Name: In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Aprenda a técnica de transfecção de siRNA na medula espinal lombar de camundongos usando injeção intratecal não invasiva. Este método permite o silenciamento gênico eficiente com anestesia leve.

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Todos os procedimentos de uso de animais estavam de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo órgão local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha). 1. Preparação de siRNA / PEI Complexo A solução complexa siRNA / PEI é preparada com as instruções do fabricante da seguinte forma: <ol><li> Solução A: Dilui-se a quantidade desejada de siRNA com água estéril (se necessário) até um quarto do volume final e diluir este ainda com solução de glicose a 10% até a metade do volume final. Vortex suavemente ou misture pipetando cima e para baixo. A quantidade ideal de siRNA precisa ser determinada empiricamente, mas 1 mg siRNA em 10 mL solução complexa por animal é um bom ponto de partida para a otimização. </li><li> Solução B: Diluir o volume necessário de reagente PEI com água estéril até um quarto do volume final e diluir esta ainda mais com solução de glicose a 10% até a metade do volume final. Vortex gently ou misture pipetando cima e para baixo. Nota: A quantidade de reagente de PEI determina o equilíbrio iónico no complexo, o que influencia a eficiência da transfecção. Do mesmo modo a quantidade óptima de solução de PEI tem que ser determinado empiricamente. Em nossas mãos, a quantidade ideal é de 0,12 ml de solução de PEI por 1 mg siRNA. </li><li> Misture a solução A com a solução B de uma só vez, vortex suavemente. </li><li> Incubar a solução da mistura durante 15 min à temperatura ambiente antes da sua utilização. Este complexo é estável durante 2 horas à temperatura ambiente e durante 24 horas a 4 ° C. </li></ol> 2. Injeção intratecal <ol><li> Anestesiar o mouse com 3% de isoflurano, até que ele não mostra sinais de reflexo de endireitamento. Além disso, verificar a existência de cauda e / ou pata pitada reflexo para garantir ainda mais o estado de anestesia. </li><li> Raspar a cerca de 2 cm 2 de pele na parte posterior do animal, perto da base da cauda, ​​para facilitar uma melhor visualização durante a inserção da agulha. </li><li> Coloque o mouse emum cone de nariz para uma administração contínua de isoflurano durante o procedimento, reduzir o isoflurano a 1,5%, e cobrir os olhos do rato com lubrificante ocular. </li><li> Prepare o pronto para usar solução mista siRNA usando um 25 mL Hamilton seringa ligada a um 30 G 0,5 na agulha. </li><li> Localize o processo espinhoso da L6, que deve ser um dos mais proeminentes e fixar a coluna de vertebrados em torno desta área, pressionando-o suavemente. </li><li> Insira com cuidado a agulha entre o sulco de L5 e L6 vértebras e observar um movimento de cauda como este signo indica uma entrada bem sucedida da agulha no espaço intradural. Dica: Usando unha, deve-se ser capaz de localizar o sulco também. </li><li> Depois da retirada da cauda é observada, de imediato, mas com cuidado, proteger a posição da agulha com uma mão e injetar o volume desejado de substância com a outra mão lentamente. Dica: um volume entre 5-10 mL é o ideal como o volume de menos de 5 &amp;# 181; l não é confiável e um volume maior que 10 ml leva a muita pressão. </li><li> Uma vez que a injeção é feita, mova o mouse de volta para a jaula para se recuperar da anestesia. </li><li> Repetir esta injecção de, pelo menos, mais duas vezes a cada 24 horas para se conseguir a regulação negativa óptima do gene alvo. </li></ol>

<ol><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse%3A+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li>
<li>Goula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+intravenous+delivery+of+transgenes+to+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.</a> Gene Ther. , 1291-1295 (1998).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55%2C212-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li>
<li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li>
<li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+cannabinoid+%28CB1%29-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection%3A+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li>
<li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice%3A+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Assim, a técnica de injecções intratecais agulhas acima descrito é eficaz, rápida, especificamente localizada, e não destrutivos. Tecnicamente, o aspecto mais importante deste processo é o ponto de inserção da agulha para dentro da ranhura. É fundamental que este procedimento é feito com as mãos e paciência muito calmas. Como muitos procedimentos cirúrgicos, a formação melhora a taxa de injecção com sucesso. Isso também é importante porque durante um experimento real, esta técnica não fornece um indicador óbvio para con...

