Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura e a organização das proteínas mitocondriais em C dois. Isso é realizado primeiramente gerando uma grade de microscopia eletrônica congelada e hidratada contendo a amostra. Em seguida, é registrada uma série de inclinação com dose limitada da amostra em um microscópio eletrônico criogênico.

Em seguida, a série de inclinação é processada para gerar um volume tomográfico. Por fim, as densidades proteicas são médias para determinar a estrutura das proteínas e as membranas são segmentadas para revelar sua estrutura tridimensional. Ao reposicionar as médias das proteínas de volta nas Tom Grahams, a estrutura e a organização das proteínas na membrana são reveladas.

Portanto, realizamos a tomografia crioeletrônica de mitocôndrias porque queremos compreender como elas funcionam no nível molecular. A principal vantagem dessa técnica em relação a outros métodos, como a microscopia eletrônica de cortes finos em plástico, é que a resolução é mais alta. O material não é fixado quimicamente de maneira alguma, e os detalhes moleculares das proteínas são preservados.

A técnica de criotomografia eletrônica pode levar algum tempo para ser dominada, mas usuários experientes podem adquirir de cinco a seis reconstruções TOM de boa qualidade por sessão. A parte mais difícil do procedimento é produzir grades com gelo hidratado congelado de espessura ideal. Após o isolamento e a centrifugação dos mitocôndrios, de acordo com o protocolo descrito, utilize 250 milimolares de T trioses em tampão HEPA 10 milimolares para ressuspender o pellet a uma concentração de aproximadamente cinco miligramas por mililitro de proteína total. Submeta grades EM de carbono puramente ao tratamento de descarga de brilho, lado de carbono voltado para cima, em um dispositivo a vácuo, de acordo com as instruções do fabricante; liquefaça alguns mililitros de etano direcionando um fluxo de gás etano para o lado interno de um recipiente de alumínio resfriado com nitrogênio líquido.

Use um par de pinças para pegar uma grade DM submetida a descarga elétrica e coloque-a sobre a bancada. Misture a proteína com uma suspensão de marcadores de ouro conjugados na proporção um para um com a suspensão mitocondrial e, imediatamente, aplique três microlitros da solução sobre a grade. Em seguida, coloque as pinças em um dispositivo de vitrificação, como uma guilhotina caseira, com uma cunha de papel filtro para remover o excesso de líquido da grade e libere o gatilho para mergulhar imediatamente a grade em etano líquido. Depois, transfira a grade do etano líquido para o nitrogênio líquido.

Remova o etano em excesso da grade colocando a ponta de uma pasta de papel filtro nova no etano líquido. À medida que o líquido sobe, arraste suavemente a grade para cima ao longo do papel filtro, mantendo-a abaixo do frente líquida, e transfira-a imediatamente para nitrogênio líquido para armazenamento e uso posterior. Coloque a grade em uma caixa de grades e armazene em um dewar preenchido com nitrogênio líquido para registrar uma série de inclinação tomográfica.

Inicie garantindo que os tanques de nitrogênio líquido estão cheios e verifique se a temperatura do estágio de espécimes e do dispositivo de transferência de grades está abaixo de 100 kelvin. Confirme que o microscópio eletrônico está bem alinhado adquirindo uma imagem de uma grade de teste e verificando a qualidade dos anéis de tório; os anéis devem ser redondos e se estender até a borda da imagem. Em seguida, insira uma grade com mitocôndrias congeladas e hidratadas.

Em seguida, no modo de busca, procure áreas com espessura de gelo e qualidade de espécime adequadas. Faça uma imagem de busca de seis segundos em áreas promissoras para determinar a adequação para a coleta de dados. Após localizar uma área adequada do espécime, incline a platina em mais ou menos 60 graus para determinar a faixa máxima de inclinação disponível sem obstrução da área de exposição ou foco por barras da grade ou cristais de gelo em um orifício próximo cheio de gelo com aparência semelhante, mude para o modo de exposição e ajuste a intensidade do feixe ou o tempo de aquisição da imagem.

Assim, cada imagem registrada tem uma dose de elétrons de 30 a 50 elétrons por pixel para CCDs ou seis a oito elétrons por pixel por segundo. Para detectores diretos de elétrons, calcule a razão da distribuição de dose ou I zero sobre I 60 dividindo a contagem média de elétrons para uma imagem de um segundo adquirida a zero graus pela de uma imagem de 60 graus sobre um orifício vazio. Adquira uma imagem de um segundo no modo de exposição e anote a contagem de elétrons por angstrom quadrado.

