Name: Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a modelar isquemia/reperfusão em C. elegans usando anóxia e inanição. Este protocolo demonstra avaliação de mortalidade, respostas comportamentais e alterações neuronais por microscopia de fluorescência.

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Figuras 1 e 2 foram previamente publicados em Livre Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al. 5) e têm direitos de autor detidos por Elsevier. Este trabalho foi apoiado pelo Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), o Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox los Biomedicina, o Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox los Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) e USPHS GM087483 (KN ). Churrasco é um estudante de doutorado apoiado por uma bolsa FAPESP.

1. C. Crescimento elegans <ol><li> Prepare 35 milímetros Nematode Crescimento Mídia (NGM) placas de ágar semeado com OP50 bactérias, como por métodos de cultivo padrão 1. </li><li> Sincronizar C. elegans, colocando 6 adultos grávidas em uma placa NGM semeado. Retire os adultos após ~ 100 ovos foram estabelecidas (~ hr 3). </li><li> Incubar as placas durante 3 dias a 20 ° C, altura em que os vermes desenvolveram a fase adulta jovem e são ideais para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans são descritos em outro lugar 10. </li></ol> 2. Materiais para AS <ol><li> Tampão M9 (22 mM de KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO4) deve ser purgado de oxigénio foram equilibradas com N 2 (árgon pode também ser usado), durante 30 minutos antes da experiência e mantido rodeado de gelo. </li><li> Faça um pequeno furo (3 mmde largura) na tampa de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga que os vermes serão colocados durante AS. O buraco permite a troca gasosa sem manter a tampa aberta, pois isso pode levar à evaporação excessiva da mídia. </li></ol> 3. Anóxia / Fome <ol><li> Realizar todas as experiências pelo menos em triplicado. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão M9 RT, oxigenado para cada placa de 35 milímetros contendo vermes adultos jovens cultivadas como descrito acima. Tenha cuidado para evitar a remoção de bactérias da placa (adicionar M9 para as bordas onde as bactérias não foram semeadas). Após cerca de 1 min os vermes deve estar nadando no M9. </li><li> Brasão uma ponta de pipeta de 1 ml com BSA por pipetagem e expulsando um estéril solução BSA 1%. </li><li> Incline cuidadosamente a placa contendo os vermes em tampão M9, retire a M9 do mesmo lugar onde foi adicionado, e colocar a suspensão nos microtubos preparados. Deixar em repouso em gelo até que os vermes têm caído para a parte inferior dos tubos (~ 1-2 Minutos). </li><li> Retire a quantidade máxima de M9 possível, sem perturbar os vermes do tubo (deixando cerca de 100 mL), adicionar 1 ml da M9 e gelado purgado em oxigênio e colocar o tubo sobre o gelo até que os vermes se depositam no fundo de novo. Repita o último passo de 3x. Na última lavagem, remover o M9 até ~ 100 ul permanece no tubo. </li><li> Coloque os tubos com os vermes em desoxigenado M9 dentro de uma câmara anóxica / hipóxica (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.1) ou, alternativamente, em um recipiente personalizado selado (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.2). <ol><li> Se um anóxico / hipóxico câmara comercial é para ser usado, deixe alguns M9 purgado dentro da câmara antes de iniciar o passo 3.5 e repita o passo 3.5, uma vez que os vermes estão dentro da câmara. </li><li> Se uma câmara personalizado está a ser utilizado, uma descrição detalhada de como criar um aparelho de baixo custo é apresentado no final de este protocolo e foi descrito por outro grupo anteriormente 11. Resumidamente: <ol&gt; <li> Faça dois furos em uma tampa de 250 ml Tupperware-tipo de recipiente e adicione conectores do tubo para eles. Um vai ser utilizado para injectar a mistura de gás, enquanto o outro será a saída de gás para dentro de um banho de água. </li><li> Colocar os vermes