Name: Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a medir respostas nociceptivas à pressão mecânica na pata traseira de camundongos usando o aparelho eletrônico von Frey. Este método permite avaliar rapidamente mudanças nos limiares de retirada em modelos de inflamação.

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NIH R15 NS067536-01A1 (para DC) e o Macalester College Wallace Research Fund (para DC) apoiaram esses estudos. A Biblioteca do Macalester College apoiou a publicação em acesso aberto deste artigo. Além disso, agradecemos aos atuais e ex-membros do laboratório Chatterjea por seu apoio.

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Macalester College (IACUC) aprovou todos os protocolos. Camundongos suíços ND4 machos de 8 a 12 semanas de idade foram usados para esses experimentos.
1. Preparação e injeção de veneno de Bothrops jararaca
<ol>
	<li>CUIDADO: O veneno de B. jararaca é tóxico. Use luvas, máscara e proteção para os olhos ao manusear o pó e preparar as soluções.</li>
	<li>Administre 45 μg / kg de veneno de B. jararaca (regime determinado por experimentos anteriores de dose-resposta) ou veículo salino a 0,9% (10 μl) por injeção intraplantar em ambas as patas traseiras usando seringas de insulina de 3/10 ml com agulhas de 29 G x 1/2 pol. Nota: Dependendo do projeto experimental, as soluções de tratamento e controle podem ser injetadas separadamente em cada pata traseira, respectivamente, para fornecer controles internos dentro de cada sujeito.</li>
</ol>
2. Configuração e operação do aparelho eletrônico de von Frey
<ol>
	<li>Coloque a unidade eletrônica de von Frey no suporte da sonda. Certifique-se de que a sonda e o cabo estejam conectados adequadamente à unidade de exibição e ligue o instrumento. Defina a leitura para zero (0.00 g) no modo de configuração e coloque cuidadosamente o peso de teste fornecido (5.00 g) no cone da sonda von Frey.</li>
	<li>Registre a leitura em um caderno de laboratório e repita este procedimento ao terminar a sessão de teste. Se houver uma discrepância superior a 0,20 g entre as leituras do peso padrão antes e depois da sessão de teste, ou se a leitura flutuar após a aplicação do peso padrão, pode ser necessária a recalibração do aparelho (pelo fabricante).</li>
	<li>Para avaliar o limiar de retirada da pata traseira do rato, use a ponta de polipropileno apropriada entre as fornecidas com a sonda. A escolha da ponta depende do tecido que está sendo sondado. As pontas rígidas funcionam bem para o tecido menos sensível e mais resistente da pata traseira, enquanto as pontas semiflexíveis podem ser uma escolha melhor para uma área mais sensível, como a crista ano-genital (Chatterjea, não publicado). Monte cuidadosamente a ponta rígida no cone da sonda.</li>
	<li>Para registrar a pressão máxima aplicada, mude o modo de operação de configuração para operação de forma que a pressão máxima aplicada seja registrada no visor. Neste modo, a leitura da pressão máxima aplicada será salva na tela do visor quando a sonda for retraída.</li>
</ol>
3. Considerações gerais para avaliação do limiar de retirada da pata traseira
<ol>
	<li>Idealmente, dois investigadores são necessários para medir o limiar de retirada da pata traseira (sensibilidade mecânica) usando um aparelho EvF - um para operar o aparelho e realizar as medições e outro para transcrever as medições registradas e manusear camundongos.</li>
	<li>A fim de reduzir o viés, o investigador que opera o aparelho deve ser cego para os tratamentos e para os valores limite de retirada registrados. Além disso, para garantir a consistência entre as medições, o mesmo indivíduo deve avaliar todos os limiares de retirada basais e experimentais.</li>
	<li>Realize todas as medições em uma sala silenciosa e com temperatura controlada e na mesma hora do dia14.</li>
	<li>O experimentador que registra as medições deve colocar cada camundongo em câmaras individuais de invólucro de polimetilmetacrilato (PMMA) de várias unidades em um suporte de piso de malha. Cubra as câmaras com tampas de PMMA perfuradas e coloque um objeto pesado em cima, para evitar que os ratos escapem. Coloque o material absorvente abaixo do suporte para absorver/coletar os resíduos excretados. Permitir que os camundongos se aclimatem por 15 minutos em câmaras antes da avaliação inicial ou experimental do limiar de retirada 6,7,10. </li>
	<li>As patas traseiras dos ratos devem ser facilmente acessíveis através das aberturas do piso de malha; portanto, coloque o suporte do piso de malha a uma altura confortável em um carrinho com freios ou em uma bancada estável que seja acessível por todos os lados.</li>
