e podem ser facilmente integradas a sistemas automatizados.

Este procedimento ilustra o processamento manual de lâminas. Laboratórios de alto rendimento, no entanto, podem optar por equipamentos automatizados de processamento de lâminas com capacidades de leitura de códigos de barras. Os instrumentos Inova são conectados por meio de uma rede inteligente centralizada que fornece controle sobre os resultados do fluxo de trabalho e a geração de relatórios.

Para IFA. Isso resulta na identificação positiva do paciente mediante o processamento e eliminação de erros de transcrição e relacionados. Dispense uma gota do controle positivo e uma gota do controle negativo sobre a lâmina apropriada.

Pipete de 20 a 25 microlitros de soro diluído do paciente nos poços restantes. Processe uma lâmina por vez. Coloque a lâmina em um recipiente para coloração com uma toalha de papel úmida no fundo, cubra o recipiente e incube a lâmina por 30 minutos.

As condições úmidas impedirão que o substrato seque, o que poderia resultar em coloração artefactual. Durante este período de incubação, os anticorpos antinucleares no soro do paciente se ligarão aos antígenos das células que estão fixadas em cada poço. Após o período de incubação, remova o soro com um fluxo suave de tampão de lavagem para evitar danos ao substrato.

Incline ligeiramente a lâmina de modo que o fluxo não incida diretamente sobre o substrato. Essa orientação das lâminas também ajudará a prevenir a contaminação cruzada entre as amostras nos poços. Remova o excesso de tampão de lavagem batendo levemente e coloque a lâmina em um frasco Copeland contendo tampão de lavagem.

O tempo de incubação para a etapa de lavagem deve ser de aproximadamente cinco minutos. Remova as lâminas do tampão de lavagem e bata levemente. Para remover o excesso de tampão de lavagem, aplique uma gota de conjugado fluorescente em cada poço.

Para um teste de AN, recomenda-se o uso de um conjugado específico para a fração FC da IgG. Incube as lâminas por 30 minutos em recipiente umidificado e certifique-se de substituir a tampa de coloração. O conjugado é sensível à luz e a tampa protegerá as lâminas da exposição à luz.

Durante este período de incubação, o conjugado se ligará aos anticorpos anti-nucleares do paciente que se ligaram aos antígenos celulares. Essa ligação do conjugado resulta na presença de fluorescência nas cavidades após a incubação. Lave a lâmina com o tampão de lavagem.

Como antes, coloque uma lamínula sobre uma toalha de papel e aplique o meio de montagem em uma linha contínua na borda inferior da lamínula. Retire cada lâmina do tampão de lavagem e toque levemente na lâmina. Para remover o excesso de tampão de lavagem, encoste a borda inferior da lâmina na borda da lamínula.

Abaixe suavemente a lâmina sobre a lamínula de forma que o meio de montagem na lamínula flua até a borda superior da lâmina sem formar bolhas de ar. Incluir a quantidade ideal de meio de montagem é uma técnica que exige prática para obter uma visualização perfeita. Observe as lâminas com microscópio de fluorescência em um ambiente escuro e realize a varredura de todo o poço utilizando uma objetiva de 20x ou 25x. Para avaliar a distribuição celular e a uniformidade da fluorescência, mude para uma objetiva de 40x.

Para fazer a interpretação final quanto à positividade e ao padrão, examine os controles positivo e negativo. O controle negativo pode não parecer completamente escuro, mas geralmente exibirá fluorescência inespecífica de baixo nível. O controle positivo exibirá uma fluorescência verde-esmeralda intensa no núcleo.

A positividade pode ser classificada utilizando uma escala de reatividade que varia de um mais a quatro mais. Além da interpretação manual, lâminas podem ser carregadas e escaneadas pelo microscópio de fluorescência automatizado. Nenhuma sala escura é necessária.

Após criar um projeto selecionando o tipo apropriado de lâmina, o instrumento adquire e armazena imagens digitais de alta resolução de células em cada poço. Além disso, o Nova View mede a intensidade da luz fluorescente e classifica os resultados como positivos ou negativos, fornecendo reconhecimento de padrão para amostras positivas. As imagens são visualizadas pelo operador em um monitor de computador de alta resolução, permitindo a interpretação final, revisão e confirmação do Nova View.

