Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células In Vitro

O objetivo geral do experimento a seguir é mostrar a eficácia citotóxica da terapia fotodinâmica em células de osteossarcoma. Isso é obtido medindo primeiro a captação intracelular do fotossensibilizador MTHP pelas células do osteossarcoma. Na segunda etapa, a luz do laser é aplicada às células para ativar o M-T-H-P-C e produzir radicais citotóxicos de oxigênio.

Finalmente, o metabolismo celular e o número de células são medidos por um ensaio de tetra oleum one ou WST um solúvel em água. Em última análise, o ensaio WST um, bem como a contagem direta de células, podem ser usados para medir a citotoxicidade da terapia fotodinâmica nas células do osteossarcoma. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia do osteossarcoma, pois permite medir a eficácia da terapia fotodinâmica in vitro e se assemelha à técnica atualmente utilizada em pacientes.

Para comparar a captação de M-T-H-P-C entre as linhagens celulares de osteossarcoma, comece com plaqueamento 0,2 vezes 10 elevado ao sexto Hoss e 143 células B por poço. Em triplicado em placas de seis poços, deixe as células aderirem durante a noite a uma fluência de 80 a 90% de co e, no dia seguinte, incube as células com uma concentração fixa de M-T-H-P-C por diferentes períodos de tempo no escuro para avaliar a absorção dependente do tempo do fotossensibilizador pelas células. Após as incubações, aspirar o meio e lavar as células três vezes com PBS, depois separar as células com 0,5 mililitros de tripsin EDTA e contá-las.

Em seguida, gire as células por cinco minutos a 400 vezes G e temperatura ambiente. Aspirar o meio e ressuspender o sedimento em PBS até uma densidade final de duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Pipetar 100 microlitros da suspensão celular em cada poço de um 96.

Poço e meça a fluorescência das células em um espectrofotômetro de fluorescência ajustado para excitação de 417 nanômetros e emissão de 652 nanômetros. Em seguida, prepare uma curva padrão colocando 100 microlitros de concentrações de zero a quatro miligramas por mililitro de M-T-H-P-C em triplicado. Em uma placa de 96 poços e meça a fluorescência conforme demonstrado para gerar uma curva padrão para calcular a unidade de fluorescência relativa de cada célula contendo poço da placa medida anteriormente.

Para medir a fototoxicidade do fotossensibilizador, primeiro semeie 3000 células por poço em triplicata por cada concentração de M-T-H-P-C em uma placa de 96 poços, incluindo células de controle de toxicidade escura para cada concentração de FOTOSSENSIBILIZADOR. Deixe as células aderirem durante a noite a uma fluência de 50 a 60% de CO no dia seguinte. Incube as células com uma gama de concentrações de M-T-H-P-C no escuro durante cinco horas após a incubação.

Aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS e adicione meios frescos sem M-T-H-P-C, então específicos para o espectro de absorção M-T-H-P-C, usando proteção adequada para os olhos. Defina um laser de diodo de 652 nanômetros para uma potência de 21,88 miliwatts por centímetro quadrado a uma altura de 13,5 centímetros. Distância das células para obter uma dose de energia de cinco joules por centímetro quadrado.

Em seguida, iluminar as células, exceto as células de controle de toxicidade escuras, por 230 segundos após a iluminação. Mantenha as células no escuro a 37 graus Celsius por 24 horas. Posteriormente, adicione 10 microlitros de wst, um reagente por 100 microlitros de meio três horas após a adição do wst um reagente, meça a absorbância dos poços individuais em 415 nanômetros.

Finalmente, calcule o número de células sobreviventes, além do ensaio WST. A contagem direta das células é um segundo método para medir a toxicidade celular. Para calcular a porcentagem de células viáveis, semeie duas vezes 10 elevado ao quarto de células por poço em 2 placas de 24 poços e deixe-as aderir durante a noite.

No dia seguinte, incube as células por cinco horas no escuro com M-T-H-P-C e ilumine-as como acabamos de demonstrar. Mantenha as células de controle escuras no escuro após 24 horas, colete o sobrenadante, lave as células uma vez com PBS e os olhos de tripsina finalmente girem as células e ressuspendam o pellet em 200 microlitros de meio fresco para contagem. Os resultados ilustrados neste gráfico mostram no painel superior a captação de M-T-H-P-C de maneira dependente do tempo, com uma intensidade de fluorescência da suspensão celular representando os níveis intracelulares do M-T-H-P-C.

No painel inferior. A captação de M-T-H-P-C dependente da dose pode ser avaliada medindo a fluorescência de M-T-H-P-C com um espectrofotômetro de fluorescência. Este gráfico ilustra a captação de uma concentração fixa de M-T-H-P-C de maneira dependente do tempo, com a intensidade de fluorescência da suspensão celular representando os níveis intracelulares do M-T-H-P-C.

Neste gráfico, é demonstrada a captação de M-T-H-P-C dependente da dose em células Haass e 143 B após uma incubação de cinco horas. A captação na linha celular 143 B de alta metastática foi significativamente maior do que na linha de células hospedeiras parentais de baixa metastática. A toxicidade escura dependente da dose das células do osteossarcoma é demonstrada.

143 células B foram tratadas com diferentes dosagens de M-T-H-P-C e comparadas com células não tratadas e foi observada uma diminuição dependente da dose da atividade metabólica e do número de células medido por um ensaio. A diminuição da viabilidade celular foi reconhecida em uma concentração de M-T-H-P-C igual e superior a 2,5 microgramas por mililitro. No gráfico inferior, a toxicidade dependente da dose de M-T-H-P-C é ilustrada.

As células foram tratadas com diferentes doses de M-T-H-P-C e subsequente iluminação a cinco joules por centímetro quadrado. Foi observada uma conseqüente diminuição na atividade metabólica celular, bem como uma diminuição no número de células. O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer aplicarem esses métodos a modelos in vivo de osteossarcoma, bem como a outras investigações pré-clínicas.