para a câmara e da câmara de vedação com a tampa. </li><li> Gás com um constante fluxo de N2 (100 ml / min). </li><li> Colocar o recipiente dentro de um banho de água a 26 ° C. Certifique-se de que o tubo de saída é bem imerso em água de modo nenhum retorno de ar e que não há fugas no sistema (aparente por bolhas decorrentes da câmara em si). </li></ol></li></ol></li><li> Incubar os vermes, a 26 ° C durante 20 hr. </li></ol> 4. A reperfusão Simulado <ol><li> Depois de 20 horas, sob condições, retire os tubos da câmara de incubação em ar ambiente. </li><li> Pipeta C. elegans com uma ponta BSA-revestido (como no passo 3.3) para um OP50 semeado 35 milímetros placa NGM. Incubar as placas a 20 ° C durante 24 hr.Depois disso, os vermes estará pronto para ser marcado. </li></ol> 5. Identificar Morto Versus vivo Worms <ol><li> Usando uma picareta platina, tocar levemente a parte superior da cabeça do verme. Vermes vivos irá se mover para trás depois de ser tocado. Se os vermes estão sem resposta, marcar como morto. Ocasionalmente, um verme não irá se mover para trás, mas podem apresentar um leve movimento de cabeça de lado a lado. Apesar de não ser tecnicamente morto, esses vermes são quase certo para expirar em questão de horas, e deve ser marcado como morto. Se alguém espera muito tempo para marcar os vermes, choque interno de progênie pode ocorrer e esses &quot;sacos-de-vermes&quot; podem se romper, fazendo detectar as carcaças muito difícil. </li><li> Remova ambos os vermes vivos e mortos da placa como eles são contados para evitar contagens duplicadas. Os vermes vivos pode ser transferida para uma placa separada para realizar ensaios comportamentais. A quantidade de vermes que vivem em relação ao total é representada como a% de vermes sobreviventes (Figura 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Toque Ensaio de Resposta <ol><li> Uma descrição detalhada deste protocolo tem sido apresentada em Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 de Julho de 2006) WormBook, ed. O C. elegans investigação comunitária, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Para marcar a resposta ao toque, identificar vermes que estão se movendo e tocar levemente a lateral da cabeça do verme (perto da parte central da faringe) com um picador de cílios (Figura 3). </li><li> Se o worm se move para trás, a pontuação tão sensível, se não, marcar sem resposta (Figura 1B). Repita este passo 10-15x para cada verme com intervalos de 10 segundos. Sonda pelo menos 10 vermes em cada grupo para ter dados precisos. O mesmo ensaio pode ser usado para avaliar a frente alterações locomotory seguinte toque de luz para a parede do corpo posterior. Cuidado para não tocar na cabeça ou cauda do verme, pois isso estimula um comportamento distinto. </li><li> Finalmente, emestirpes de controlo genético corporativos [N2 Bristol tipo selvagem para, mec (mecanosensorial) mutante positiva para negativa - por exemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar a força com que tocar os vermes. Muito dura de estimulação vai provocar uma resposta comportamental em mutantes mec, muito pouco não vai provocar um efeito em controles de tipo selvagem N2. </li></ol></li></ol> 7. Neuronal Modificações <ol><li> Para visualizar pós AS modificações neuronais, use uma estirpe que expressa GFP no MEC neurônios respondendo toque 4,5. Esses neurônios têm processos longos que correm ao longo da parede do corpo e são facilmente marcados por alterações morfológicas. Além disso, a informação morfológico pode ser integrado com medidas comportamentais da função neuronal, como descrito acima. Uma estirpe, que pode ser usada para esta finalidade é TU2583, que está disponível a partir da C. elegans Genetics Center e contém o transgene integrado uIs25 expressando GFP frosou o mec-18 promotor, ou, alternativamente, TU2562, que contém um mec-3 :: GFP fusão integrado. </li><li> Prepare uma almofada de agarose. <ol><li> Derreter 2% de agarose em água, para trazer 1x M9 com um estoque de 10x, e manter a solução a 70 ° C. </li><li> Colocar uma gota (~ 