	<li>Durante as medições, os camundongos podem ter que se distrair com um pellet de comida15 colocado fora da câmara de medição ou um ruído muito leve produzido por bater ou passar uma caneta ao longo da tela de arame do chão da câmara antes, mas não durante, a medição. Isso induz o mouse a ficar parado, permitindo que o experimentador comece a fazer medições com mais facilidade.</li>
</ol>
4. Avaliação do Limiar de Retirada da Pata Traseira na Linha de Base
<ol>
	<li>O primeiro conjunto de medições basais deve ser realizado 48 horas antes da administração do tratamento. Zere a sonda ao montar a ponta rígida. Usando as duas mãos, levante a sonda lentamente para estimular o meio (área da pata) da pata traseira esquerda ou direita (se ambas as patas receberam o mesmo tratamento).</li>
	<li>Aumente a pressão gradualmente até que comportamentos de resposta nociceptiva definidos, como retração da pata traseira, lambida da pata traseira ou salto de quatro patas6,10 sejam observados. Instrua o outro investigador a transcrever a pressão que provocou o comportamento observado.</li>
	<li>Meça o limiar de retirada do camundongo situado na câmara adjacente. Continue até avaliar os limites de retirada de cada mouse uma vez. Repita mais quatro vezes, para que cada camundongo seja medido 5x conforme descrito anteriormente10.</li>
	<li>Para cada mouse, calcule o valor mediano das 5 medidas e, em seguida, calcule o quanto cada valor se desvia da mediana. Selecione 3 valores que menos se desviem e calcule a média deles para obter um limite de retirada de linha de base, conforme descrito anteriormente10. Nesta demonstração, a medição foi padronizada usando 3 de 5 valores; Embora o número específico de medições possa variar de acordo com o projeto experimental, é importante garantir que todos os camundongos sejam cutucados um número igual de vezes para avaliar as linhas de base.</li>
	<li>Repita as medições basais 24 horas depois. Faça 5 medições por camundongo e calcule a média das 3 que estão mais próximas da mediana para obter um limite de retirada basal.</li>
	<li>Para calcular o limiar de retirada basal médio de um camundongo, calcule a média de seus limites de retirada basais obtidos 48 e 24 horas antes do tratamento. Se o limiar médio de retirada da linha de base for inferior a 3,50 g, ou se os dois limiares da linha de base diferirem em 2,00 g ou mais, exclua o camundongo do experimento. Esses critérios garantem que todos os camundongos no experimento tenham respostas basais consistentes e limiares de retirada basais suficientemente altos que permitam observar limiares mais baixos após o tratamento.</li>
	<li>Nota: O limiar de exclusão dependerá do tecido a ser sondado, da estirpe dos animais estudados e do tipo de ponta utilizada. Por exemplo, descobrimos que 3,5 g é uma referência útil para o tecido da pata traseira ND4, mas áreas mais sensíveis, como a crista anogenital, precisam de um limiar de exclusão mais baixo (Chatterjea, não publicado).</li>
	<li>Atribua os camundongos aos grupos de tratamento de modo que a linha de base média de retirada dos grupos experimentais seja a mais semelhante possível antes que os tratamentos sejam administrados.</li>
</ol>
Nota: As medições de linha de base podem ser realizadas antes de 48 horas antes de um experimento. No entanto, devem ser concluídas pelo menos 2 séries de medições basais em intervalos regulares antes do início dos tratamentos.
5. Avaliação Experimental do Limiar de Retirada da Pata Traseira
<ol>
	<li>Avaliar o limiar de retirada da pata traseira (sensibilidade mecânica) após o tratamento em momentos apropriados determinados pelo projeto do experimento. Devolva os ratos às suas gaiolas com acesso a comida e água imediatamente após a conclusão das medições.</li>
	<li>Siga as etapas descritas acima; faça 3 medições em vez de 5 para diminuir a possibilidade de estimular demais o tecido da pata traseira (tratado), especialmente se a sensibilidade for avaliada em vários momentos. Se duas medições das três feitas diferirem em mais de 2,00 g, faça uma quarta medição.</li>
	<li>Calcule a média de 3 medições para obter o limiar de retirada experimental para cada camundongo. Para todos os camundongos para os quais 4 medições foram feitas, calcule a média de três que se desviam menos da mediana, a fim de obter o limiar de retirada experimental.</li>
	<li>Para obter o limite de retirada delta para cada camundongo em um determinado ponto de tempo, subtraia a linha de base do limite de retirada experimental. Repita para todos os camundongos e todos os pontos de tempo experimentais9.</li>
	<li>Realize análises estatísticas apropriadas sobre os dados coletados. Aqui, usamos o JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) para realizar a análise post hoc One-way ANOVA e Tukey HSD.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

