Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto
15 de junho de 2014
Este protocolo descreve um método de desbastamento mecânico novela que permite a expansão de células progenitoras e estaminais neurais agregados esféricos sem dissociação de uma única suspensão de células. Manter contato célula / célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.
O objetivo geral do experimento a seguir é passar eficientemente as neuroesferas para que o contato célula a célula seja mantido durante toda a vida útil das células cultivadas. Essa técnica cria condições de expansão necessárias para as células progenitoras neurais humanas. Isso é conseguido combinando até dois frascos T 1 75 das mesmas células e transferindo para um tubo cônico, permitindo a transferência das esferas para uma placa de Petri como uma segunda etapa condensada em neuroesferas suspensas em uma massa gerenciável na placa de Petri, o que permite que a lâmina corte os NPCs H em pequenos grupos.
Em seguida, as neuroesferas passadas ou cortadas são ressuspensas para remover as células da placa de Petri e quat nos novos frascos. São obtidos resultados que mostram que a técnica de corte fornece uma estratégia de crescimento de longo prazo com base nas curvas de expansão, demonstrando taxas de crescimento logarítmicas de longo prazo em comparação com as células que passaram pela abordagem enzimática padrão. A demonstração visual dessa técnica é crítica como uma esfera.
As etapas de condensação são difíceis de descrever por escrito. Existem também vários truques para ajudar no processo. Se o excesso de mídia não for totalmente removido da placa de Petri, as esferas serão simplesmente empurradas na mídia, em vez de divididas em grupos menores.
Comece este procedimento abordando a cor do meio do frasco de NPCs H. Examine o frasco ao microscópio para observar as células. Se possível, use um radical para examinar o tamanho de várias esferas.
Se muitas esferas tiverem um diâmetro de 300 micrômetros ou mais, prossiga com o processo de corte e pique as células a cada sete a 10 dias. Em seguida, coloque o frasco de volta na incubadora e configure o picador. Ligue o interruptor de alimentação do helicóptero.
No BSC, defina a espessura de corte para 200 micrômetros e a força da lâmina para 180 graus ou a posição das nove horas. Em seguida, confirme se o botão de velocidade automático está girado o máximo possível no sentido anti-horário. Em seguida, mova o botão de liberação da mesa o mais para a direita possível e confirme se o suporte da placa está estável.
Gire o manipulador manual do braço no sentido horário para elevar o braço ao seu nível máximo. Depois disso, transfira assepticamente uma lâmina de corte estéril de dois gumes para o parafuso do braço do picador. Usando uma pinça, coloque o fecho sobre a lâmina usando a pinça.
A parte curva do fecho deve estar sobre a borda superior do braço. Em seguida, segure o fecho no braço e prenda a porca no parafuso. Com a chave de porca estéril, deixando a porca um quarto de volta solta.
Neste procedimento, transfira a quantidade sugerida de meio de manutenção para o novo frasco. Depois disso, transfira assepticamente as células da incubadora para o BSC. Apoie o balão num suporte para tubos e deixe as esferas assentarem no balão.
Um se estabeleceu. Aspirou até 12 mililitros de sobrenadante. Com uma pipeta serológica de 10 ml, lavar todas as esferas frouxamente aderentes da superfície do balão.
Repita conforme necessário e permita que as esferas se assentem entre Rens. Em seguida, transfira o volume sugerido de meio condicionado para o novo frasco. Em seguida, transfira todos os meios e esferas condicionados restantes para um novo tubo cônico de 15 mililitros.
Deixar assentar as esferas e rejeitar o balão utilizado. Depois disso, transfira lentamente as células do tubo cônico de 15 mililitros para a placa de Petri de 60 milímetros ou disco de calço no menor volume possível. Guarde o restante do meio condicionado, pois será usado para enxaguar as células do prato após a costeleta.
Tente minimizar a área de superfície coberta pela mídia e esferas no prato. Em seguida, comece a condensar a piscina de esferas transferindo o super natin de volta para o tubo cônico de 15 mililitros. Remova o máximo de mídia possível do topo da piscina de células de mídia com um micropipetador com ponta de barreira de aerossol.