20 ul) desta solução numa lâmina de vidro (25 mm x 75 mm) que foi colocada entre duas outras lâminas, cada um dos quais com um único pedaço de fita adesiva sobre o seu lado inferior. </li><li> Coloque uma lâmina de vidro final, perpendicular ao primeiro na parte superior da solução de agarose a 2%, e deixá-la arrefecer à temperatura ambiente. Isto deve formar uma almofada que é a espessura da fita. </li><li> Retire o topo de slides e adicione 10 ml de M9 contendo 0,1% de tetramisol, que imobilizam os vermes. </li></ol></li><li> Mova alguns (~ 10) viver vermes na agarose slides 2%. Coloque uma lamela sobre eles e visualizar GFP utilizando um microscópio de fluorescência sob um objetivo 100X com a iluminação adequada. </li><li> Estragadoneurónios irá mostrar uma cadeia citosólica membrana de padrão de pérolas nos processos, composta de punctum múltipla (Figura 2A), e / ou anomalias em que os processos parecem ser quebrada (Figura 2B). Contagem de punctum e anomalias em ambos os neurónios de cada verme, usando um total de pelo menos 10 vermes. </li></ol> 8. Fez-Lab Hipóxica Câmara <ol><li> A Tupperware estilo, recipiente lacrado, hermético pode ser retrofit como uma câmara anóxica. Tome o cuidado de selecionar um recipiente que é tão pequeno quanto possível. Um pequeno recipiente cria um ambiente hipóxico mais rápido e é mais fácil de se encaixar no banho de água (Figura 4). </li><li> Fazer dois furos na tampa (pode ser feito com uma chave de parafusos ou por aquecimento de uma pinça e forçando para a tampa) e inserir um conector de plástico ou de metal que se encaixa no tubo (Figura 5A). Use cola que pode ser colocado debaixo de água, e também fica difícil após a secagem, evitando o movimento deo conector e, portanto, reduzindo a possibilidade de fugas (Figura 5B). </li><li> O recipiente deve ser colocado no banho de água de modo que é completamente submersa (Figura 4). Para mergulhar o recipiente, use um peso garrafa ou um peso de mergulho. </li><li> Um dos tubos de conexão vai ser usada para introduzir uma mistura de gás e o outro tubo irá actuar como um limitador de pressão, pelo que deve ser deixado sob a água de modo que o recipiente é selado a partir do ambiente externo (Figura 4). </li><li> A composição do ar pode ser modulada por meio de gás feito à medida, controladores de fluxo de massa ou qualquer aparelho que mistura os gases desejados. O fluxo de gás deve ser controlado, como de alto fluxo pode criar uma evaporação excessiva. Por exemplo, em um recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gás irá proporcionar boa espaço para os vermes e um fluxo adequado. </li><li> O comprimento da tubagem deve ser mantida a um mínimo, dado que pode ser permeável a gás, umallowing a entrada de O 2. É importante evitar o uso de silicone, tubos Tygon vez que estes materiais são permeáveis ​​a troca de gás. Preferimos tubos de polipropileno ou nylon. Vidro ou tubos de metal manter os gases de bem, mas também são mais difíceis de se trabalhar. </li></ol>

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<li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li>
<li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li>
<li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme%2C+Ndi1%2C+in+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288(2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como tem sido amplamente utilizado em C. elegans para modelar lesão IR. Alguns pontos-chave devem ser destacadas para este protocolo: C. elegans são resistentes a uma grande variedade de lesões, o que justifica a necessidade de 3 insultos concomitantes (calor, fome e anoxia) para alcançar a morte usando este sistema. Não só anoxia não matar os vermes nesta janela de tempo 14. Além disso, o aumento da temperatura é um estresse adicional, por isso é importante acompanhar de perto. Estritamente falando, a fome, não contribui de forma significativa para o grau de mortalidade observada 7, por si só, mas parece reduzir a variabilidade entre experiências em replicado. Dado que não pode haver variabilidade