A medula espinhal é um centro muito importante em uma variedade de processos biológicos fundamentais e as funções fisiológicas, incluindo o processamento e transmissão de dolorosas (nociceptivos) entradas 4-7. Foram desenvolvidas várias técnicas experimentais para facilitar a modulação farmacológica da medula espinal, tais como implantação crónica de cateteres intratecais 8, espinal medula microinjecção, e injecção intratecal de agulha 9. Cada técnica tem as suas próprias vantagens e desvantagens, e dependendo do paradigma experimental uma técnica podem ser mais adequados do que os outros. Considerando a implantação crônica de cateteres intratecal é facilmente viável em ratos, este método é muito difícil no mouse, dado as restrições de tamanho. A taxa de sucesso é muito baixo e os défices motores frequentemente ocorrer devido à presença de um volumoso cateter no espaço subdural severamente confinado no rato. Além disso, a entrega a longo prazo de drogas é processado devido a coagulação freqüentede cronicamente implantados cateteres. Finalmente, as reações imunológicas são comuns. Estes problemas podem ser contornados utilizando o método de injecção intratecal aguda por meio de uma agulha, na ausência de um cateter preimplanted, o que permite uma aplicação rápida e anatomicamente limitado de medicamentos e reagentes para as medulas espinhais em ratinhos. Este método mantém totalmente os benefícios da entrega intratecal sobre outras vias de administração sistémica (por exemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, etc), tais como especificidade de modulação espinal, que permite doses reduzidas e limite de efeitos secundários, bem como a capacidade de fornecer substâncias não fazer normalmente não atravessam a barreira hematoencefálica, uma vez durante a injecção intratecal, a agulha é inserida entre a dura-máter e da medula espinhal. Importante, no entanto, em comparação com outros métodos de administração intratecal, o método de injecção intratecal agulha é o menos invasivos, permitindo numerosas aplicações namesmo animal, sem causar qualquer dano ao tecido considerável ou evocando reação imunológica devido à implantação de material estranho. No entanto, requer habilidades técnicas para uma segmentação muito preciso da agulha para permitir a eficácia. Aqui, nós demonstrar visualmente o método para alcançar uma taxa ótima de sucesso para visando especificamente a medula espinhal lombar. O local de injecção que é escolhida nesta experiência é o sulco entre L5 e L6 coluna vertebrado, perto de onde a medula espinal termina, para minimizar a possibilidade de danificar a coluna. Além disso, demonstramos o uso desta técnica para derrubar genes na medula espinhal usando siRNAs.

<table><tbody><tr><td>In Vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>201-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-36832</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Controle siRNA-A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tubulina III</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-WAVE1</td><td>R& D Systems</td><td>AF5514</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Corante verde rápido</td><td>Sigma</td><td>F-7252</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano configura</td><td>Dr&auml; ger L&uuml; beck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Wella</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa Hamilton Gastight 1702</td><td>Hamilton</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 in 13 mm Agulha</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Primer direto WAVE1 para qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td>WAVE1 primer reverso para qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cttttcaccaacggcatctt</td></tr><tr><td>FastStart Essential DNA Green Master</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo sirna transfecção e gene knockdown em spinal cord via rápida não invasiva lombar intratecal injeções em ratos

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

Este relatório descreve um guia passo-a-passo para a técnica de injeção intratecal de agulhas agudas de forma não invasiva, ou seja, independente da implantação do cateter. A limitação técnica desta técnica cirúrgica encontra-se na delicadeza das mãos. A injeção é rápida, especialmente para um experimentador treinado, e desde rompimento do tecido com esta técnica é mínima, injeções repetidas são possíveis, além disso reação imune a ferramentas externas (. Eg cateter) não ocorre, dando assim uma melhor e mais específico LER de modulação da medula espinal. Uma vez que a aplicação da substância é essencialmente limitada à região alvo da medula espinal, as drogas não precisa de ser aplicado em grandes dosagens, e mais importante, os efeitos indesejados sobre outros tecidos, tal como observado com uma administração sistémica, pode ser contornado 1, 2. Além disso, combinar esta técnica com a transfecção in vivo de ácido nucleico, com a ajuda de polyethylenimine (PEI) de reagente 3, o qual proporciona uma enorme versatilidade para o estudo de funções da coluna vertebral através da administração de agentes farmacológicos, bem como do gene, RNA, e de moduladores de proteínas.

