Name: Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda um método mecânico de corte para expandir agregados de células-tronco neurais humanas mantendo o contato célula-célula. Esta técnica permite crescimento logarítmico estável por mais de 40 passagens em neuroesferas.

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Agradecemos ao Dr. Soshana Svendsen para análise crítica e edição deste relatório. Este trabalho foi contribuído para pelo NIH / NINDS 1U24NS078370-01 e CIRM Dr2a-05320.

Os autores não têm nada a revelar.

<img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Chopping esquemática. Expansão de células-tronco esferóide / progenitoras em cultura utilizando o método de corte mecânico. Etapas críticas Uma visão geral sobre o paradigma expansão corte é mostrado na Figura 6. Tamanho esfera hNPC é um dos critérios importantes para ob...

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Brandon C. Shelley 
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Clive Svendsen

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Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Há uma longa história de expansão de células-tronco neurais de roedores na cultura tanto como uma monocamada 1-3 ou 4-7 neurospheres agregados. Além disso, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) isolados a partir de várias regiões do sistema nervoso central em desenvolvimento 8-17 foram expandidas in vitro. Estas células são bi-potente, capaz de se diferenciar em ambos os astrócitos e neurônios e tem sido uma ferramenta muito útil no estudo do desenvolvimento neural 18,19 e doença mecanismo 20,21. hNPCs também têm sido transplantados em diversos modelos animais diferentes de doenças do sistema nervoso central, com diferentes níveis de integração, de sobrevivência e de efeitos funcionais 22-24. Tradicionalmente, o roedor ou NPCs fetais derivadas de humanos são expostas a factores de crescimento - factor de crescimento epidérmico, muitas vezes (EGF) e / ou fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2) 25-28 - e ambos aderente 29 e trêsSistemas de esferóides-dimensionais são tipicamente repicadas utilizando dissociação enzimática numa suspensão de células individuais 30-34. O método padrão para expandir as células para a pesquisa ou uso clínico é como uma monocamada aderente devido à manipulação fácil. No entanto, temos mostrado que monocamada passaging e neuroesferas hNPCs com enzimática ou soluções químicas resultou em senescência precoce 35. Além disso, a dissociação enzimática pode resultar em níveis aumentados de diferenciação e alterações cariotípicas com base em dados demonstrados com células estaminais embrionárias 36-38. Embora o método padrão de hNPCs Passaging produziu atual boas práticas de fabrico (GMP) produtos de qualidade que passaram para a fase 1 de ensaios clínicos (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), o método permitiu apenas algumas rodadas de amplificação celular, limitando a potencial bancário. Claramente, as grandes experiências de pesquisa e ensaios clínicos futuros poderiam se beneficiar da capacidade depropagar células a granel e com a senescência tardia para permitir o crescimento em grande escala e bancos de células. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos uma maneira nova e automatizada de neurospheres intactas Passaging mecanicamente por &quot;cortar&quot; os em pequenos grupos para manter contato célula-célula. Este método aumentou grandemente o seu tempo de vida e 39 de suspensão de cultura permite uma utilização mais eficiente do espaço da incubadora em comparação com as culturas de monocamada, como pode ser visto com um método de cultura de biorreactor 3D alternativa 40. O protocolo de desbastamento fornecida permite a produção de grandes bancos de uma amostra fetal maior do que a passagem 10, uma tarefa pouco provável usando métodos Passaging padrão. Enquanto este método para hNPCs Passaging é pouco convencional, que está crescendo em popularidade e foi recentemente publicado com outros tipos de células, como as células-tronco neurais derivadas de embriões humanos e células-tronco pluripotentes induzidas, permitindo a expansão em grande escala para várias aplicações, incluindo em vmodelagem de doenças ITRO 41-46. Importante, uma cGMP-grau hNPC banco de células já foi produzida com o método de corte, o que demonstra que a técnica pode ser aplicada para aplicações clínicas futuras.