significativa do dia-a-dia, é extremamente importante para comparar amostras executado diretamente em paralelo, e para repetir experiências ao longo de vários dias. Em geral, os resultados são medidos por três placas separadas de 50-100 vermes / condição experimental e estes são osn média e considerado como uma única réplica experimental. Geralmente, entre sete e nove repetições parecem ser suficientes para alcançar ou excluir significância estatística. O estágio de desenvolvimento dos vermes utilizados no experimento também precisa ser cuidadosamente monitorados quanto a suscetibilidade de diferentes estágios de AS dano varia significativamente 15,16. O uso de adultos jovens é padrão, e a fase larval (L3 e L4) vermes parecem ser mais resistentes aos efeitos danosos do AS (dados não publicados). Este protocolo apresenta duas maneiras de realizar os experimentos, um utilizando um aparelho feito em laboratório (usando recipientes Tupperware do tipo e entrada de gás 11) e outro utilizando uma câmara hipóxica comercial 4,6. A anóxia pode ser alcançado por outros meios que consomem o oxigênio, conforme já descrito 13,17. O uso de técnicas alternativas para criar um ambiente hipóxico pode mudar o tempo de incubação necessário ASpara criar a quantidade desejada de morte. Segmentação ~ 20% de sobrevivência é um ponto de partida ideal para estudar as intervenções de proteção, enquanto 80% é igualmente ideal para intervenções que agravam os efeitos prejudiciais de AS. Outra ressalva importante é a hora em que a pontuação observador vermes mortos / vivos. Se o tempo para análise é estendida para além de 24 horas, os dados podem ser enganador pois vermes mortos tornam-se cada vez mais difícil de identificar. Isto pode ser devido a carcaças de vermes de se tornar relativamente transparente ao longo do tempo, mas também para o facto de que os embriões fertilizados pode desenvolver em progenitura post-mortem no interior das carcaças e perturbar eles à medida que surgem. A análise da morfologia neuronal pode ser modificado para analisar os padrões de expressão de proteína de 18, a fragmentação nuclear e 4 outros parâmetros 19 por substituição de uma estirpe de vírus que exprime o marcador geneticamente codificado adequado. Uma advertência final é que a visualização daprocessos neuronais deve ser feito a menos de 30 min depois de colocar os vermes no slide. Os animais mantidos sob anestesia em lâminas por períodos mais longos podem apresentar danos AS-independente. Ajuste a quantidade de animais por slides de acordo com o tempo necessário para rastrear e analisá-los.

C. elegans é um nematóide que tem sido amplamente adotado como um organismo modelo eucariota multicelular desde a sua introdução por Brenner 1. É um modelo simples, barato e versátil, que permite ligações fáceis entre alterações genéticas e fenotípicas muda 2. A isquemia é caracterizada por uma falta de disponibilidade de nutrientes e de oxigénio a um tecido, seguida de reperfusão, quando uma explosão de espécies de oxigénio reactivo é produzida 3 e mais do que ocorre o dano. Em 2002, um modelo de isquemia / reperfusão (IR) em C. elegans foi desenvolvido 4 envolvendo a apresentação de todo o worm a anoxia, privação de nutrientes e estresse por calor por cerca de 20 horas seguido por 24 horas em condições normais. Embora este modelo é tecnicamente um anóxia-fome (AS) condição, a morte das células ocorre através de mecanismos que são conservadas em mamíferos, incluindo os danos induzidos por oxidantes durante a reperfusão &lt;sup&gt; 5. Além disso, semelhante à dos mamíferos IR, dano induzido por AS em C. elegans pode ser prevenida por pré-condicionamento isquémico 6,7 ou pré-condicionamento anestésico 8,9. Os protocolos abaixo demonstram como imitar IR em C. elegans utilizando o modelo AS, como marcar anormalidades morfológicas e comportamentais que resultam de AS, e como adaptar o protocolo de uma maneira que permite que o experimento a ser realizado com um menor investimento inicial usando uma alternativa câmara facilmente construído custom-made .

