Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

O objetivo geral do seguinte experimento é observar a expressão gênica transitória de um repórter marcado com GFP em células epidérmicas de folhas de tabaco. Isso é alcançado primeiramente projetando um construto de DNA que será expresso nos cloroplastos e peroxissomos. O construto é então montado utilizando amplificação por PCR e montagem Gibson.

Em seguida, uma pistola de genes é utilizada para entregar o construto às células epidérmicas da folha de tabaco. Por fim, a análise da folha de tabaco por microscopia confocal revela a expressão da GFP no cloroplasto e no peroxissomo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a clonagem clássica, é que ela não requer enzimas de restrição e, portanto, qualquer sequência que possa ser amplificada por PCR pode ser clonada.

Devido à flexibilidade do design genético, as aplicações dessas técnicas se estendem a uma escala maior. A engenharia genética de plantas agrícolas começa este protocolo determinando os sítios dentro da célula vegetal para a expressão final da proteína. Para este trabalho, o objetivo é direcionar a expressão para o cloroplasto, peroxissomo e citosol.

Em seguida, projete o construto de expressão. O construto deve conter um promotor, um gene detectável e um terminador dentro de um único plasmídeo. Neste caso, o promotor constitutivo P end cup two induz a expressão de GFP, que é seguida pelo terminador Nolene Synthe, ou nos t.

Observe que, neste experimento, testaremos uma série de sequências sinalizadoras — trit, um, dois e três — expressas no terminal N-terminal da GFP para expressão em cloroplastos e peroxissomos. O método de montagem Gibson depende da ação de várias enzimas em uma mistura pré-fabricada, que digere parcialmente as extremidades do DNA de dupla fita e facilita o emparelhamento de pares de bases complementares de sequências de DNA adjacentes. O construto final possui três partes que devem ser amplificadas em quatro reações de PCR antes da montagem Gibson.

As primeira e segunda reações amplificam um vetor plasmidial de 8.000 pares de bases, PORE, que contém GFP NOS T e um marcador de resistência a canamicina. O marcador de resistência é um bom local para dividir esse DNA grande em dois modelos menores, que são mais facilmente amplificados por PCR. A terceira reação amplifica o promotor P end cup dois, e a quarta reação amplifica o triag um usando software de design in silico, como o ape design, montando o construto base por base, de modo que haja uma sobreposição de 50 pares de bases entre cada fragmento.

Ao solicitar primers para PCR, é possível utilizar a sobreposição de 50 pares de bases como primers com 25 pares de bases em cada direção. Após realizar a PCR para amplificar cada componente, purifique o produto da PCR separadamente e dilua-os em água destilada e desionizada. Se o molde de PCR foi uma mini-preparação de *E. coli* tratada com a enzima de restrição DpnI, remover-se-á o DNA do molde contaminante. Em seguida, meça as concentrações de cada um dos fragmentos de DNA.

Ajuste a concentração do vetor para aproximadamente 150 nanogramas por microlitro para cada construto a ser montado, incluindo um controle. Retire uma alíquota de 15 microlitros da mistura de montagem Gibson do congelador e descongele-a em gelo. Utilizando a ferramenta gratuita online @gibbon. org, determine os volumes correspondentes a quantidades equimolares de cada um dos fragmentos.

Adicione o volume calculado de cada um dos fragmentos à mistura Gibson de 15 microlitros. Prepare também um controle contendo apenas o DNA do vetor. O volume total de cada reação deve ser de 20 microlitros.

Use água para ajustar o volume, se necessário. Incube os tubos a 50 a 55 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Após a incubação, coloque os tubos de volta no gelo.

Retire um tubo microfuge contendo uma preparação comercial de 200 microlitros de *E. coli* competente em cloreto de cálcio de um congelador a menos 80 graus Celsius e aqueça-o levemente com a mão. Em seguida, adicione os 20 microlitros da reação ao *E. coli*. Incube as culturas no gelo por 30 minutos, depois transfira-as para um banho-maria a 42 graus Celsius e submeta-as a choque térmico por 60 segundos.

Não utilize células eletrocompetentes. A concentração relativamente alta de sal e a baixa concentração de DNA podem causar arco nas células após a transformação. Retorne as culturas ao gelo por dois minutos, então adicione 750 microlitros de meio SOC ou LB e permita que recuperem por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Na próxima placa, incubar a mistura em placas de LB com canamicina ou outro antibiótico apropriado a 37 graus Celsius durante a noite e analisar 10 colônias por sequenciamento. Observe que este método pode resultar em um fundo mais alto e em um maior número de eventos de recombinação não direcionados em comparação com o clonagem tradicional baseada em ligação. A transformação biológica de tabaco com uma pistola de genes foi previamente descrita no JoVE.