<table><tbody><tr><td>Copo, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Armário de Bio-Segurança, classe II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>Modelo de 4 pés ou 6 pés.&nbsp; Modelo de 6 pés recomendado; vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Lâminas, Double-edge Prep</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>vários fabricantes/fornecedores.&nbsp; CUIDADO: Sharp</td></tr><tr><td>Cell Freezing Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, centrífuga sem soro</td></tr><tr><td>, balde oscilante com inserções de 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Tubos cônicos, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Tubos cônicos, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>vários fabricantes/ fornecedores</td></tr><tr><td>Freezer Planer</td> de<td>taxa controlada</td><td>Kryo 750</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Cryovials, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Frasco de cultura, Ventilado, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Frasco de cultura, Ventilado, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Frasco de Cultura, Ventilado, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Frasco de Cultura, Ventilado, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &micro; m, copo anexado, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &micro; m, copo anexado, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &micro; m, copo anexado, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 &micro; m, copo anexado, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Papel de Filtro, círculos de 8,5 cm</td><td>Pinça Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>, Padrão Padrão - Serrilhada/Curvada/18 cm</td> Câmara de Congelamento <td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>, Álcool Isopropílico</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Incubadora, 37 &deg; C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>série 370</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Hemacitômetro, Fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD&</td><td>nbsp; Modificação da placa de Petri necessária.&nbsp; &nbsp; CUIDADO:&nbsp; Lâmina afiada e em movimento.</td></tr><tr><td>Micropipetador, 1-10 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Micropipettor, 100-1.000 &mu; l (kit inicial)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Micropipettor, 2-20 &mu; l (kit inicial)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Micropipettor, 20-200 &mu; l (kit inicial)</td> <td>Gilson</td><td>F167700</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Chave de porca, autoclavável, 5/16 "</td><td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets, algodão conectado</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>vários fabricantes / fornecedores</td></tr><tr><td>Placa de Petri, Vidro, Autoclavável</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Disco de calço</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIÁVEL</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira estéreis, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira estéreis, 1.000 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira estéril, 20 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira estéreis, 200 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis estéreis, todo em plástico, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis estéreis, todo em plástico, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis estéreis, todo em plástico, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis estéreis, todo em plástico, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Bolsas de esterilização, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Filtro, 40 &micro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos, 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Tube Racks, Interlocking Four-Way</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Reagentes</td><td></td><td></td><td></td>de processamento específico de células progenitoras</tr><tr><td>neurais Células-tronco neurais Meio de expansão (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Importante usar a marca Stemline</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico Humano Recombinante (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Fator Inibidor de Leucemia Humana Recombinante (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>vários fabricantes/fornecedores</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

um método de expansão cgmp-aplicável para agregados de neural humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A técnica de expansão de células de acumular um grande número de células a partir de uma única amostra para experimentos de pesquisa e ensaios clínicos beneficiariam muito a comunidade de células-tronco. Muitos métodos de expansão atuais são trabalhoso e caro, e os que envolvem a dissociação completa pode causar vários tipos de tronco e células progenitoras se submeter a diferenciação ou senescência precoce. Para superar estes problemas, foi desenvolvido um método de passagens em mecânico automatizado designado por &quot;picar&quot; que é simples e barato. Esta técnica evita a dissociação química ou enzimática em células individuais e em vez permite a expansão em grande escala de culturas em suspensão, esferóides que mantêm contacto célula / célula constante. O método de cortar tem sido principalmente utilizado para células progenitoras fetais derivadas do cérebro neurais ou neuroesferas, e, recentemente, tem sido publicado para utilização com as células estaminais neurais derivadas de células estaminais embrionárias pluripotentes e induzidos. O processo envolvendoes semeando neurospheres em uma cultura de tecidos de Petri e, posteriormente, de passagem, uma lâmina afiada estéril através das células efetivamente automatizando o processo tedioso de manualmente dissociar mecanicamente cada esfera. Suspender as células em cultura proporciona uma relação de superfície favorável área para volume; como mais de 500.000 células podem ser cultivadas num único neuroesfera de menos de 0,5 mm de diâmetro. Em um balão T175, mais de 50 milhões de células podem crescer em culturas de suspensão em comparação com apenas 15 milhões em culturas aderentes. É importante ressaltar que o processo de corte tem sido utilizado com uma corrente de boas práticas de fabricação (cGMP), permitindo a produção em quantidade em massa de produtos celulares clínica grau.