A medição de mudanças nas respostas de abstinência é uma ferramenta importante usada para avaliar mudanças na sensibilidade tátil em modelos de dor e inflamação de roedores. Aqui demonstramos a utilidade de um aparelho eletrônico de von Frey para realizar essa avaliação. Existem várias vantagens nesta técnica: i) podemos avaliar rapidamente as respostas de retirada à pressão aplicada para vários camundongos em vários pontos de tempo que estão bastante próximos, ii) podemos usar uma única ponta para aplicar pressão contínua e específica a uma pequena área de tecido, iii) podemos medir com precisão a pressão precisa aplicada para obter uma resposta de retirada, e iv) podemos implementar facilmente pontos de corte robustos de linha de base, critérios de exclusão e controles internos para garantir que as avaliações comportamentais sejam as mais precisas e objetivas possíveis.
As etapas críticas para garantir os melhores resultados para um ensaio EvF são a calibração prévia do instrumento e práticas de medição consistentes. Conforme detalhado na seção de protocolo, o instrumento precisa ser manuseado com cuidado e a calibração adequada deve ser garantida antes e durante o uso. Antes de qualquer medição, as leituras do peso de teste devem ser confirmadas para garantir o funcionamento ideal da máquina. Se as leituras flutuarem significativamente ou se as leituras do peso padrão não forem precisas, o fabricante deve ser imediatamente contatado para calibrar o aparelho. Com isso em mente, é aconselhável, se possível, ter um aparelho eletrônico de von Frey de backup para não comprometer experimentos sensíveis ao tempo devido a uma necessidade inesperada de calibração do instrumento. Além disso, um único investigador bem treinado deve fazer todas as medições experimentais e de linha de base para um determinado estudo ou série de experimentos, mantendo-se cego para os grupos de tratamento. Os camundongos devem ser avaliados em uma sala silenciosa, mantida a uma temperatura constante, aclimatada às câmaras EvF por pelo menos 15 minutos, mas não retidos na câmara por mais tempo do que o necessário (especialmente se várias medições forem feitas em um único dia) para minimizar o estresse e as variações comportamentais induzidas pelo desconforto.
As medições de EvF oferecem melhorias significativas em relação às técnicas de CvF existentes. Os pesquisadores podem aplicar pressão contínua e não precisam alternar entre pontas de vários pesos, como é feito em experimentos de filamentos CvF6. Isso leva a menos cutucadas no tecido, o que é especialmente relevante no caso de tecido inflamado ou lesionado. A pressão precisa na qual ocorre a retirada pode ser medida em comparação com o uso de medidas de retirada de 50% que também são limitadas pelos pesos de filamento disponíveis usados nas medições de CvF13. Como critérios de exclusão racionais e uniformes podem ser implementados (como discutido acima), os camundongos podem ser atribuídos a grupos experimentais de modo que todos os grupos tenham linhas de base médias semelhantes no início do experimento. As medições de EvF avaliam as mudanças na resposta comportamental a um determinado estímulo, e não as respostas absolutas em si. Portanto, a mudança de cada camundongo na resposta nociceptiva é medida como a diferença entre suas retiradas experimentais e basais individuais, fornecendo assim controles internos para cada medição feita.
Talvez a limitação mais significativa do EvF seja que, semelhante à sua contraparte manual, o mesmo pesquisador deve fazer todas as medições para uma série específica de medições de linha de base e experimentais. Isso torna a ampliação da técnica desafiadora do ponto de vista de tempo, pessoal e equipamento. Descobrimos que ~ 20 camundongos por vez (dependendo da configuração das câmaras de ensaio) podem ser medidos em 30-45 minutos ou menos em vários pontos de tempo, desde que haja pelo menos 45 minutos entre as medições. Uma consideração relacionada a esse respeito é a curva de aprendizado de experimentadores individuais. A consistência interna deve ser estabelecida antes que um pesquisador individual possa embarcar em um experimento em grande escala e isso requer muitas horas de prática dedicada envolvendo medições repetidas de resposta de linha de base até que a consistência desejada seja alcançada. Além disso, o uso de pontos de corte de linha de base implica que nem todos os camundongos de linha de base para um experimento podem ser incluídos; descobrimos que 25-30% dos camundongos com linha de base por experimento são normalmente excluídos.
Em termos de modificações e aplicações futuras, as medições comportamentais do EvF adicionam uma dimensão poderosa a uma ampla gama de modelos de inflamação para analisar a dor aguda e/ou crônica concomitante que pode estar subjacente a patologias inflamatórias. No envenenamento, descobrimos que mudanças pronunciadas e rápidas na sensibilidade tátil acompanharam os resultados esperados de inchaço tecidual, recrutamento de leucócitos e degranulação de mastócitos nas patas traseiras de camundongos machos ND4. Esses achados corroboram observações anteriores sobre as contribuições dos mediadores de mastócitos para a sensibilidade térmica em ratos20 e a sensibilidade mecânica induzida pelo veneno de B. jararaca em camundongos ND4 Swiss medidos usando CvF21. O protocolo EvF pode ser facilmente modificado para uso em outros tecidos além da pata traseira , por exemplo, abdômen7 e crista ano-genital8 , onde o CvF é usado atualmente. Modelos de roedores de alergias, cicatrização de feridas, neuropatias e outras patologias podem ser facilmente adaptados para incluir medidas de sensibilidade mecânica em tecidos, incluindo e além da pata traseira.
Em resumo, o EvF é uma técnica útil e eficaz que atualiza uma abordagem clássica de medição da nocicepção em roedores e é uma nova ferramenta importante na investigação dos complexos mecanismos subjacentes da dor em uma ampla gama de modelos de doenças.