Aqui, são revisados os principais passos e diferenças em relação aos protocolos anteriores. Após amplificar e isolar as construções, prepare os projéteis para a pistola de genes conforme descrito no artigo do JoVE por woods e zeto e carregue-os na pistola de genes para transfeção do tecido epidérmico de folhas de Nico Tania Benham Miana tobacco. Escolha uma folha grande próxima à base de uma planta com três a cinco meses de idade.

Coloque cuidadosamente com a face inferior voltada para cima sobre toalhas de papel úmidas em uma placa de Petri de 15 centímetros, usando proteção adequada para os olhos e ouvidos. Ajuste a pressão de hélio do canhão de genes para 200 a 250 PS.I. Aponte cuidadosamente o canhão de genes entre as nervuras na face inferior de uma folha, a cerca de três a cinco centímetros acima dela. Libere o segurança e entregue as partículas à folha.

Use cada projétil duas vezes no mesmo local da folha. Mude para outro local e repita o processo se a folha explodir, descarte-a e comece com uma nova folha. Existe alguma variação na resistência da folha devido às condições de crescimento, como idade, umidade, entre outras.

Após todas as aplicações, cubra a folha e armazene-a por dois a três dias em baixa luminosidade sobre a bancada. Examine a folha em um microscópio estereoscópico equipado com fluorescência UV e procure células individuais expressando GFP. Quando células expressando GFP forem encontradas, use uma tesoura de dissecação para extrair cuidadosamente seções de folha de cinco a dez milímetros.

Mergulhe imediatamente cada fragmento foliar individual no poço de uma lâmina de microscopia de poço profundo contendo cerca de 200 microlitros de Triton X 100 a 0,1%. O detergente ajuda a prevenir a formação de bolhas de ar na superfície, e a lâmina de microscopia de poço profundo permite uma área maior de imagem para análise celular utilizando um microscópio confocal equipado com filtros apropriados e uma objetiva imersão em água de 40 x. Neste estudo, os três diferentes construtos de marcação de organelas com GFP foram comparados ao GFP não marcado e a rubis.Coag.

A microscopia confocal de GFP foi utilizada para detectar a fluorescência de GFP em células individuais transformadas de forma transitória em experimentos controle nos quais o GFP não marcado foi expresso. A fluorescência é observada somente no núcleo e no citosol, mas não nos cloroplastos, que são identificados pela autofluorescência vermelha da clorofila, como visto neste exemplo de uma célula transfectada com um construto de GFP apenas no cloroplasto Rubis Oag. O construto GFP foi expresso nos grandes organelas.

A célula está delineada em branco. O amarelo indica áreas de colocalização do construto com clorofila, indicando que o construto é direcionado ao cloroplasto, como mostrado nesta imagem de uma célula transfectada com triag um: a expressão de GFP é observada no cloroplasto, nas periferias, no citosol e em pequenas organelas pontuadas, acreditadas como peroxissomos. Da mesma forma, células transfectadas com triag dois também expressam GFP no cloroplasto, no citosol e nos peroxissomos. O triag três, que consiste em um sinal de peroxissomo inserido dentro de uma região de baixa complexidade da sequência do cloroplasto, localiza-se apenas no cloroplasto e no peroxissomo.

Observe que esta célula está em uma camada foliar diferente. Esta figura resume a expressão observada nos compartimentos de uma célula epidérmica típica de folha de tabaco. Os tamanhos e localizações relativos dentro da célula são mostrados, assim como os níveis relativos de expressão observados por meio de transfeção por partículas e microscopia confocal.

Observe que a GFP sem marcação se localiza no citosol e no núcleo, o controle PIMT dois GFP se localiza no cloroplasto e triag um GFP, triag dois GFP e Triag 3G FP se localizam no cloroplasto e peroxissomo, conforme previsto. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir um plasmídeo com montagem Gibson, entregá-lo diretamente nas folhas de tabaco e observar a expressão da GFP em até três dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar 150 nanogramas por microlitro de DNA do vetor para a montagem Gibson e 1500 nanogramas por microlitro do seu construto final de DNA para preparar suas balas de canhão genético. Após este procedimento, outros métodos, como a transfeção com agrobactéria, podem ser realizados para obter expressão gênica estável em vez de transitória.