Relatórios de resultados podem ser gerados com base em resultados confirmados. A ligação de autoanticorpos às estruturas proteicas constituintes do núcleo resulta em cinco padrões nucleares principais, incluindo homogêneo, pontilhado, centromérico, nucleolar e ponto nuclear. Para identificar um padrão homogêneo como o mostrado aqui, identifique células mitóticas ou em divisão.

As células em mitose apresentam fluorescência uniforme e intensa, que muitas vezes é mais acentuada do que nas células em repouso. Os núcleos das células em repouso devem ser uniformes, com coloração difusa. Esse padrão característico é provavelmente o resultado de autoanticorpos contra o DNA de dupla fita.

Uma característica fundamental do padrão pontilhado é a aparência de fenda de moedas nas células mitóticas em metáfase. A região cromossômica dessas células é negativa. As células em repouso exibem um padrão pontilhado por todo o núcleo.

O padrão em manchas pode ser definido como grosseiro ou fino. O padrão grosseiro é resultado de autoanticorpos contra SM e RNP. O padrão fino pode ser causado por autoanticorpos contra S-S-A-S-S-B, bem como contra a RNA polimerase.

O padrão DFS é denominado pontilhado denso e fino, e é indicativo de autoanticorpos contra DFS 70. Células em mitose apresentam coloração pontilhada, enquanto células em repouso exibem pontilhados finos uniformemente distribuídos por todo o núcleo. Nestes casos, devem ser realizados testes confirmatórios, pois os autoanticorpos anti-DFS 70 são prevalentes em indivíduos saudáveis em comparação com pacientes que possuem doenças do tecido conjuntivo.

Para identificar o padrão de centrômero, examine as cavidades e identifique células mitóticas ou em divisão. As células em divisão apresentam numerosos pontos discretos em estreita associação uns com os outros, frequentemente denominados barra de metáfase. As células em repouso mostram aproximadamente de 40 a 60 pontos discretos distribuídos por todo o núcleo.

O padrão de centrômero está associado a autoanticorpos contra proteínas do centrômero com o padrão nucleolar. A coloração da região cromossômica em células mitóticas é variável. O padrão nucleolar está associado à coloração homogênea ou pontilhada dos núcleos, juntamente com coloração fraca, pontilhada ou homogênea do nucleoplasma dos núcleos de células em repouso.

Esse padrão está associado a autoanticorpos contra a polimerase III de RNA, fibrilina e anticorpos PM-Scl. O padrão de pontos nucleares está relacionado a células metafásicas negativas, células mitóticas e poucos pontos discretos nos núcleos de células em repouso. Esse padrão característico é frequentemente resultado de autoanticorpos contra SP-100, PML ou colina P-80.

Esses anticorpos estão associados à cirrose biliar primária e hepatite autoimune. Na imagem apresentada, o padrão de pontos nucleares exibe coloração citoplasmática devido a autoanticorpos contra antígenos mitocondriais. A detecção de anticorpos antinucleares e o reconhecimento de padrões servem como uma ferramenta importante para auxiliar no diagnóstico do paciente.

Compreender a importância de vários padrões permite que clínicos e profissionais de laboratório realizem testes complementares apropriados. Os fatores mais importantes para identificar corretamente os padrões de anticorpos antinucleares são a seleção de um substrato celular de alta qualidade e o processamento das lâminas com técnica consistente e adequada. A leitura das lâminas é tradicionalmente realizada por microscopia de fluorescência em salas escuras e é feita por tecnologistas treinados, familiarizados com os diversos padrões no contexto do ciclo celular e da morfologia celular.

Nos últimos anos, foram desenvolvidos sistemas de imagem digital para a leitura automatizada de lâminas, os quais automatizam o fluxo de trabalho e aumentam a consistência na leitura e interpretação. Além disso, com o uso de lâminas codificadas com códigos de barras, a rastreabilidade das amostras ao longo do processo elimina erros potenciais de transcrição e aumenta a integridade dos dados e a segurança do paciente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar cada etapa do procedimento de imunofluorescência indireta e de como identificar os padrões de anticorpos antinucleares clinicamente relevantes.