As doenças crônicas não transmissíveis são responsáveis por uma parcela desproporcional da carga humana de mortalidade e morbidade1. A dor crônica é cada vez mais reconhecida como um componente importante da carga global de doença2. Isso deu um grande impulso às inovações na prevenção, tratamento e tratamento da dor. Ao mesmo tempo, há evidências abundantes de que a biologia subjacente da dor é complexa3. Os mecanismos subjacentes à dor protetora, bem como desadaptativa e crônica, apontam para uma interação intrincada entre os sistemas imunológico e nervoso3,4. A elucidação desses mecanismos exige abordagens experimentais quantitativas e reprodutíveis rigorosas, desde a dissecção molecular até a análise comportamental.
Modelos de roedores têm sido inestimáveis na caracterização de atores moleculares da dor inflamatória e neuropática5. A redução no tempo e na intensidade de respostas previamente especificadas a estímulos nocivos é usada para medir os estados de dor nesses animais, pois os indivíduos roedores não são capazes de relatar uma sensação de dor6. Respostas alteradas à temperatura e pressão são comumente usadas como métricas de sensibilidade tecidual em modelos de roedores de nocicepção inflamatória que podem ser causadas por infecção7,8, exposição química6, 9,10, incisão cirúrgica11, bem como dor neuropática causada por ligadura nervosa12.
A sensibilidade mecânica, ou resposta a estímulos de pressão, é frequentemente medida usando filamentos clássicos de von Frey (CvF) - uma série (por exemplo, 0,4-15 g13) de pontas ponderadas aplicadas manualmente para testar o tecido em incrementos seriados até que os comportamentos de dor sejam induzidos em controles versus sujeitos experimentais. Existem vários métodos para usar essas pontas ou cabelos para avaliar a sensibilidade mecânica6,13; O método mais usado é o seguinte. Uma ponta com uma certa pressão (dentro da série; por exemplo, 2 g13) é selecionado como ponto de partida e o limiar de retirada de 50% de um rato ou camundongo (a intensidade do estímulo necessária para produzir uma resposta 50% das vezes que a ponta é aplicada ao tecido) é determinado movendo-se para cima e para baixo no peso da ponta com base na exibição de comportamentos de resposta previamente especificados13. Os limites absolutos de retirada de 50% para os grupos de tratamento são então comparados entre os pontos de tempo basais e pós-tratamento. Esta técnica manual é bastante demorada. Além do aumento do tempo gasto por cada sujeito confinado em uma câmara de von Frey, isso também aumenta o número de vezes que pontas de teste de vários pesos são aplicadas ao tecido inflamado, causando maior desconforto aos roedores do estudo. Além disso, os limites de abstinência de 50% são calculados e comparados entre grupos de roedores; As respostas individuais dos sujeitos experimentais normalmente não são normalizadas para suas respostas basais individuais não tratadas, com, até onde sabemos, uma exceção6. Como consequência, os indivíduos roedores geralmente não são relatados como designados para grupos de tratamento com base em respostas basais consistentes dentro de um intervalo previamente determinado e nem os indivíduos individuais são avaliados com base em um conjunto consistente de critérios de exclusão que permitem que as respostas basais sejam padronizadas para qualquer conjunto específico de estudos e ensaios.
Aqui, apresentamos um método alternativo para medir a sensibilidade tátil da pata traseira de camundongo após a exposição ao veneno de Bothrops jararaca usando um aparelho eletrônico de von Frey (EvF). Cunha e colegas6 foram pioneiros no uso de técnicas de EvF em roedores e compararam sistematicamente a eficácia de CvF e EvF para demonstrar que o EvF fornece uma medida "mais sensível, objetiva e quantitativa" de sensibilidade tátil em modelos de roedores de dor inflamatória. Resumidamente, nas medições de EvF, uma ponta de von Frey de polipropileno não higroscópica de diâmetro uniforme (0,8 mm) de rigidez adequada para o tecido que está sendo testado é conectada a uma sonda eletrônica e leitura que exibe a força/peso com que o roedor se retrai da ponta. Existem várias diferenças importantes entre as medições de CvF e EvF. Primeiro, o processo de medição das respostas basais e experimentais usando EvF é bastante simplificado, pois a pressão na pata traseira pode ser aplicada com força crescente até que haja uma resposta e não haja necessidade de mudar as pontas como no CvF; Os animais passam menos tempo confinados nas câmaras de ensaio e, portanto, ficam menos estressados e mais confortáveis durante um experimento. Em segundo lugar, o EvF permite relativa facilidade de implementação de critérios de exclusão racionais para os sujeitos do estudo na forma de faixas de limites basais aceitáveis. Isso permite a padronização das respostas basais dentro e entre os grupos de tratamento. Terceiro, a resposta de um sujeito após um tratamento experimental é sempre comparada à sua própria resposta basal individual, criando importantes controles internos para medições. Em quarto lugar, a precisão dos limiares de retirada é registrada em um nível mais alto de resolução, pois a pressão pode ser aplicada continuamente, em vez de em incrementos disponíveis na forma de pesos de filamentos manuais. Tal como acontece com os ensaios de CvF bem projetados, os experimentos baseados em EvF também são realizados com o mesmo investigador (cego para o tratamento) aplicando a força e registrando os comportamentos de resposta. É importante observar que essa técnica requer tempo e esforço por parte dos investigadores para estabelecer a consistência interna das medições e requer que os experimentos sejam planejados de forma que sejam feitas concessões apropriadas para camundongos que podem ter que ser excluídos devido a respostas basais inconsistentes.
Uma avaliação fácil de implementar, eficaz e bem controlada da sensibilidade mecânica facilita a adição da avaliação comportamental a modelos de eventos inflamatórios, como envenenamento - o exemplo que usamos aqui para ilustrar as capacidades e o poder das medições de EvF na medição de mudanças na sensibilidade tátil. Descobrimos que camundongos ND4 Swiss machos mostraram uma sensibilidade mecânica aumentada após a injeção de veneno derivado da víbora sul-americana Bothrops jararaca na pata traseira. As respostas comportamentais foram acompanhadas por edema, influxo de neutrófilos e degranulação de mastócitos no tecido afetado.

