Name: Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a realizar expressão gênica transiente em células epidérmicas de tabaco usando Assembleia Gibson e gene gun. Este método simplifica a clonagem sem enzimas de restrição e permite visualização por microscopia confocal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Jen Sheen do Hospital Geral de Massachusetts para a generosa doação de mudas de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ajudou muito no conselho em cultivo de plantas ea criação de uma área de câmara de crescimento. Tom Ferrante, do Instituto Wyss ofereceu ajuda fundamental com microscopia confocal. Os autores gostaria especialmente de agradecer Don Ingber do Hospital Infantil de Boston e do Instituto Wyss para a generosa doação de um Gene Gun e suprimentos associados. O financiamento para este projeto foi fornecido por meio de um acordo de cooperação com o Departamento de Energia Projetos de Pesquisa Avançada Agência (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, e MdM, e através Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.

1. Projeto de Seqüências Alternativamente-emendados para vários Organelle Segmentação <ol><li> Determinar os locais de expressão de proteína final. Para este trabalho, o interesse é na segmentação do cloroplasto, peroxissomo e citosol. </li><li> Use a literatura para identificar seqüências de proteínas e de DNA conhecidos como alvo proteínas para organelas de interesse. Neste caso, uma sequência de direccionamento a partir de cloroplastos de Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferase 6,15, e uma sequência de direccionamento de peroxissoma de Arabidopsis thaliana, como a transtirretina-S-alantoína sintase 16,17 foram determinados. </li><li> Identificar um regime-splicing alternativo que deve direcionar as proteínas de interesse para as organelas corretas. Para este trabalho, splice sites, observada num sistema de Arabidopsis naturais 6. A seqüência de mRNA foi redesenhado deixando os locais de splicing naturais, mas as sequências foram colocadas de codificação-cloroplastos ou peroxisome-targeting tags dentro dos íntrons alternativamente-emendados (Figura 1). </li></ol> 2. Assembléia Gibson de Peças de DNA Veja também a Figura 2. O método de montagem Gibson depende da ação de várias enzimas em uma mistura pré-fabricados a 1) digerir parcialmente as extremidades do DNA de cadeia dupla de fazer cadeias simples e 2) anneal pares de bases de cortesia da vizinha partes de DNA. Isto permite a clonagem de fragmentos de DNA, sem as limitações de locais de restrição. <ol><li> Escolher uma ordem para os elementos na construção de plasmídeo de ADN. Como exemplo TriTag-1 tem elementos de: a) um vector de plasmídeo (poro, contendo uma construção de GFP conhecido para trabalhar em plantas, um marcador de resistência a canamicina, e origens de replicação para E. coli e Agrobacterium tumefaciens hospedeiros), b) um sequência de promotor, (P ENTCUP2, expressa constitutivamente em plantas), C) uma sequência de direccionamento do cloroplasto (CTS), c) uma sequência de peroxissoma (PTS), e d alvo) de uma série de locais de união, tal como descrito anteriormente 6. </li><li> Projetar o base-para-base de construção com em software de projeto silico. Macaco é um pacote gratuito de código aberto útil para este trabalho. Nota: TriTag-1, tem a ordem: plasmídeo vetor, promotor, ATG, local dador, seqüência alvo cloroplasto, área doadora emenda, local neutro, local aceitante emenda, seqüência alvo peroxisome, local aceitante emenda, GFP como contido no plasmídeo vetor . <ol><li> Projetar o in silico construção de DNA de tal forma que há uma sobreposição de 50 pb entre cada peça ao encomendar primers para PCR. É possível usar a sobreposição de 50 pb, como iniciadores: 25 pb cada direcção. <ol><li> Certifique-se de manter o controle da origem de cada uma das peças de seqüência. É como: um plasmídeo a ser cultivadas e miniprepped; uma sequência linear que podem ser utilizados como um molde de PCR; ou uma sequência que terá de sersintetizado comercialmente? Várias empresas oferecem serviços de síntese de DNA de baixo custo para os fragmentos &lt;500 pb. Neste caso, o próprio TriTag é de 437 pb, pelo que foi vantajoso por ordem comercialmente. </li><li> Os melhores resultados virão se todos os fragmentos são amplificados por PCR e purificou-se a partir deles o DNA molde. O marcador de resistência é um bom local para dividir esta grande de ADN em dois modelos menores, que são mais facilmente amplificado por PCR. </li><li> Enzima de restrição Dpnl restrição corta DNA metilado. Se o molde de PCR era uma miniprep de E. coli, o tratamento Dpnl irá remover o ADN molde contaminante. </li></ol></li></ol></li><li> Purificar todas as seqüências de DNA separadamente e eluição em água, TE ou tampão EB. <ol><li> Pore ​​vetor