Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey
19 de dezembro de 2013
As medições eletrônicas de von Frey são uma alternativa eficaz e aprimorada aos filamentos de von Frey clássicos, pois permitem a medição rápida e precisa das mudanças nos limiares de retirada mecânica de roedores para estímulos de pressão aplicados continuamente antes e depois de um evento inflamatório.
O objetivo geral deste procedimento é medir respostas não suscetíveis à pressão mecânica na pata traseira de camundongos. Isso é realizado primeiramente colocando os animais sobre um piso de malha metálica e permitindo que se habituem quando estiverem prontos. Uma ponta de polipropileno é aplicada na região inferior da pata traseira, e a pressão é gradualmente aumentada.
Quando a resposta comportamental apropriada é observada, o estímulo é retirado. Após a coleta dos valores basais, os animais recebem uma intervenção experimental antes de novos testes. Por fim, as alterações nos limiares de retirada da pata traseira são comparadas entre os grupos de tratamento para determinar o efeito de um tratamento específico sobre as mudanças na sensibilidade tátil à pressão.
A dor é um componente fundamental da inflamação. É importante medir e caracterizar a dor em diferentes contextos. Este método relativamente simples de avaliação da dor pode ser aplicado a muitos modelos diferentes de inflamação.
Quem demonstrará o procedimento será Tiana ov, uma técnica de pesquisa do meu laboratório, Madison Mack, que participou deste trabalho como aluna de graduação, e Akila Sykes, atualmente aluna de graduação no meu laboratório. Começamos configurando o aparelho de teste para facilitar o acesso às patas traseiras.
Coloque câmaras individuais sobre um piso de malha. O piso de malha deve estar a uma altura confortável e sobre uma superfície estável. Em seguida, coloque o aparelho eletrônico Von Frey sobre a bancada.
Certifique-se de que a sonda e o cabo estão adequadamente conectados à unidade de exibição e ligue o instrumento no modo de configuração. Ajuste a leitura para zero e coloque suavemente o peso de teste fornecido sobre o cone da sonda Von Frey. Registre a leitura e repita este procedimento novamente ao final dos testes; se houver uma discrepância entre os dois valores, o equipamento poderá precisar ser recalibrado.
Selecione uma ponteira de polipropileno do tamanho apropriado para o tecido a ser testado. Ponteiras rígidas funcionam bem para o tecido da pata traseira, menos sensível e mais resistente. Monte suavemente a ponteira sobre o cone da sonda.
Em seguida, mude do modo de configuração para o modo de operação. Isso exibirá a pressão máxima aplicada quando a sonda for retratada. Dois pesquisadores são necessários para medir os limiares de retirada da pata traseira.
Um operador para manusear o aparelho e realizar as medições, e outro para registrar essas medições, a fim de reduzir o viés. O pesquisador que operar o anesthesi TER deve estar cegado quanto aos tratamentos, bem como aos valores registrados de limiar de retirada. Além disso, para garantir consistência entre as medições, a mesma pessoa deve registrar todos os valores basais e de limiar de retirada.
48 horas antes do tratamento, o primeiro conjunto de medições de linha de base é registrado. Coloque material absorvente abaixo do suporte para coletar os resíduos excretados. Após acoplar a ponteira e zerar a sonda, o pesquisador que registra as medições deve colocar os camundongos em câmaras individuais.
Cubra as câmaras com tampas perfuradas e coloque um objeto pesado em cima. Para impedir que os camundongos escapem, permita que eles se aclimatizem à câmara por 15 minutos antes de prosseguir. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldade com a aplicação gradual de pressão crescente e com a obtenção de consistência interna em suas próprias medições; portanto, a prática é essencial para gerar resultados reprodutíveis.
Quando pronto, use as duas mãos para elevar lentamente a sonda e estimular a planta do pé de uma das patas traseiras, esquerda ou direita. Aumente a pressão gradualmente até que um comportamento nociceptivo seja observado. Eles são identificados pela retração da pata traseira, lambida da pata traseira ou salto da pata.
Instrua o outro pesquisador a registrar a pressão que provocou o comportamento observado. Durante a medição, é útil encorajar o camundongo a permanecer imóvel colocando um alimento palatável logo fora da câmara ou fazendo um ruído suave, como uma leve batida, antes de realizar a medição. Prossiga para o próximo camundongo até que cada um tenha sido testado uma vez e repita este procedimento mais quatro vezes.
Após coletar cinco valores basais, obtenha uma média para cada camundongo. Repita as medidas basais 24 horas depois e utilize esses valores para calcular outra média. Para garantir que todos os camundongos apresentem respostas basais consistentes, exclua animais com uma média do limiar basal de retirada inferior a 3,5 gramas ou cujos limiares basais difiram em dois gramas ou mais.
Por fim, distribua os camundongos em grupos de tratamento separados de forma que a média da linha de base de retirada de cada grupo seja a mais semelhante possível. Aqui, os limiares de retirada foram medidos após a administração do veneno na pata traseira, ROS raca. Controle tratado com solução salina. Os camundongos mostraram pouca alteração em comparação com a linha de base em todos os momentos.
As respostas nociceptivas nos pontos testados em camundongos tratados foram claramente mantidas até seis horas. Além disso, o edema tecidual, característico da inflamação, era evidente nas patas traseiras tratadas com veneno, mas não com solução salina. As alterações induzidas pelo veneno na sensibilidade tátil foram acompanhadas por uma entrada de neutrófilos quase mil vezes maior.