<table><tbody><tr><td>ND4 Camundongos machos suíços</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>Os camundongos usados aqui tinham de 8 a 12 semanas de idade e foram alojados e usados de acordo com as diretrizes da IACUC do Macaleter College.</td></tr><tr><td>Seringa de insulina de 3 ml/100 com agulha de 29 g 1/2 pol</td>. <td>BD</td><td>BD309301</td><td>Eliminar após cada utilização para o recipiente apropriado.</td></tr><tr><td>B. jararaca veneno</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>CUIDADO: Substância tóxica. Use proteção para os olhos e a pele. Dissolva em solução salina estéril a 0,9%.</td></tr><tr><td>Aparelho electrónico de von Frey; sonda = gama de 90 g</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>Deslocar-se suavemente e certificar-se de que está sempre na horizontal. Para zerar a sonda, pressione "Programa" e "Limpar". Para alternar do modo de configuração para o modo de operação, pressione "Function" (para leitura "MH") ou "MAX".</td></tr><tr><td>Suporte de malha + câmaras de PMMA</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Coloque em uma bancada estável ou em um carrinho com quatro rodas para acessar todos os lados.</td></tr><tr><td>Apenas pontas rígidas de von Frey eletrônicas, faixa de 90 g</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

medindo mudanças na tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von frey

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Medir as alterações induzidas pela inflamação nos limiares de retirada da pata traseira da pressão mecânica é uma técnica útil para avaliar as mudanças na percepção da dor em roedores. Os limiares de abstinência podem ser medidos primeiro no início do estudo e, em seguida, após drogas, venenos, lesões, alérgenos ou inflamação evocada, aplicando uma força precisa em áreas muito específicas da pele. Um aparelho eletrônico de von Frey permite uma avaliação precisa dos limiares de retirada da pata traseira do camundongo que não são limitados pelos tamanhos de filamento disponíveis, em contraste com as medições clássicas de von Frey. A facilidade e rapidez das medições permitem a incorporação da avaliação dos resultados da sensibilidade tátil em diversos modelos de dor inflamatória e neuropática de início rápido, pois várias medições podem ser feitas em um curto período de tempo. As medições experimentais para indivíduos de roedores individuais podem ser controladas internamente em relação às respostas basais individuais e aos critérios de exclusão facilmente estabelecidos para padronizar as respostas basais dentro e entre os grupos experimentais. Assim, as medições usando um aparelho eletrônico de von Frey representam uma modificação útil dos ensaios clássicos baseados em filamentos de von Frey bem estabelecidos para alodinia mecânica de roedores que também podem ser aplicados a outros modelos de mamíferos não humanos.