A fim de ilustrar uma injecção bem sucedida, foi realizada utilizando a técnica rápida de corante verde FCF em adultos ratinhos C57Bl6 (8-10 semanas de idade). O animal foi deixado a recuperar durante alguns minutos após a injecção, para dar tempo suficiente para que o corante de espalhar e em seguida sacrificados com uma dose excessiva de CO2. Subsequentemente, a coluna foi dissecado vertebrado e a medula espinhal foi exposta. O puncta azul correspondente ao corante difusa, marcado no local da injecção. Nenh...

Este relatório descreve uma técnica simples e rápida de punção intratecal para a transfecção localizada de siRNA na medula espinhal lombar em rato sob anestesia luz de curta duração.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

O objetivo geral deste procedimento é aplicar localmente ARNi por meio de administração intratecal na medula espinhal. Isso é realizado primeiramente pela preparação do reagente ideal do complexo I-R-N-A-P-E-I. O segundo passo é preparar o camundongo para injeção intratecal.Após pelo menos 15 minutos de tempo de incubação, a solução mista de RNA de interferência é aspirada para dentro de uma seringa Hamilton. O passo final consiste em realizar cuidadosamente a injeção intratecal, repetindo as injeções uma vez a cada 24 horas para garantir a redução ideal. Por fim, imunoblotagem e PCR quantitativa em tempo real.A PCR é utilizada para demonstrar a redução bem-sucedida nos níveis de proteína e de mRNA após a transfeção com INA. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos invasiva do que uma injeção intra-cateter ou na medula espinhal. Geralmente, indivíduos novos neste método precisam treinar para adquirir a habilidade necessária para injetar através de um pequeno sulco entre as colunas vertebrais sem danificar a medula espinhal.Para preparar a solução de SIR, comece diluindo a quantidade desejada de SIR A com água estéril. Em seguida, dilua ainda mais com solução de glicose

in-vivo-sirna-transfection-gene-knockdown-spinal-cord-via-rapid

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Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar...

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

Fonte: Tadokoro, T., et al. Entrega do vetor do vírus adeno-associado subpial 9 (AAV9) em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra uma técnica de injeção subpial para entrega de genes à medula espinhal em camundongos. O procedimento envolve expor a dura-máter, perfurar a pia-máter e injetar um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) carregando um gene que expressa proteína fluorescente no espaço subpial. Após a injeção e recuperação, o vírus facilita a expressão gênica nas...

Entrega de genes subpiais na medula espinhal de camundongos para avaliar a expressão gênica

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Aqui, apresentamos uma técnica in vivo para transferência de genes para células de Schwann (SCs) no nervo ciático de roedores. Esta técnica simples é útil para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos no desenvolvimento e manutenção de SCs mielinizantes.

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Este artigo detalha métodos de administração intratecal para terapias direcionadas ao SNC em camundongos adultos, focando na precisão do protocolo e na possibilitade de injeções repetidas. Inclui descobertas de um estudo de validação em que oligonucleotídeos antissenso reduziram a expressão mutante de SOD1 em camundongos modelo SOD1-ALS, apoiando a utilidade da abordagem em pesquisas pré-clínicas sobre doenças neurodegenerativas.

Injeção intratecal lombar de SOD1-ASOs para direcionamento preciso do SNC e eficácia preditiva em camundongos humanos SOD1-G93A ALS

Aprenda a técnica de transfecção de siRNA na medula espinal lombar de camundongos usando injeção intratecal não invasiva. Este método permite o silenciamento gênico eficiente com anestesia leve.

In Vivo SiRNA transfecção e Gene Knockdown em Spinal Cord via rápida não invasiva lombar intratecal Injeções em Ratos

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