Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura e organização das proteínas mitocondriais em C dois. Isso é feito gerando primeiro uma grade de microscópio eletrônico hidratado congelado contendo a amostra. Em seguida, uma série de inclinação limitada de dose da amostra é registrada em um microscópio criogênico eletrônico.

Em seguida, a série de inclinação é processada para gerar um volume tomográfico. Finalmente, as densidades das proteínas são calculadas para determinar a estrutura das proteínas e as membranas são segmentadas para revelar sua estrutura 3D. Ao reposicionar as médias das proteínas de volta ao Tom Grahams, a estrutura e a organização das proteínas na membrana são reveladas.

Então, fazemos tomografia de elétrons criados de mitocôndrias porque queremos entender como elas funcionam no nível molecular. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como a microscopia eletrônica de seções plásticas finas, é que a resolução é maior. O material não é quimicamente fixado de forma alguma, e os detalhes moleculares das proteínas são preservados.

A técnica de critografia eletrônica pode levar algum tempo para ser dominada, mas usuários experientes podem adquirir de cinco a seis aterramentos TOM de boa qualidade por sessão. A parte mais difícil do procedimento é produzir grades hidratadas congeladas com espessura ideal de gelo Depois de isolar e peletizar as mitocôndrias, de acordo com o protocolo de texto, use 250 trioses T milimolares em tampão HEPA de 10 milimolares para ressuspender o pellet a uma concentração de aproximadamente cinco miligramas por mililitro de descarga total de proteína. Grades EM totalmente em carbono com o lado do carbono para cima em um dispositivo de vácuo de acordo com as instruções do fabricante, liquefazem alguns mililitros de etano direcionando um fluxo de gás etano para o lado interno de um recipiente de alumínio resfriado com nitrogênio líquido.

Use uma pinça para pegar uma grade de DM de descarga luminescente e coloque-a na proteína de mistura de bancada, uma suspensão fiducial de ouro conjugado, um a um com a suspensão mitocondrial, e aplique imediatamente três microlitros da solução na grade. Em seguida, coloque a pinça em um dispositivo de vitrificação, como uma guilhotina caseira com uma cunha de papel de filtro, retire o excesso de líquido da grade e solte o gatilho para mergulhar imediatamente a grade no etano líquido. Em seguida, transferir a grade do etano líquido para o nitrogênio líquido.

Remova o excesso de etano da grade colocando a ponta de uma nova fatia de papel de filtro no etano líquido. À medida que o líquido sobe, arraste suavemente a grade para cima no papel de filtro, mantendo-o abaixo da frente do líquido e, em seguida, transfira-o imediatamente para nitrogênio líquido para armazenar para uso posterior. Coloque a grade em uma caixa de grade e armazene em um dosador cheio de nitrogênio líquido para registrar uma série de inclinação tomográfica.

Comece garantindo que os agentes de nitrogênio líquido estejam cheios e verifique se a temperatura do estágio de amostra e do dispositivo de transferência de grade está abaixo de 100 kelvin. Confirme se o microscópio eletrônico está bem alinhado adquirindo uma imagem de uma grade de teste e verificando a qualidade dos anéis espinhosos Os anéis devem ser redondos e se estender até a borda da imagem. Em seguida, insira uma grade com mitocôndrias hidratadas congeladas.

Em seguida, no modo de pesquisa, procure áreas de espessura de gelo e qualidade de amostra apropriadas. Tire uma imagem de pesquisa de seis segundos de áreas promissoras para determinar a adequação para a coleta de dados. Depois de localizar uma boa área de amostra, incline a platina mais ou menos 60 graus para determinar a faixa máxima de inclinação disponível sem obstrução da área de exposição ou foco por barras de grade ou cristais de gelo em um orifício próximo cheio de gelo de aparência semelhante, mude para o modo de exposição e ajuste a intensidade do feixe ou o tempo de aquisição da imagem.

Portanto, cada imagem gravada tem uma dose de elétrons de 30 a 50 elétrons por pixel para CCDs ou seis a oito elétrons por pixel por segundo. Para detectores diretos de elétrons, calcule a razão de distribuição de dose ou I zero sobre I 60 dividindo a contagem média de elétrons para uma imagem de um segundo adquirida a zero grau pela de uma imagem de 60 graus sobre um buraco vazio. Adquira uma imagem de um segundo no modo de exposição e observe a contagem de elétrons por angstrom ao quadrado.