parte 1, ~ 3000 pb (setas verdes). Amplificado por PCR e Dpnl tratada. </li><li> Pore ​​vetor parte 2, ~ 3000 pb (setas pretas). Amplificado por PCR e Dpnl tratada. </li><li> TriTag inserção, 437 bp (setas azuis). Ordenada comercialmente. Resuspend em DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promotor, ~ 750 bp (setas laranja). Amplificado por PCR e Dpnl tratada. </li></ol></li><li> Medem-se as concentrações de cada uma das partes de ADN. Apontar para 150 ng / mL das peças vetoriais. </li><li> Tome uma alíquota do mix montagem Gibson fora do freezer e descongelar em gelo. Isto está comercialmente disponível, mas também simples de fazer no laboratório 12-14. <ol><li> Há duas etapas para esta receita: um master mix 5x viscoso e 15 ul alíquotas 1.33x reação porte. A mistura principal 5x contém: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de MgCl2, 600 ul de 10 mM de cada dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, e ddH 2 O 6 ml. Prepare 320 mL alíquotas (18) e congelar todos, mas um a -20 ° C. A solução irá ser bastante viscoso. Rotular essas &quot;tampão isotérmica 5X&quot; </li><li> Para o restante (320 mL), adicionar 1,2 mL T5 exonuclease, 20 ul Phusion alta-FIDElity DNA polimerase, 160 uL de Taq ADN ligase e 700 ul ddH 2 O. Preparar 15 mL alíquotas (~ 80) em gelo em tubos de PCR e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Determinar os volumes de quantidades equimolares de cada um dos fragmentos. Existem algumas calculadoras on-line, incluindo Gibthon.org. Deve haver um total de 5 mL de todas as partes de ADN. Adicione-os a 15 mL Gibson misturar alíquota. Se isto requer volumes muito pequenos a pipeta, diluir os fragmentos de DNA e / ou de usar mais do que uma alíquota. <ol><li> Não se esqueça de preparar um controle do DNA vetor sozinho (por exemplo, a parte do DNA que contém o marcador de resistência a antibióticos) e completar o volume com água. </li></ol></li><li> Incubar os tubos num ciclizador térmico a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Substituir no gelo e se transformar em E. coli através de choque térmico células quimicamente competentes. Não use pilhas electrocompetentes. A concentração elevada de sal e a concentração relativamente baixa de ADNpode fazer com que as células de arco. <ol><li> Aplicar todos os 20 ul de uma preparação comercial de 200 ul de cálcio-cloreto de E. competente coli. Incubar em gelo 30 min e choque térmico de 60 seg a 42 ° C </li><li> Retornar ao gelo 2 min, aplicar 750 ul de meio LB SOC ou recuperar e agitação num tubo de microcentrifugação de 30 minutos a 37 ° C. Placa da mistura e diluições apropriadas em LB + Kan (ou outro antibiótico apropriado). Isso pode resultar em maior fundo (e um maior número de eventos de recombinação não-alvo) do que o tradicional clonagem baseada ligadura mas vale a pena para a tela cerca de 10 colônias. </li></ol></li><li> Confirmar clone através de sequência e armazenar-se uma alíquota a -80 ° C </li></ol> 3. Biobalística transfecção de tabaco com o Gene Gun Esta é uma técnica que está estabelecida em Jove 18,19. As principais etapas e as diferenças são descritas a seguir. <ol><li> Crescer 50-100 ml E. coL ou 200 ml de Agrobacterium. A cultura-prep Maxi. Uma concentração de cerca de 1.500 ng / mL é necessário para continuar. </li><li> Prepare gene arma balas como descrito anteriormente. Coloque-os no Gene Gun. </li><li> Para a transfecção de Nicotiana benthamiana tabaco tecido foliar da epiderme, escolha uma folha grande perto da base de uma planta de 3 meses de idade. Cortá-la com cuidado e coloque-o lado de baixo para cima em papel-toalha molhada em um prato de 15 centímetros de Petri. </li><li> Ajuste a pressão Ele para o Gene Gun para 200-250 psi. </li><li> Procurar com cuidado o Gene Gun entre as nervuras no lado inferior de uma folha, a cerca de 3-5 cm acima dela. Solte a segurança e entregar as partículas para a folha. Cada bala pode ser usada duas vezes no mesmo local sobre a folha. Se as folhas explode, descartar e começar uma nova folha-haja alguma variação na dureza foliar, devido às condições de crescimento, tais como a idade, umidade, etc Para uma folha de 12 cm, à espera de encaixar cerca de 6 tiros. </li><li> Armazenar a folha, coberto com a parte superior de umPlaca de Petri para 2-3 dias com pouca luz no banco. </li><li> Examine a folha em um microscópio de dissecação equipado com fluorescência UV, e procurar por células individuais que expressam GFP. Dissecar 5-10 seções mm de folha. </li><li> Mergulhe a folha em um slide poço profundo microscópio em ~ 200 mL de 0,1% Triton X-100. O detergente ajuda a impedir que as bolhas de ar formando na superfície, e o poço de lâmina de microscópio permite uma área de imagem de tecido maiores. </li></ol> 4. Microscopia confocal do tecido Transfectadas Estas instruções variam para cada instrumento, por isso é essencial para se devidamente treinado. <ol><li> Para os experimentos de detecção de fluorescência, definir o laser de excitação a 489 nm, e definir os detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para fluorescência da GFP e 630-700 nm para clorofila auto-fluorescência. Células de imagem usando um objetivo de imersão em água 40x. </li></ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