<table><tbody><tr><td>Cepa N2&nbsp;</td><td>CGC</td><td></td><td>Cepa do tipo selvagem. http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td><td>CGC</td><td>TU2583</td><td>transgene fluorescente integrado usado para rotular neurônios de toque.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>CB1338 mec-3 (e1338)IV</td><td>CGC</td><td>CB1338</td><td>mutante canônico mec-3 que é sensível ao toque.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U Microscópio&nbsp;</td><td>Incubadora de</td> baixa temperatura Nikon <td>USA TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sheldon Manufacturing Inc.</td>Palheta de cílios <td>modelo 2005</td><td></td></tr><tr><td>Um palito de cílios pode ser preparado anexando&nbsp; um cílio em um palito de madeira e, em seguida, anexando o palito em uma pipeta de vidro Pasteur (<forte>Figura 3</forte>).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara Hipóxica</td><td>Coy</td><td>8307030</td><td>Porta-luvas Hipóxico equipado com catalisador de paladium e controlador CO2.</td></tr></tbody></table>

um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; c. elegans</em

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocolos para anoxia / fome no organismo modelo genético C. elegans simular isquemia / reperfusão. Vermes são separados a partir de alimentos de bactérias e colocadas sob anóxia durante 20 horas (isquemia simulada), e subsequentemente transferida para uma atmosfera normal com comida (reperfusão simulado). Este paradigma experimental resultados em aumento da morte e os danos neuronais, e técnicas são apresentados para avaliar a viabilidade do organismo, as alterações na morfologia dos processos de toque de neurónios, bem como a sensibilidade ao toque, o que representa a produção de comportamento da função neuronal. Por fim, um método para a construção de incubadoras hipóxicas utilizando recipientes de armazenamento de cozinha comum é descrito. A adição de uma unidade de controlo de fluxo de massa permite alterações a introduzir a mistura de gás em incubadoras personalizados, e um banho de água circulante permite tanto o controlo de temperatura e torna-o fácil de identificar vazamentos. Este método fornece uma alternativa de baixo custo para comercialmenteunidades disponíveis.

Sujeitar C. elegans e 20 horas de AS a 26 ° C numa câmara de incubação feitos em laboratório, como descrito (secção 3.6.2) resultaram em mortalidade significativa (Figura 1A) 5. Imagem fluorescente subsequente de punctum e quebras nas GFP rotulados processos neuronais de sobreviventes confirmaram a presença de anormalidades morfológicas (Figura 2). Os sobreviventes também responderam mal ao toque parede do corpo de luz (Figura 1B). Este modelo tem sido utilizado por vários grupos para estudar como a predisposição genética, a intervenção farmacêutica e plasticidade metabólica afeta os resultados como dependente 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figura 1. C. elegans sobrevivência e toque resposta apósAS. A) Percentagem de vermes que exibem 24 horas de pós-AS sobrevivência. A cepa N2 é a herança genética do tipo selvagem, e KWN85 contém um transgene integrado que rotula neurônios mec com GFP. B) Resposta ao toque estímulos de viver C. elegans (N2 Strain) após AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figura 2. Toque modificações neuronais após AS. Neurônio Toque (PLML e PLMR) anomalias, tais como processos tortuosos e pausas (a) ou a acumulação de agregados GFP nos processos (B) foram monitorados em sobreviver anestesiados C. eleg<html> ans após AS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figura 3. Escolha pestana. Uma pestana escolha montado. Na inserção, um detalhe do cílio colado à madeira palito. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figura 4. Câmara hipóxica no interior do banho de água fez-Lab. Um recipiente fechado pronto para iniciar a experiência. As setas indicam a entrada e saída de gás eo peso garrafa usada para mantê-lo flutuando. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Detalhes do lado interno e externo da tampa do recipiente. A) do lado externo da tampa do recipiente, indicando o tubo e o seu conector ligado ao anteriormente feito furo. B) do lado externo da tampa do recipiente, indicando que a ligação de tubo ligado ao furo previamente feito.

