Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

O objetivo geral do experimento a seguir é observar a expressão gênica transitória de um repórter marcado com GFP em células epidérmicas da folha do tabaco. Isso é conseguido primeiro projetando uma construção de DNA que será expressa no cloroplasto e nos peroxissomos. A construção é então construída usando amplificação de PCR e montagem de Gibson.

Em seguida, uma arma genética é usada para entregar a construção às células epidérmicas da folha do tabaco. Em última análise, a imagem da folha de tabaco por microscopia confocal revela a expressão de GFP no cloroplasto e no peroxissomo. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a clonagem clássica, é que ela não requer enzimas de restrição e, portanto, qualquer sequência que possa ser amplificada por PCR pode ser clonada.

Devido à flexibilidade do design genético, as aplicações dessas técnicas se estendem a uma escala maior. Engenharia genética de plantas agrícolas Comece este protocolo determinando os locais dentro da célula vegetal para a expressão final da proteína. Para este trabalho, o objetivo é direcionar a expressão para o cloroplasto, peroxissomo e citosol.

Em seguida, crie a construção da expressão. A construção deve conter um promotor, um gene detectável e um terminador dentro de um único plasmídeo. Neste caso, o promotor constitutivo P end cup two impulsiona a expressão de GFP, que é seguida pelo Nolene Synthe, terminator ou nos t.

Observe que, neste experimento, testaremos uma série de tags, trit tags, um, dois e três terminais finais expressos para GFP para expressão em cloroplastos e peroxissomos. O método de montagem de Gibson depende da ação de várias enzimas em uma mistura pré-fabricada para digerir parcialmente as extremidades do DNA de fita dupla e facilitar o recozimento de pares de bases complementares de sequências de DNA vizinhas. A construção final tem três partes que devem ser amplificadas em quatro reações de PCR antes da montagem de Gibson.

A primeira e a segunda reações amplificam um vetor plasmidial de 8.000 pares de bases, PORE, que contém GFP NOS T e um marcador de resistência a canas. O marcador de resistência é um bom local para dividir esse DNA grande em dois modelos menores que são mais facilmente amplificados por PCR. A terceira reação amplifica o promotor P end cup two, e a quarta reação amplifica triag um usando software de design in silico, como o design do macaco, a base de construção para a base, de modo que haja uma sobreposição de 50 pares de bases entre cada peça.

Ao solicitar primers para PCR, é possível usar a sobreposição de 50 pares de bases, pois os primers 25 pares de bases em cada direção Depois de realizar a PCR para amplificar cada componente, purifique o produto de PCR separadamente e dilua-os em água destilada deionizada. Se o modelo de PCR foi uma mini preparação do tratamento com e coli com a enzima de restrição DPN, remove-se o DNA do molde contaminante. Em seguida, meça as concentrações de cada uma das peças de DNA.

Ajuste a concentração do vetor para aproximadamente 150 nanogramas por microlitro para cada construção a ser montada, incluindo um controle, retire uma alíquota de 15 microlitros da mistura Gibson Assembly do freezer e descongele-a no gelo. Usando o tool@gibbon de código aberto online. org, determine os volumes para quantidades equimolares de cada um dos fragmentos.

Adicione o volume calculado de cada um dos fragmentos à mistura Gibson de 15 microlitros. Prepare também um controle apenas do DNA do vetor. O volume total de cada reação deve ser de 20 microlitros.

Use água para ajustar o volume, se necessário. Incube os tubos a 50 a 55 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Após a incubação, coloque os tubos de volta no gelo.

Remova um tubo de micro fuga contendo uma preparação comercial de 200 microlitros de cloreto de cálcio competente e coli de um freezer de 80 graus Celsius negativos e aqueça-o levemente com a mão. Em seguida, adicione todos os 20 microlitros da reação à e coli. Incube as culturas no gelo por 30 minutos, depois transfira-as para um banho-maria a 42 graus Celsius e choque térmico por 60 segundos.

Não use células eletrocompetentes. A concentração relativamente alta de sal e a baixa concentração de DNA podem fazer com que as células se arqueiem após a transformação. Retorne as culturas ao ICE por dois minutos, depois aplique 750 microlitros de meio SOC ou LB e deixe-as recuperar por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Na próxima placa, a mistura em placas LB com cana ou outro antibiótico apropriado incuba a 37 graus Celsius durante a noite 10 colônias por sequenciamento. Observe que esse método pode resultar em um plano de fundo mais alto e um número maior de eventos de recombinação não alvo do que a clonagem tradicional baseada em ligação. A transfecção biótica do tabaco com uma arma genética foi descrita anteriormente em JoVE.