<img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> Número de células Figura 5. Dados representativos. A) Projeção de hNPCs congelados a p19, depois descongelado e expandida como uma monocamada aderente usando dissociação enzimática em comparação com neurospheres subculturas através do método de cortar. Dia 0 representa quando as células foram descongeladas a p20. B) Imagens representativ...

Este protocolo descreve um método de desbastamento mecânico novela que permite a expansão de células progenitoras e estaminais neurais agregados esféricos sem dissociação de uma única suspensão de células. Manter contato célula / célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar com eficiência a repicagem dos neuroesferas, de modo que o contato célula a célula seja mantido ao longo da vida útil das células cultivadas. Esta técnica cria condições de expansão necessárias para células progenitoras neurais humanas. Isso é alcançado combinando até dois frascos T175 contendo as mesmas células e transferindo-as para um tubo cônico, permitindo a transferência das esferas para uma placa de Petri como um segundo passo, concentrando os neuroesferas suspensos em uma massa gerenciável na placa de Petri, o que permite que a lâmina corte as hNPCs em pequenos aglomerados.Em seguida, as neuroesferas repassadas ou fragmentadas são ressuspendidas para remover as células da placa de Petri e repassá-las para os novos frascos. Os resultados obtidos mostram que a técnica de fragmentação proporciona uma estratégia de crescimento de longo prazo, com base nas curvas de expansão que demonstram taxas de crescimento logarítmico de longo prazo, em comparação com as células repassadas pelo método enzimático padrão. A demonstração visual desta técnica é essencial como uma esfera.Os passos de condensação são difíceis de descrever por esc

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A capacidade de manipular-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs) in vitro permite investigar a sua utilidade como transplantes de células para fins terapêuticos e para explorar o desenvolvimento neural humano. Este protocolo apresenta um método de cultivo e hNSPCs passaging na esperança de reprodutibilidade crescente de pesquisas sobre células estaminais humanas.

Passaging células-tronco neurais

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Este vídeo demonstra a geração de células progenitoras neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas não transgênicas e transgênicas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células progenitoras neurais usando um meio de diferenciação neuronal. Enquanto a diferenciação é induzida em células não transgênicas usando pequenas moléculas, as hPSCs transgênicas são diferenciadas pela adição de um antibiótico que induz o promotor de um fator de transcrição específico de diferenciação neuronal.

Diferenciando Células-Tronco Pluripotentes Humanas Não Transgênicas e Transgênicas em Células Progenitoras Neurais

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Aqui nós apresentamos um método para um modelo humano em vitro de lesão de estiramento em um formato de 96 poços, numa escala de tempo relevante para o impacto do trauma. Isto inclui métodos para a fabricação de placas stretchable, quantificando o insulto mecânico, cultivo e ferindo células, imagem e análise de conteúdo elevado de quantificar a lesão.

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve um sistema de cultura dinâmica para produzir agregados de tamanho controlado de células-tronco pluripotentes humanas e estimular ainda mais a diferenciação em organoides cerebelares sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores usando um bioreator de uso único.

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

Este artigo descreve um protocolo para a geração de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em um biorreator de suspensão 3D de bancada.

Produção de neurônios humanos induzíveis por neurogenina 2 em biorreator de suspensão tridimensional

Aprenda um método mecânico de corte para expandir agregados de células-tronco neurais humanas mantendo o contato célula-célula. Esta técnica permite crescimento logarítmico estável por mais de 40 passagens em neuroesferas.

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto (Vídeo) | JoVE Journal

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