Um protocolo é descrito que utiliza anoxia / inanição em C. elegans para modelo de isquemia / reperfusão. Os resultados funcionais incluem um aumento da mortalidade, anormalidades visíveis em processos neuronais marcado com GFP, e respostas comportamentais comprometidas que requerem a função neuronal.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

O objetivo geral deste procedimento é simular a isquemia e reperfusão em *C. elegans*. Isso é realizado transferindo *C. elegans* para um microtubo e lavando as bactérias. O segundo passo é criar um ambiente anóxico.Utilizando uma câmara hipóxica fabricada em laboratório, os animais são submetidos à anóxia por 20 horas e, em seguida, colocados em condições aeróbicas após 24 horas. O passo final consiste em avaliar os animais mortos e avaliar a resposta ao toque. Modificações neuronais também são observadas por meio de microscopia de fluorescência.Por fim, a privação de oxigênio em *C. elegans* é utilizada para criar as mesmas condições observadas na isquemia, lesão em eucariotos superiores, em um modelo genético mais simples e flexível. Além disso, as vantagens dessas técnicas em relação aos métodos extintos de fusão isquêmica em células e corações isolados são que *C. elegans* é um modelo genético muito poderoso e também é um organismo de transporte. Os organismos permitem que você utilize várias técnicas e fluidos diferentes. Além disso, estamos mostrando a você como, em vez de usar uma câmara de hipóxia ou ambiental cara, utilizar uma câmara de hipóxia e ambiental caseira, que custará apenas alguns poucos reais.De modo geral, as pessoas individualmente responsáveis por este procedimento devem estar atentas a alguns pontos-chave, como, por exemplo, purgar os buffers, ter muito cuidado ao pontuar os vermes, além de manter constante a quantidade de temperatura utilizada e a quantidade de oxigênio. Todos esses pontos podem alterar o resultado do experimento. Para preparar uma câmara hipóxica personalizada, é possível adaptar um recipiente hermético do tipo Tupperware como uma câmara anóxica. Escolha o menor recipiente possível, pois um recipiente menor cria um ambiente hipóxico mais rapidamente e é mais fácil de acomodar no banho-maria.Faça dois orifícios na tampa com tamanho adequado para acomodar um conector de plástico ou metal que se encaixe no tubo, fixando-o firmemente com cola que possa ser aplicada sob água e que endureça após a secagem, evitando o movimento do conector e, consequentemente, reduzindo a possibilidade de vazamento. Alternativamente, pode-se usar uma arruela de neoprene para ajudar a vedar o conector ao recipiente. Coloque o recipiente no banho-maria de forma que fique completamente submerso.Para imergir o recipiente, utilize um peso para garrafa ou um peso de mergulho. Uma das conexões do tubo será usada para introduzir uma mistura gasosa e o outro tubo funcionará como válvula de alívio de pressão.Portanto, deve-se deixar sob a água para que o recipiente fique selado do ambiente externo. Para iniciar o cultivo de C. elegans conforme descrito no protocolo do texto, prepare o tampão M9 e remova o oxigênio mediante equilíbrio com nitrogênio por 30 minutos antes do experimento, mantendo-o cercado por gelo. Faça um pequeno orifício na tampa de tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro nos quais os vermes serão colocados durante a privação de oxigênio.O orifício permite a troca de gases sem a necessidade de manter a tampa aberta, o que pode levar à evaporação excessiva do meio. Adicione um mililitro de tampão M nove oxigenado na temperatura ambiente a cada placa de 35 milímetros contendo vermes adultos jovens. Tenha cuidado para evitar remover as bactérias da placa.Após aproximadamente um minuto, os vermes devem estar nadando no M nove. Em seguida, recubra a ponteira de uma pipeta de um mililitro com albumina sérica bovina ou BSA, pipetando e expelindo uma solução estéril de 1% de BSA. Incline cuidadosamente a placa contendo os vermes no