Aqui, as principais etapas e diferenças são revisadas em relação aos protocolos anteriores. Depois de amplificar e isolar as construções, prepare as balas da arma genética conforme descrito no artigo JoVE por woods e zeto e carregue-as na arma genética para transfecção do tecido epidérmico da folha de tabaco de Nico Tania Benham Miana. Escolha uma folha grande perto da base de uma planta de três a cinco meses.

Coloque-o com cuidado com a parte inferior para cima em toalhas de papel molhadas em uma placa de Petri de 15 centímetros usando proteção adequada para os olhos e ouvidos. Defina a pressão de hélio para a arma genética para 200 a 250 PS. Eu cuidadosamente aponto a arma genética entre as costelas na parte inferior de uma folha, cerca de três a cinco centímetros acima dela. Libere a segurança e entregue as partículas à folha.

Use cada bala duas vezes no mesmo local na folha. Vá para outro local e repita o processo se a folha explodir, descarte e inicie uma nova folha. Há alguma variação na tenacidade das folhas devido às condições de crescimento, como idade, umidade, etc.

Depois que todas as doses forem aplicadas, cubra a folha e guarde-a por dois a três dias com pouca luz na bancada. Examine a folha em um microscópio de dissecação equipado com fluorescência UV e procure células individuais que expressem GFP. Quando forem encontradas células que expressam GFP, use uma tesoura de dissecação para extrair cuidadosamente seções de cinco a 10 milímetros da folha.

Mergulhe imediatamente cada fragmento de folha individual no poço de uma lâmina de microscópio de poço profundo contendo cerca de 200 microlitros de 0,1% Triton X 100. O detergente ajuda a evitar a formação de bolhas de ar na superfície e a lâmina do microscópio de poço profundo permite células de imagem de área de imagem de tecido maiores usando um microscópio confocal equipado com os filtros apropriados e uma objetiva de imersão em água de 40 x. Neste estudo, as três diferentes construções de direcionamento de organelas GFP foram comparadas com GFP não marcada e rubis. Coag.

A microscopia confocal GFP foi usada para detectar fluorescência GFP nas células individuais transitoriamente transformadas em experimentos de controle nos quais a GFP não marcada foi expressa. A fluorescência é observada apenas no núcleo e no citosol, mas não no cloroplasto, que são identificados pela autofluorescência vermelha da clorofila, como visto neste exemplo de uma célula transfectada com um cloroplasto apenas Rubis Oag. Construto GFP GFP foi expresso nas grandes organelas.

A célula é contornada em branco. O amarelo indica áreas de colocalização da construção com clorofila, indicando que a construção é direcionada ao cloroplasto, como mostrado nesta imagem de uma expressão de GFP de célula transfectada triag one é vista no cloroplasto, periferias, citosol e pequenas organelas pontilhadas que se acredita serem peroxissomos. Da mesma forma, triag duas células transfectadas também expressam GFP no citosol do cloroplasto e peroxissomos triag três, que consiste em um sinal de peroxissomo embutido em uma região de baixa complexidade da sequência do cloroplasto, localizado apenas no cloroplasto e no peroxissomo.

Observe que esta célula está em uma camada folha diferente. Esta figura resume a expressão observada nos compartimentos de uma célula epidérmica típica da folha do tabaco. Os tamanhos e localizações relativos dentro da célula são mostrados e os níveis de expressão relativa observados por meio de transfecção de arma genética e microscopia confocal.

Observe que a GFP não marcada localiza-se no citosol e no núcleo, o controle PIMT duas GFP localiza-se no cloroplasto e triag uma GFP, triag duas GFP e Triag 3G FP localizado no cloroplasto e peroxissomo conforme previsto, Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um plasma com montagem de Gibson, entregá-lo bally às folhas de tabaco e observar a expressão de GFP em três dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar 150 nanogramas por microlitro de DNA vetorial para a montagem de Gibson e 1500 nanogramas por microlitro de sua construção final de DNA para fazer suas balas de arma genética Após este procedimento, outros métodos, como a transfecção de agrobactérias, podem ser realizados para obter uma expressão gênica estável em vez de transitória.