Em comparação com as patas traseiras tratadas com soro fisiológico, nas quais os mastócitos plantares no tecido da pata traseira estavam amplamente intactos ou apresentavam degranulação leve, observou-se nas patas traseiras acasaladas de 15 a 20% de degranulação moderada e acentuada dos mastócitos. Esta técnica pode ser adaptada para avaliar a sensibilidade mecânica ou tátil em uma ampla variedade de tecidos além da pata traseira.
Portanto, esta técnica pode ser incorporada em muitos modelos diferentes de roedores para inflamação e dor.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para medir respostas nociceptivas à pressão mecânica na pata traseira de camundongos utilizando medições eletrônicas de von Frey. Esta técnica permite uma avaliação rápida e precisa das alterações nos limiares mecânicos de retirada antes e após intervenções inflamatórias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Avaliação Comportamental
- Modelos de Inflamação
Contexto
- A medição da dor é fundamental para compreender a inflamação.
- O aparelho eletrônico de von Frey oferece vantagens em relação aos métodos clássicos.
- A medição precisa dos limiares de retirada é essencial para a reprodutibilidade.
- Este método pode ser adaptado para diversos modelos de roedores.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a sensibilidade mecânica em resposta a estímulos de pressão.
- Avaliar os efeitos de tratamentos sobre o comportamento nociceptivo.
- Estabelecer um método confiável para avaliação da dor em pesquisas.
Métodos Utilizados
- Habituação de camundongos em um piso de malha metálica.
- Aplicação gradual de pressão utilizando uma ponteira de polipropileno.
- Registro dos limiares de retirada por dois investigadores cegos.
- Comparação das medidas basais e pós-tratamento.
Resultados Principais
- Foram observadas alterações significativas nos limiares de retirada após o tratamento.
- A inflamação foi caracterizada por edema tecidual e influxo de neutrófilos.
- A desgranulação de mastócitos variou entre os grupos tratados.
- O método demonstrou adaptabilidade para diversos tecidos.
Conclusões
- O método eletrônico de von Frey é eficaz para avaliar a dor em roedores.
- Essa técnica pode aprimorar a compreensão dos mecanismos da dor inflamatória.
- Ele fornece uma base para estudos futuros sobre dor e eficácia de tratamentos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação das alterações na sensibilidade tátil em modelos de roedores fornece dados essenciais na fase inicial para a validação de alvos analgésicos e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de terapias para dor. O método eletrônico de von Frey permite a medição rápida e quantitativa dos limiares de retirada mecânica, apoiando a avaliação pré-clínica reprodutível de modelos de dor inflamatória e neuropática. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva no engajamento do alvo e na eficácia do tratamento antes de avançar compostos para estudos de fases posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a vias nociceptivas e mecanismos de modulação da dor.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao fornecer leituras quantificáveis e controladas internamente da sensibilidade tátil entre grupos de tratamento.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios por meio da comparação objetiva dos limiares de retirada basal e pós-intervenção para avaliar a modulação do alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo medições padronizadas de sensibilidade tátil basal.
- Reprodutibilidade: Permite medições consistentes e repetidas em curtos intervalos de tempo, apoiando a padronização do ensaio e a comparabilidade entre grupos.
- Escalabilidade: Permite múltiplas medições por sujeito, aumentando a produtividade e a confiabilidade para campanhas de triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a alodinia mecânica induzida por inflamação, alinhando-se aos fenótipos clínicos de dor em condições inflamatórias e neuropáticas.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas e fluxos de trabalho pré-clínicos ao fornecer desfechos quantificáveis de sensibilidade à dor mecanicamente relevantes.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar com base em alterações reprodutíveis nos limiares de retirada após intervenções experimentais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método eletrônico de von Frey insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para compostos moduladores da dor.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao medir respostas nociceptivas à pressão mecânica como leitura funcional do engajamento do alvo.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas reprodutíveis e prontas para ensaio, essenciais para a avaliação confiável de compostos em modelos de dor.
- Análises: Oferece medidas precisas dos limiares de retirada e comparabilidade estatística entre condições basais e de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio de resultados de sensibilidade mecânica relevantes para a doença em modelos de inflamação.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de plataforma reutilizável em múltiplos modelos de dor inflamatória e neuropática, reduzindo o desenvolvimento redundante de ensaios.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na modulação das vias da dor.
- Valor Operacional: Fornece medidas padronizadas e reprodutíveis da sensibilidade tátil com variabilidade técnica mínima.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento, aumentando a eficiência do capital e reduzindo a desistência em fases tardias devido à falta de eficácia mediada pelo alvo.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização de compostos com base em riscos, a partir de efeitos quantificáveis sobre os limiares mecânicos de retirada.
Considerações sobre a Implementação
- Requer treinamento em observação comportamental e identificação de respostas nociceptivas para garantir a consistência das medições.
- Depende de um aparelho eletrônico von Frey calibrado e da seleção apropriada de ponteiras de polipropileno para o tecido da pata traseira.
- Necessita do mascaramento dos operadores e registradores em relação às condições de tratamento para minimizar o viés no registro do limiar.
- Envolve critérios de exclusão baseados na variabilidade do limiar basal para assegurar a homogeneidade dos grupos e a integridade dos dados.
- Limita-se a respostas comportamentais mensuráveis; exige pontos finais nociceptivos claros, como retirada da pata, lambida ou salto.