tampão M nove e remova o M nove do mesmo local onde foi adicionado.Em seguida, coloque a suspensão nos tubos de microcentrífuga preparados. Deixe as amostras em repouso no gelo até que os vermes tenham sedimentado no fundo dos tubos. Remova a maior quantidade possível do meio M nove sem perturbar os vermes no tubo.Em seguida, adicione um mililitro do M nove purgado com oxigênio e resfriado, e coloque o tubo sobre gelo até que os vermes sedimentem no fundo. Repita este passo de lavagem três vezes; na última lavagem, remova o M nove até que aproximadamente 100 microlitros permaneçam no tubo.Em seguida, coloque os tubos com os vermes em tampão M nove desoxigenado na câmara e feche a câmara usando a tampa com fluxo constante de nitrogênio de 100 mililitros por minuto. Coloque o recipiente dentro de um banho-maria a 26 graus Celsius. Certifique-se de que o tubo de saída esteja bem imerso na água para que nenhum ar retorne e de que não haja vazamentos no sistema.Prossiga com a incubação dos vermes a 26 graus Celsius por 20 horas. Após a incubação, pipete o *Elegans do mar* com uma ponteira revestida com BSA em uma placa de 35 milímetros contendo meio de crescimento para nematoides. Incube as placas a 20 graus Celsius por 24 horas. Após esse período, os vermes estarão prontos para serem avaliados.Usando um palito de platina, toque levemente a parte superior da cabeça do verme vivo. Os vermes se moverão para trás após o toque; se os vermes não responderem, classifique-os como mortos. Ocasionalmente, um verme pode não se mover para trás, mas pode exibir um leve movimento lateral da cabeça; embora tecnicamente não esteja morto, esse verme quase certamente morrerá nas próximas horas e deve ser classificado como morto.Repita esta etapa de 10 a 15 vezes para cada verme, com intervalos de dez segundos. Analise pelo menos 10 vermes em cada grupo para obter dados precisos para visualizar a privação pós-anóxia e modificações neuronais. Utilize uma linhagem que expresse a proteína verde fluorescente ou GFP nos neurônios mecânicos responsivos ao toque.Coloque uma gota de solução de ARO 2% sobre uma lâmina de vidro posicionada entre duas outras lâminas que tenham um único pedaço de fita adesiva em seu lado inferior. Coloque uma lâmina de vidro final perpendicularmente à primeira, sobre a solução de ARO 2%, e deixe esfriar à temperatura ambiente. Isso deve formar uma camada com a espessura da fita adesiva.Em seguida, remova a lâmina superior e adicione 10 microlitros de M nove contendo 0,1% de tetra aole, o que imobilizará os vermes. Transfira cerca de 10 vermes vivos para a lâmina de 2%aro e coloque uma lamínula sobre eles. Visualize a GFP usando um microscópio de fluorescência com objetiva de 100 x e a iluminação apropriada.Neurônios danificados exibirão um padrão citosólico do tipo colar de pérolas nas projeções, composto por múltiplos pontos e/ou anormalidades, onde as projeções parecem estar rompidas. Conte os pontos e as anormalidades em ambos os neurônios de cada verme, utilizando um total de pelo menos 10 vermes. Submeter *Caenorhabditis elegans* a 20 horas de anóxia e inanição a 26 graus Celsius em uma câmara de incubação personalizada resultou em mortalidade significativa.Os sobreviventes também responderam mal ao toque leve na parede corporal. A subsequente imagem fluorescente de pontuações e interrupções nos processos neuronais rotulados com GFP dos sobreviventes confirmou a presença de anormalidades morfológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como promover a isquemia.Uma observação no laboratório feita em câmaras hipóxicas permite também medir a morte celular e modificações neurológicas na Seattle Elegance. Este modelo tem sido utilizado por diversos grupos para estudar como íons naturais, provenientes de diversas intervenções e do metabolismo, podem influenciar a sobrevivência e a morte em condições hipóxicas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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