Levando em consideração a taxa de distribuição de dose, calcule o número total de imagens e o intervalo de inclinação que podem ser registrados para uma dose total específica de elétrons usando o software de coleta automática de dados apropriado. Configure e grave um Tom Agram com os parâmetros que acabamos de determinar tomos típicos. Para essas amostras, comece em mais ou menos 20 graus e passe por zero graus antes de atingir altas inclinações.

Para criar e segmentar tomos, converta a série de inclinação em um formato de arquivo apropriado para o software de reconstrução. Usando um programa de reconstrução de Tom Graham como o Im mod, alinhe as imagens marcando a posição dos marcadores fiduciais de ouro. Uma vez alinhado, gere um Tommo Graham.

Melhore o contraste do tommo Graham usando um filtro de imagem, como o filtro de difusão isotrópico não linear distribuído com IM o para visualização. Use programas disponíveis comercialmente para segmentar manualmente o Tom. Atribua voxels correspondentes à membrana interna e externa para separar as camadas, uma vez atribuídas, crie uma superfície para visualizar as membranas.

Usando a opção clicker no plug-in do pacote EM para emira, marque a localização de uma partícula de sintase TP usando as partículas marcadas como entrada e um pacote de software apropriado, como a estimativa de partículas. Para o programa de tomografia eletrônica, calcule uma média de agrama para uma estimativa de resolução. Calcule a correlação da concha do foyer entre duas médias subtommo determinadas independentemente usando o programa de visualização gratuito.

A quimera encaixa estruturas de raios-x conhecidas na média sub Tom Agram primeiro manualmente, depois automaticamente com o ajuste de comando como visto nesta figura, a segmentação manual das membranas em um grito de elétrons mitocondrial revela a estrutura do Christi em uma mitocôndria. Ao obter imagens de mitocôndrias de cepas nocauteadas de leveduras que carecem de certas proteínas. O efeito dessas proteínas na morfologia de Christi pode ser avaliado.

Aqui é mostrada uma mitocôndria de uma cepa de levedura sem uma subunidade E de síntese de TP, que é necessária para a formação de dímeros de síntese de TP. Ao contrário do Lala Christi normal das mitocôndrias do tipo selvagem, essas organelas contêm várias estruturas de membrana interna que são desprovidas de Christi ou contêm pequenas invaginações de membrana em forma de balão. Em Ingrams com bom contraste, os dímeros A TP Synthes são facilmente visíveis, conforme indicado aqui pelas pontas das setas amarelas.

Ao segmentar as membranas, a localização da síntese de A TP agora representada pela esfera amarela pode ser visualizada em relação à morfologia de Christi. Nesse caso, a síntese A TP forma fileiras de dímeros ao longo das bordas altamente curvas da média Lo Meer Christi Subtommo permite que as estruturas das proteínas sejam determinadas em resoluções de quatro nanômetros ou mais. Ao encaixar estruturas de raios-x conhecidas no subtomo Graham, modelos atômicos médios de complexos de proteínas em seu ambiente nativo podem ser montados como vistos.

Neste exemplo, volumes médios podem ser colocados de volta no Tomo Graham para auxiliar na organização de complexos individuais em relação uns aos outros e a outros complexos de proteínas na membrana. Nosso protocolo demonstra como você pode usar a criotomografia eletrônica para determinar a estrutura e a organização dos complexos de proteínas dentro da membrana mitocondrial interna. Este protocolo também pode ser usado para determinar a estrutura e organização de outras proteínas ligadas à membrana em diferentes compartimentos celulares.

A preparação da amostra é a chave para adquirir bons termogramas. A grade hidratada congelada deve conter olhos perfeitamente vítreos de 70 a 150 nanômetros de espessura. Normalmente, examinamos de cinco a seis grades até encontrar uma área de espessura de gelo e qualidade de amostra ideais.

Para coleta de gramas, um microscópio eletrônico de transmissão de 300 quilovolts com estágio criogênico dedicado e filtro de energia e câmera com detector direto de elétrons é o melhor, mas um instrumento de 200 quilovolts com estágio criogênico de entrada lateral e uma câmera CCD também pode ser usado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma grade de choro. Colete uma série de inclinação, reconstrua o termograma e calcule uma média subtommo.

Essas são as habilidades básicas necessárias para investigar como a organização das proteínas em uma célula afeta a capacidade dessa célula de desempenhar funções biológicas, como a síntese eficiente de A TP. Não se esqueça de trabalhar com nitrogênio líquido e Ethan líquido pode ser muito perigoso e óculos e luvas de segurança devem ser usados o tempo todo.