A administração local do veneno de B. jararaca provoca alterações na sensibilidade tátil da pata traseira e edema tecidual em camundongos machos ND4 Swiss.
1,5 h após a administração de 45 µg/kg de veneno de B. jararaca, camundongos machos ND4 Swiss recolheram suas patas traseiras com uma pressão 3,0 g inferior à linha de base (Figura 1A). O recuo na linha de base para todos os grupos ocorreu com aproximadamente 4,5 g de pressão aplicada; após o tratamento com veneno, os camundongos experimentais recolheram suas patas traseiras com pressão de 1-1,5 g (dados não mostrados). Os camundongos controles tratados com solução salina apresentaram pouca ou nenhuma redução na resposta à pressão em comparação com a linha de base em todos os pontos temporais testados. Os limiares reduzidos de resposta nos camundongos tratados foram claramente mantidos às 3 e 6 h após o envenenamento (Figura 1A) e tornaram-se indistinguíveis dos controles após 24 h (dados não mostrados). As patas traseiras dos camundongos envenenados apresentaram edema tecidual característico de inflamação. Aos 1,5 h após a administração do veneno, as patas traseiras tratadas, medidas conforme descrito anteriormente10, estavam 1,5 mm mais espessas do que na linha de base; o edema persistiu até as 3 e 6 h (Figura 1B). Em contraste, as patas tratadas com solução salina não apresentaram inchaço nem alteração na espessura durante o período experimental. Para o experimento representativo mostrado aqui, um total de 21 camundongos foi utilizado para as medições de linha de base e 14 foram selecionados para inclusão no experimento. Eles foram alocados em grupos de tratamento de modo que as respostas médias de recuo na linha de base fossem em torno de 4,5 g para cada grupo como um todo.
As alterações induzidas pelo veneno de B. jararaca na sensibilidade tátil são acompanhadas pela desgranulação de mastócitos e influxo de neutrófilos nas patas traseiras de camundongos machos ND4 Swiss.
Além do aumento da sensibilidade tátil e do edema tecidual, também avaliamos a infiltração de neutrófilos (Figuras 2A-B) e a desgranulação de mastócitos (Figuras 2C-D) nas patas traseiras de camundongos envenenados em comparação com os tratados com solução salina. Os neutrófilos são os primeiros leucócitos inflamatórios a serem recrutados para uma lesão a partir da circulação e são conhecidos por mediar respostas nociceptivas inflamatórias10,16,17. Os mastócitos são células sentinela residentes nos tecidos18 e a desgranulação de mastócitos tem sido associada a respostas nociceptivas na pata traseira de camundongos10 e na dura-máter de ratos19.
Aqui, constatamos que a entrada de neutrófilos nas patas traseiras envenenadas aumentou quase 1.000 vezes em comparação com as patas traseiras tratadas com solução salina (Figura 3A), conforme avaliado por meio da contagem de cortes histológicos sagitais plantares corados com hematoxilina-eosina, com 4 µm de espessura, embutidos em parafina10, coletados 1,5 hora após a administração do veneno em camundongos eutanasiados.
Nas patas tratadas com solução salina, os mastócitos plantares no tecido da pata traseira estavam amplamente intactos ou apresentavam desgranulação leve (Figura 3B). Em contraste, as patas traseiras envenenadas mostraram 15-20% de desgranulação moderada e extensa dos mastócitos (Figura 3B). As seções de tecido descritas acima foram coradas com azul de toluidina e o número de grânulos visíveis foi contado por mastócito observado para determinar o estado de desgranulação, conforme descrito anteriormente10.
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Local B. jararaca a administração do veneno causa alterações na sensibilidade mecânica da pata traseira e edema tecidual em camundongos machos ND4 Swiss Os limiares basais de retirada e a largura basais da pata foram avaliados 48 e 24 horas antes da injeção intra-plantar B. jararaca veneno (Bjv; 45 µg/kg) ou tratamento com veículo (solução salina) (10 µl). Os limiares de retirada foram avaliados em 1,5, 3 e 6 horas após o tratamento (A). Alargura média da pata (largura média da pata esquerda e direita de um camundongo) na região mediano-plantar foi avaliado utilizando paquímetros digitais na linha de base e posteriormente 1,5, 3 e 6 horas após o tratamento para determinar o edema tecidual conforme descrito anteriormente10 (B). As significâncias são comparadas com camundongos tratados com Sal (* = p &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001, respectivamente). n = 10-11 camundongos por grupo de tratamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>.
<img alt="Histological comparison of saline and B. jararaca effects, under 400x and 1000x magnification." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. B. jararaca a sensibilidade mecânica induzida pelo veneno é acompanhada pela desgranulação de mastócitos e influxo de neutrófilos nas patas traseiras de camundongos machos ND4 Swiss 3 camundongos/tratamento foram eutanasiados por CO2 1,5 h após o tratamento e suas patas traseiras foram excisadas, armazenadas em formalina a 10% por 24 horas, transferidas para etanol a 70%, descalcificadas por 1 a 2 semanas em EDTA a 15% e emblocadas em parafina. 4 µm secções sagitais foram coradas com hematoxilina-eosina (A-B) e azul de toluidina (C-D) para visualizar neutrófilos (A-B) e mastócitos (C-D), respectivamente. As imagens foram adquiridas em 400X e 1.000X conforme anotado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>. 
<img alt="Neutrophils and degranulation by B. jararaca venom; bar graph; venom impact analysis." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. B. jararaca a sensibilidade mecânica induzida pelo veneno é acompanhada por aumentos significativos nos níveis de degranulação de mastócitos e influxo de neutrófilos nas patas traseiras de camundongos machos Swiss ND4 Neutrófilos e mastócitos em cortes histológicos corados foram contados utilizando um microscópio Olympus CX21LED. Os neutrófilos foram contados em 3 patas traseiras por tratamento, da região do calcanhar até os dedos, em campos adjacentes de visão, com aumento de 400X. (A). Contaram-se os mastócitos em 3 almofadas plantares/tratamento e seu estado de desgranulação foi pontuado com base no número de grânulos visíveis fora do limite celular: intacto (0), leve (0-10), moderado (10-20), extenso (21+), conforme descrito anteriormente10 (B).  Para evitar a contagem dupla das mesmas células, os pesquisadores que avaliaram os números de neutrófilos e os níveis de degranulação de mastócitos nas seções da pata traseira utilizaram uma grade inscrita no retículo do ocular. Os pesquisadores estavam cegos quanto ao tratamento.s. As significâncias são comparadas com camundongos tratados com Sal (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001) &lt; 0,05, ** = p &lt; 0,01, *** = p &lt; 0,001, respectivamente). n = 3 camundongos por grupo de tratamento.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior</a>.