<li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+plant+splicing+code%3A+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li>
<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
<li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li>
<li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5%27-+and+3%27-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li>
<li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li>
<li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li>
<li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5%27+mRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, as estratégias simples são descritos para a localização de uma única proteína transgénica para vários compartimentos celulares em plantas. O objetivo era projetar construção que expressasse um único gene em mais de uma organela em Nicotiana benthamiana. As estratégias incluem desenho racional de construções de DNA baseado em GFP, montagem Gibson, a entrega dos plasmídeos de células da folha com o Gene Gun, e observação dos resultados com a microscopia confocal. Três, t...

Este trabalho é um projeto de engenharia biologia / sintético metabólica em que as células de plantas são projetados para expressar uma proteína repórter em várias organelas, mas com apenas uma única construção de DNA. Uma abordagem para proteínas alvo de mais do que um local envolve múltiplas cópias genéticas de clonagem, contendo cada um péptido localização diferente. Cada cópia deve ser introduzido por sucessivas retransformação ou, alternativamente, por retrocruzamentos transforms solteiro 1. Isto envolve a clonagem adicional, e é limitada por uma etiqueta de localização por terminal. Outra maneira para localizar uma proteína de múltiplos locais é através de splicing alternativo 2-5. O RNA é transcrito a partir de um único gene, mas cópias diferentes da transcrição são processados ​​de maneira diferente, muitas vezes em mais do que uma maneira por célula. Isto pode resultar em mais do que um ARN mensageiro na célula transcrito a partir de um único gene. Estes messenge diferenteRNAs r pode codificar para diferentes isoformas da mesma proteína, ou no caso de uma mudança de enquadramento, uma proteína completamente diferente. Apesar de splicing alternativo foi descrito na literatura durante muitos anos, os mecanismos de acção e de doador conservada e locais de união de receptor apenas estão a ser elucidados mais recentemente 6. Como estes sites estão sendo mais bem descrito, abrem-se oportunidades para a engenharia. Engenheiros metabólicos da planta são confrontados com um desafio ao expressar uma proteína em várias organelas. Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes, cada uma com uma sequência de sinal separado dirigindo-a para o organelo de interesse. Para um único gene em três organelas, este é simplesmente três genes. Mas, para uma via metabólica de seis genes, esta expande-se para 18 genes, um esforço significativo clonagem. Combinando várias seqüências de localização em um sinal de um único gene, alternativamente emendadosificantly reduz esse esforço. Por exemplo, fotorrespiração reengenharia 7,8 e síntese isoprenoid 9,10 envolve tanto os cloroplastos e peroxissomos. No nosso caso, se aproveitou de locais de splicing como observado em um sistema de Arabidopsis thaliana naturais descrito anteriormente 6. Nós racionalmente redesenhado a sequência de mRNA deixando os locais de splicing naturais sozinho, mas colocado sequências que codificam alvos-peroxissoma-cloroplasto ou dentro dos intrões alternativamente emendados (Figura 1). A proteína expressa pode ou não ter uma etiqueta, dependendo se o pré-ARNm que codificava foi excisada como um intrão (Figuras 1g e 1h). Para mais informações sobre o projeto das construções apresentadas neste trabalho, consulte o artigo do companheiro 11. Porque este é ainda um esforço significativo clonagem, montagem Gibson, um novo método para a clonagem de arquétipos de ADN, é used na construção. O método de Gibson pode ser usado para qualquer sequência, independentemente de sítios de restrição (Figura 2) 12-14. A combinação específica de enzimas permite um único passo, a montagem isotérmico. Neste método, diversas peças de ADN de cadeia dupla linear são concebidos de tal modo que eles têm sequências sobrepostas de ~ 50 pb. A mistura de enzimas montagem Gibson digere parcialmente as partes de ADN lineares, expondo