Até que não seja possível remover a mídia sem esferas, espalhe a piscina. Usando a lateral da ponta da pipeta para aumentar a área de superfície, incline levemente a placa de Petri e use a lateral da ponta da pipeta para deslizar suavemente todas as esferas para um lado da piscina. Depois que todas as células forem realocadas, incline lentamente a placa de Petri para a direção oposta para permitir que o meio se separe das esferas.
Em seguida, transfira o meio limpo de volta para o tubo cônico de 15 mililitros. Use a lateral da ponta da pipeta para deslizar suavemente todas as esferas de volta para o centro da placa de Petri. Portanto, a piscina tem um diâmetro de 0,5 a 2,4 centímetros.
É importante manter a profundidade do pool de esferas rasa. Se a piscina for muito profunda, as esferas serão empurradas para o lado durante o corte. Agora, transfira a placa de Petri para o suporte da placa e prenda-a sob os ganchos do suporte da placa.
Use o botão de liberação da mesa para deslizar o suporte da placa para a esquerda para que a lâmina fique livre das esferas e travada na marcha. Em seguida, abaixe o braço do picador girando o botão do manipulador manual no sentido horário até que a lâmina se encaixe na placa de Petri. Pressione o suporte do braço enquanto aperta a porca.
Em seguida, pressione o botão de reinicialização. Uma vez firme a placa de Petri com uma mão enquanto gira o botão do manipulador automático do braço no sentido horário para a posição de 90 graus ou 12 horas e comece a cortar quando todas as esferas tiverem sido cortadas. Gire o suporte da placa 90 graus.
Em seguida, afrouxe o parafuso, abaixe o braço e reaperte a porca. Repita o procedimento de corte. Depois disso, assepticamente, transfira a placa de Petri do suporte da placa para um espaço de trabalho no BSC.
Transfira um mililitro de meio condicionado para as esferas picadas. Em seguida, ressuspenda suavemente e transfira as esferas picadas para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Tente evitar a formação de bolhas e repita quantas vezes forem necessárias para coletar as esferas picadas.
Meça o volume do meio condicionado e das esferas cortadas. Adicione a quantidade apropriada de mídia de manutenção para atingir o volume sugerido na coluna E. O volume final em cada frasco deve ser igual ao volume sugerido na tabela dois Coluna F. Coloque os NPCs h picados na incubadora.
Esta figura mostra o número de células projetadas de H NPCs congelados na passagem 19, depois descongelados e expandidos como uma monocamada aderente usando dissociação enzimática em comparação com neuroesferas passadas pelo método de corte. Aqui estão as imagens representativas de esferas pré-cortadas e pós-cortadas com ampliação de 10x. Esta imagem mostra a passagem de degelo 29 H NPCs que foram plaqueados por um dia e corados para ninho e expressão, enquanto esta imagem mostra a passagem de degelo 29 H NPCs que foram plaqueados por sete dias na ausência de fatores de crescimento e corados para GFAP e beta três tubulina.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a técnica de corte automatizado para passar HBCs, que mantém o contato célula a célula durante toda a vida das células e da cultura. Este procedimento pode ser adaptado a uma infinidade de tipos de células, como células-tronco neuro derivadas de células pluripotentes ou esferas cardiovasculares.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um novo método mecânico de pique que permite a expansão de agregados esféricos de células-tronco e progenitoras neurais sem dissociação para uma suspensão de células isoladas. A manutenção do contato célula/célula permite um crescimento rápido e estável por mais de 40 passagens.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa com Células-Tronco
Antecedentes
- A passagem eficiente de neuroesferas é essencial para manter a viabilidade celular.
- Métodos tradicionais frequentemente interrompem o contato célula-célula.
- Este estudo explora uma técnica mecânica de picagem para melhorar o crescimento.
- Estratégias de crescimento de longo prazo são fundamentais para células progenitoras neurais humanas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método que mantenha o contato célula a célula durante a passagem.