As medições eletrônicas de von Frey são uma alternativa eficaz e aprimorada aos filamentos de von Frey clássicos, pois permitem a medição rápida e precisa das mudanças nos limiares de retirada mecânica de roedores para estímulos de pressão aplicados continuamente antes e depois de um evento inflamatório.

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

O objetivo geral deste procedimento é medir respostas não suscetíveis à pressão mecânica na pata traseira de camundongos. Isso é realizado primeiramente colocando os animais sobre um piso de malha metálica e permitindo que se habituem quando estiverem prontos. Uma ponta de polipropileno é aplicada na região inferior da pata traseira, e a pressão é gradualmente aumentada.Quando a resposta comportamental apropriada é observada, o estímulo é retirado. Após a coleta dos valores basais, os animais recebem uma intervenção experimental antes de novos testes. Por fim, as alterações nos limiares de retirada da pata traseira são comparadas entre os grupos de tratamento para determinar o efeito de um tratamento específico sobre as mudanças na sensibilidade tátil à pressão.A dor é um componente fundamental da inflamação. É importante medir e caracterizar a dor em diferentes contextos. Este método relativamente simples de avaliação da dor pode ser aplicado a muitos modelos diferentes de inflamação.Quem demonstrará o procedimento será Tiana ov, uma técnica de pesquisa do meu laboratório, Madison Mack, que participou deste trabalho como aluna de graduação, e Akila Sykes, atualmente aluna de graduação no meu laboratório. Começamos configurando o aparelho de teste para facilitar o acesso às patas traseiras.Coloque câmaras individuais sobre um piso de malha. O piso de malha deve estar a uma altura confortável e sobre uma superfície estável. Em seguida, coloque o aparelho eletrônico Von Frey sobre a bancada.Certifique-se de que a sonda e o cabo estão adequadamente conectados à unidade de exibição e ligue o instrumento no modo de configuração. Ajuste a leitura para zero e coloque suavemente o peso de teste fornecido sobre o cone da sonda Von Frey. Registre a leitura e repita este procedimento novamente ao final dos testes; se houver uma discrepância entre os dois valores, o equipamento poderá precisar ser recalibrado.Selecione uma ponteira de polipropileno do tamanho apropriado para o tecido a ser testado. Ponteiras rígidas funcionam bem para o tecido da pata traseira, menos sensível e mais resistente. Monte suavemente a ponteira sobre o cone da sonda.Em seguida, mude do modo de configuração para o modo de operação. Isso exibirá a pressão máxima aplicada quando a sonda for retratada. Dois pesquisadores são necessários para medir os limiares de retirada da pata traseira.Um operador para manusear o aparelho e realizar as medições, e outro para registrar essas medições, a fim de reduzir o viés. O pesquisador que operar o anesthesi TER deve estar cegado quanto aos tratamentos, bem como aos valores registrados de limiar de retirada. Além disso, para garantir consistência entre as medições, a mesma pessoa deve registrar todos os valores basais e de limiar de retirada.48 horas antes do tratamento, o primeiro conjunto de medições de linha de base é registrado. Coloque material absorvente abaixo do suporte para coletar os resíduos excretados. Após acoplar a ponteira e zerar a sonda, o pesquisador que registra as medições deve colocar os camundongos em câmaras individuais.Cubra as câmaras com tampas perfuradas e coloque um objeto pesado em cima. Para impedir que os camundongos escapem, permita que eles se aclimatizem à câmara por 15 minutos antes de prosseguir. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldade com a aplicação gradual de pressão crescente e com a obtenção de consistência interna em suas próprias medições; portanto, a prática é essencial para gerar resultados reprodutíveis.Quando pronto, use as duas mãos para elevar lentamente a sonda e estimular a planta do pé de uma das patas traseiras, esquerda ou direita. Aumente a pressão gradualmente até que um comportamento nociceptivo seja observado. Eles são identificados pela retração da pata traseira, lambida da pata traseira ou salto da pata.Instrua o outro pesquisador a registrar a pressão que provocou o comportamento observado. Durante a medição, é útil encorajar o camundongo a permanecer imóvel colocando um alimento palatável logo fora da câmara ou fazendo um ruído suave, como uma leve batida, antes de realizar a medição. Prossiga para o próximo camundongo até que cada um tenha sido testado uma vez e repita este procedimento mais quatro vezes.Após coletar cinco valores basais, obtenha uma média para cada camundongo. Repita as medidas basais 24 horas depois e utilize esses valores para calcular outra média. Para garantir que todos os camundongos apresentem respostas basais consistentes, exclua animais com uma média do limiar basal de retirada inferior a 3,5 gramas ou cujos limiares basais difiram em dois gramas ou mais.Por fim, distribua os camundongos em grupos de tratamento separados de forma que a média da linha de base de retirada de cada grupo seja a mais semelhante possível. Aqui, os limiares de retirada foram medidos após a administração do veneno na pata traseira, ROS raca. Controle tratado com solução salina. Os camundongos mostraram pouca alteração em comparação com a linha de base em todos os momentos.As respostas nociceptivas nos pontos testados em camundongos tratados foram claramente mantidas até seis horas. Além disso, o edema tecidual, característico da inflamação, era evidente nas patas traseiras tratadas com veneno, mas não com solução salina. As alterações induzidas pelo veneno na sensibilidade tátil foram acompanhadas por uma entrada de neutrófilos quase mil vezes maior.Em comparação com as patas traseiras tratadas com soro fisiológico, nas quais os mastócitos plantares no tecido da pata traseira estavam amplamente intactos ou apresentavam degranulação leve, observou-se nas patas traseiras acasaladas de 15 a 20% de degranulação moderada e acentuada dos mastócitos. Esta técnica pode ser adaptada para avaliar a sensibilidade mecânica ou tátil em uma ampla variedade de tecidos além da pata traseira.Portanto, esta técnica pode ser incorporada em muitos modelos diferentes de roedores para inflamação e dor.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Poupado do Nervo modelo animal de lesão é descrita aqui como um modelo do rato da dor neuropática periférica seguintes denervação parcial do nervo ciático por a lesão do tibial e nervo peroneal comum ramos, deixando o nervo sural restante intacto. Modificação comportamental resultante da alodinia mecânica é quantificada por filamentos de von Frey.