cadeias simples de seqüências homólogas. Estas sequências de cadeia simples parciais são re-recozido na mistura de reacção, resultando em um, de uma etapa, independente da sequência, de reacção rápida subclonagem livre de ligação. Este trabalho descreve um) projeto racional construções alternativamente emendados para expressão em cloroplastos de plantas, peroxissomos, e citosois, 2) sua clonagem usando o novo método sem ligadura da montagem Gibson, 3) a sua entrega nas células da folha de tabaco com o gene Gun, e 4) Os resultados mostram a segmentação organelo, como observado com a GFPe microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotídeos primers</td><td>IDT</td> <td>(personalizado)</td> <td>Design especificamente para construir</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td> <td>(personalizado)</td> <td>500 bp oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>ApE software</td><td>U Utah</td> <td>(download)</td> <td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Usado para purificar produtos de PCR</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Usado para preparar quantidades apropriadas de clonagem de plasmídeo</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix com GC Buffer</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Usado para amplificar por PCR o gene de interesse Mistura de reação de</td></tr><tr><td>montagem Gibson</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Master mix dos seguintes 9 ingredientes</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Mistura de montagem Gibson</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086 Mistura de</td><td>montagem</td></tr><tr><td>Gibson mistura dNTP Fermentas</td><td></td><td>R0192</td><td>Mistura de montagem Gibson</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Mistura de montagem</td></tr><tr><td>Gibson PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Mistura de montagem Gibson</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Mistura de montagem</td></tr><tr><td>Gibson T5 exonuclease</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td>Mistura de montagem Gibson</td></tr><tr><td>Phusion polimerase</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Website para simplificar cálculos</td></tr><tr><td>Plasmid PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Usado para preparar DNA para balas de armas genéticas</td></tr><tr><td>Sistema Gene Gun</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Inclui todas as peças necessárias</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Presente de Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Imagem de células resultantes Lâminas de</td></tr><tr><td>poço</td><td>profundo Microscopia eletrônica Ciências</td><td>71561-01</td><td>Usado para imagens confocais</td></tr><tr><td>Um Editor de Plasmídeo (ApE) </td><td>Universidade de Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Calculadora</td><td></td><td></td><td>de</td> ligadura http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</tr></tbody></table>

expressão gênica transiente em tabaco usando assembleia gibson eo gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

A fim de orientar uma única proteína para várias organelas subcelulares, plantas tipicamente duplicar os genes relevantes e expressar cada gene separadamente usando estratégias regulatórias complexas, incluindo promotores diferenciais e / ou seqüências de sinais. Engenheiros metabólicas e biólogos sintéticos interessadas no direccionamento enzimas para um organelo particular, são confrontados com um desafio: Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes. Este trabalho apresenta uma solução para esta estratégia: o aproveitamento splicing alternativo do mRNA. Esta tecnologia aproveita de cloroplasto estabelecida e seqüências peroxissoma segmentação e as combina em um único mRNA que é alternativamente emendados. Algumas variantes de processamento são enviados para o cloroplasto, algum do peroxissoma, e outros para o citosol. Aqui o sistema é projetado para múltiplo organela alvo com splicing alternativo. Neste trabalho, a GFP era esperado para ser exprEssed no cloroplasto, citosol, peroxissoma e por uma série de racionalmente concebidos 5 &#39;tags de mRNA. Estas etiquetas têm o potencial de reduzir a quantidade de clonagem necessária quando os genes heterólogos têm de ser expressos em vários organelos subcelulares. As construções foram concebidas em trabalho anterior 11, e foram clonados utilizando a montagem de Gibson, um método de clonagem independente de ligação que não necessita de enzimas de restrição. Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na Nicotiana benthamiana células da epiderme da folha, com um protocolo modificado do gene da arma. Finalmente, as folhas transformadas foram observadas por microscopia confocal.