- Comparar as taxas de crescimento de neuroesferas picadas com os métodos enzimáticos padrão.
- Fornecer uma demonstração visual da técnica de piquetagem.
Métodos Utilizados
- Combinar até dois frascos T175 do mesmo tipo de células.
- Transferir as células para um tubo cônico para processamento adicional.
- Fragmentar os agregados em pequenos aglomerados utilizando uma lâmina.
- Res suspender os neuroesferoides picados para transferência para novos frascos.
Resultados Principais
- A técnica de pique favorece taxas de crescimento logarítmico de longo prazo.
- Os resultados indicam um crescimento aprimorado em comparação com os métodos tradicionais.
- Demonstrações visuais destacam a eficácia da técnica.
- Neurosferas picadas mantiveram melhor viabilidade celular ao longo do tempo.
Conclusões
- O método mecânico de pique é eficaz para expandir células progenitoras neurais.
- Manter o contato célula a célula é crucial para o crescimento ideal.
- Essa técnica oferece uma alternativa promissora ao repicagem enzimática.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método mecânico de piqueamento permite a expansão escalonável de agregados de células-tronco e progenitoras neurais humanas, preservando o contato crítico entre célula e célula, abordando um gargalo fundamental na produção de células-tronco para aplicações tanto de pesquisa quanto clínicas. Ao evitar a dissociação enzimática, a técnica reduz a pressão de diferenciação e o risco de senescência, favorecendo a produção consistente de produtos celulares neurais clinicamente relevantes sob condições de boas práticas de fabricação clínica (cGMP). Isso posiciona o método como uma ferramenta valiosa para reduzir os riscos na validação inicial de alvos neurais e viabilizar a geração reprodutível de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Mantém as interações fisiológicas entre células em culturas de progenitores neurais, apoiando estudos de interação com alvos mais biologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Permite a expansão de longo prazo por mais de 40 passagens, fornecendo fornecimento sustentado de células para campanhas iterativas de validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz culturas homogêneas de esferoides adequadas para formatos padronizados de ensaio que exigem arquitetura celular tridimensional.
- Valor Operacional: Gera altos rendimentos (>50 milhões de células por frasco T175) em comparação com culturas aderentes, melhorando a produtividade do triagem e a eficiência dos reagentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças ao expandir células derivadas de células-tronco pluripotentes ou de tecido fetal sem desvio fenotípico.
- Valor Operacional: Compatível com a fabricação cGMP, facilitando a transição contínua da descoberta à produção em escala clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de corte se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a expansão confiável de células progenitoras neurais para validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e redução de riscos mecanicistas antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio do cultivo sustentado de agregados neurais fisiologicamente relevantes.
- Triagem: Fornece resultados reprodutíveis com alto número de células, essenciais para a padronização de ensaios e campanhas de triagem de compostos.
- Análises: Permite a quantificação da cinética de expansão e de métricas de viabilidade para subsidiar decisões de avanço ou interrupção.
- Pesquisa Translacional: Mantém a fidelidade celular desde a descoberta até a validação pré-clínica, reduzindo a variabilidade biológica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalonável e automatizada de repicagem aplicável a múltiplas fontes de células-tronco neurais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva mediante a manutenção do contato nativo entre células e a redução de artefatos induzidos pelo cultivo.
- Valor Operacional: A passagem mecânica padronizada minimiza a variabilidade do usuário e sustenta processos escalonáveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em programas com alvo neural ao garantir qualidade celular consistente ao longo das passagens.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco por meio de um fornecimento confiável de células conforme as Boas Práticas de Fabricação para estudos pré-clínicos e clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer treinamento em técnica asséptica e operação de picador mecânico.
- Depende do acesso a lâminas estéreis, tubos cônicos, placas de Petri e incubadoras.
- Necessita de etapas padronizadas de condensação e ressuspensão para garantir distribuição consistente do tamanho das esferas.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir otimização da espessura do corte e da força da lâmina.
- As limitações práticas incluem a necessidade de etapas manuais de remoção do meio durante a condensação, o que pode afetar a produtividade se não for otimizado.