Poupado da lesão do nervo Model (SNI) de alodinia mecânica induzida em camundongos

Descrevemos dois métodos táteis testes sensoriais para períodos agudos ou crônicos de lesão medular em ratos. Estes procedimentos validados pode detectar o desenvolvimento e manutenção da alodinia-like sensações.

Aguda e crônica teste sensorial tátil após a lesão medular em ratos

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

A dor neuropática é uma conseqüência de uma lesão ou doença que afeta o sistema somatossensorial. O "modelo cuff" da dor neuropática em ratos consiste na implantação de um manguito de polietileno em todo o ramo principal do nervo ciático. A alodinia mecânica é testado usando filamentos de von Frey.

O ciático Nervo cuffing Modelo de Dor Neuropática em Ratos

Aqui, apresentamos os protocolos para determinar os limiares de detecção de vibração e acuidade tátil usando métodos psicofísicos no homem.

Medição do limiar de detecção de vibração e tátil Spatial Acuity em Seres Humanos

A avaliação precisa da resposta de dor em um modelo animal neuropática é crítica para investigar a fisiopatologia das doenças dor e desenvolver novos analgésicos. Apresentamos um método sensível e objetivo para determinar a função sensorial do roedor hind pata por um sistema de análise de marcha automática.

Análise de marcha automatizados em ratos com lesão crônica de constrição

Este estudo estabelece um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena com reductase (RTX). Uma única dose de RTX (50 µ g/kg) é ideal para o desenvolvimento de um modelo de neuropatia de pequenas fibras que imita as características do pacientes e pode ajudar a investigar o significado molecular nociceptivo subjacente a dor neuropática.

Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1

A cirurgia modificada é um método simplificado para o modelo de lesão nervosa poupada de camundongo ou rato que requer apenas uma ligadura e um corte para lesionar os nervos fibular e sural comuns.

Modelo de cirurgia de lesão nervosa poupada modificada de dor neuropática em camundongos

Métodos para indução simples e rápida de um modelo de dor nas costas em camundongos são fornecidos aqui usando uma injeção intraligamentar de ativador de plasminogênio urinário.

Modelo de dor nas costas de camundongo induzido pelo ativador do plasminogênio do tipo uroquinase

A ligadura parcial do nervo ciático induz dor neuropática crônica de longa duração, caracterizada por respostas exageradas a estímulos térmicos e mecânicos. Este modelo murino de dor neuropática é comumente usado para estudar terapias inovadoras para o tratamento da dor. Este artigo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico para melhorar a padronização e reprodutibilidade.

Ligadura parcial do nervo ciático: um modelo murino de dor neuropática crônica para estudar o efeito antinociceptivo de novas terapias

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a nocicepção em camundongos infectados com Trypanosoma evansi, utilizando o aparelho eletrônico de von Frey como ferramenta, medindo limiares mecânicos da pata traseira e vísceras.

Eletrônica de von Frey associada à Escala de Cartas de Camundongos para Avaliação de Alodinia e Dor em Camundongos Infectados por Trypanosoma evansi

Aprenda a medir respostas nociceptivas à pressão mecânica na pata traseira de camundongos usando o aparelho eletrônico von Frey. Este método permite avaliar rapidamente mudanças nos limiares de retirada em modelos de inflamação.

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

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