Levando em consideração a razão de distribuição da dose, calcule o número total de imagens e o intervalo de inclinação que podem ser registrados para uma dose total específica de elétrons, utilizando um software apropriado de coleta automática de dados. Configure e grave um Tomograma com os parâmetros recém-determinados, típicos de tomogramas. Para essas amostras, comece em mais ou menos 20 graus e prossiga através de zero graus antes de alcançar altas inclinações.

Para criar e segmentar tomogramas, converta a série de inclinações para um formato de arquivo apropriado para o software de reconstrução. Utilizando um programa de reconstrução Tom Graham, como o Im mod, alinhe as imagens marcando a posição dos marcadores fiduciais de ouro. Após o alinhamento, gere um Tommo Graham.

Melhore o contraste da tomografia de Graham utilizando um filtro de imagem, como o filtro de difusão não linear e anisotrópica distribuído com o ImageJ, para fins de visualização. Use programas comercialmente disponíveis para segmentar manualmente a tomografia. Atribua vóxeis correspondentes às membranas interna e externa a camadas separadas; uma vez atribuídos, crie uma superfície para visualizar as membranas.

Utilizando a opção de cliques no plugin do pacote EM para emira, marque a localização de partículas de TP sintase usando as partículas marcadas como entrada e um pacote de software apropriado, como a estimativa de partículas. Para o programa de tomografia eletrônica, calcule uma média de agrama para uma estimativa de resolução. Calcule a correlação da concha do foyer entre duas médias subtomográficas determinadas independentemente, utilizando o programa de visualização gratuito.

A sobreposição de estruturas cristalográficas conhecidas foi ajustada manualmente, e depois automaticamente com o comando "fit", na média sub-Tom Agram, conforme mostrado nesta figura. A segmentação manual das membranas em uma criomicroscopia eletrônica mitocondrial revela a estrutura das cristas em uma mitocôndria. Ao imaginar mitocôndrias de cepas de levedura com genes eliminados que carecem de certas proteínas, pode-se avaliar o efeito dessas proteínas na morfologia das cristas.

Mostra-se aqui uma mitocôndria de uma linhagem de levedura que carece da subunidade E da síntese de TP, necessária para a formação de dímeros da sintetase de TP. Diferentemente das cristas normais do tipo selvagem, essas organelas contêm diversas estruturas da membrana interna que ou são desprovidas de cristas ou apresentam invaginações membranosas pequenas com formato de balão. Em imagens com bom contraste, os dímeros da ATP sintetase são facilmente visíveis, conforme indicado aqui pelas cabeças de seta amarelas.

Ao segmentar as membranas, a localização da síntese de ATP, agora representada pela esfera amarela, pode ser visualizada em relação à morfologia das cristas. Neste caso, a síntese de ATP forma filas de dímeros ao longo das bordas altamente curvadas das cristas mitocondriais. A média de subtomogramas permite determinar as estruturas de proteínas em resoluções de quatro nanômetros ou melhores. Ao encaixar estruturas conhecidas por raios X na média do subtomograma, modelos atômicos de complexos proteicos em seu ambiente nativo podem ser montados, como se observa.

Neste exemplo, os volumes médios podem ser recolocados no Tomo Graham para auxiliar na organização dos complexos individuais em relação uns aos outros e a outros complexos proteicos na membrana. Nosso protocolo demonstra como você pode usar a tomografia crioeletrônica para determinar a estrutura e a organização de complexos proteicos dentro da membrana mitocondrial interna. Este protocolo também pode ser utilizado para determinar a estrutura e a organização de outras proteínas ligadas à membrana em diferentes compartimentos celulares.

A preparação da amostra é fundamental para obter bons termogramas. A grade hidratada congelada deve conter camadas perfeitamente vítreas com espessura entre 70 e 150 nanômetros. Normalmente, examinamos cinco a seis grades até encontrar uma área com espessura ideal do gelo e qualidade adequada do espécime.

Para a coleta de micrografias, um microscópio eletrônico de transmissão de 300 quilovolts com estágio criogênico dedicado, filtro de energia e câmera com detector direto de elétrons é o ideal, mas um equipamento de 200 quilovolts com estágio criogênico de entrada lateral e uma câmera CCD também pode ser utilizado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar uma grade criogênica, coletar uma série de inclinação, reconstruir a tomografia e calcular uma média subtomográfica.

Essas são as habilidades básicas necessárias para investigar como a organização de proteínas em uma célula afeta a capacidade dessa célula de realizar funções biológicas, como a síntese eficiente de ATP. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido e etano líquido pode ser muito perigoso, e óculos de proteção e luvas devem ser usados o tempo todo.