O esforço do projeto foi o resultado de um planejamento significativo. Novel para este projecto é a utilização de processamento alternativo para criar uma pré-ARNm que é traduzido em proteínas diferencialmente expressas. Estas proteínas são expressas em diferentes organelos, neste caso, o cloroplasto, peroxisoma e / ou citoplasma. Foram adaptados gene Arabidopsis natural que é alternativamente emendados 6, e colocadas conhecido cloroplasto 6 e 17 sequências de direccionamento de...

Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

O objetivo geral do seguinte experimento é observar a expressão gênica transitória de um repórter marcado com GFP em células epidérmicas de folhas de tabaco. Isso é alcançado primeiramente projetando um construto de DNA que será expresso nos cloroplastos e peroxissomos. O construto é então montado utilizando amplificação por PCR e montagem Gibson.Em seguida, uma pistola de genes é utilizada para entregar o construto às células epidérmicas da folha de tabaco. Por fim, a análise da folha de tabaco por microscopia confocal revela a expressão da GFP no cloroplasto e no peroxissomo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a clonagem clássica, é que ela não requer enzimas de restrição e, portanto, qualquer sequência que possa ser amplificada por PCR pode ser clonada.Devido à flexibilidade do design genético, as aplicações dessas técnicas se estendem a uma escala maior. A engenharia genética de plantas agrícolas começa este protocolo determinando os sítios dentro da célula vegetal para a expressão final da proteína. Para este trabalho, o objetivo é direcionar a expressão para o cloroplasto, peroxissomo e citosol.Em seguida, projete o construto de expressão. O construto deve conter um promotor, um gene detectável e um terminador dentro de um único plasmídeo. Neste caso, o promotor constitutivo P end cup two induz a expressão de GFP, que é seguida pelo terminador Nolene Synthe, ou nos t.Observe que, neste experimento, testaremos uma série de sequências sinalizadoras — trit, um, dois e três — expressas no terminal N-terminal da GFP para expressão em cloroplastos e peroxissomos. O método de montagem Gibson depende da ação de várias enzimas em uma mistura pré-fabricada, que digere parcialmente as extremidades do DNA de dupla fita e facilita o emparelhamento de pares de bases complementares de sequências de DNA adjacentes. O construto final possui três partes que devem ser amplificadas em quatro reações de PCR antes da montagem Gibson.As primeira e segunda reações amplificam um vetor plasmidial de 8.000 pares de bases, PORE, que contém GFP NOS T e um marcador de resistência a canamicina. O marcador de resistência é um bom local para dividir esse DNA grande em dois modelos menores, que são mais facilmente amplificados por PCR. A terceira reação amplifica o promotor P end cup dois, e a quarta reação amplifica o triag um usando software de design in silico, como o ape design, montando o construto base por base, de modo que haja uma sobreposição de 50 pares de bases entre cada fragmento.Ao solicitar primers para PCR, é possível utilizar a sobreposição de 50 pares de bases como primers com 25 pares de bases em cada direção. Após realizar a PCR para amplificar cada componente, purifique o produto da PCR separadamente e dilua-os em água destilada e desionizada. Se o molde de PCR foi uma mini-preparação de *E. coli* tratada com a enzima de restrição DpnI, remover-se-á o DNA do molde contaminante. Em seguida, meça as concentrações de cada um dos fragmentos de DNA.Ajuste a concentração do vetor para aproximadamente 150 nanogramas por microlitro para cada construto a ser montado, incluindo um controle. Retire uma alíquota de 15 microlitros da mistura de montagem Gibson do congelador e descongele-a em gelo. Utilizando a ferramenta gratuita online @gibbon. org, determine os volumes correspondentes a quantidades equimolares de cada um dos fragmentos.Adicione o volume calculado de cada um dos fragmentos à mistura Gibson de 15 microlitros. Prepare também um controle contendo apenas o DNA do vetor. O volume total de cada reação deve ser de 20 microlitros.Use água para ajustar o volume, se necessário. Incube os tubos a 50 a 55 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Após a incubação, coloque os tubos de volta no gelo.Retire um tubo microfuge contendo uma preparação comercial de 200 microlitros de *E. coli* competente em cloreto de cálcio de um congelador a menos 80 graus Celsius e aqueça-o levemente com a mão. Em seguida, adicione os 20 microlitros da reação ao *E. coli*. Incube as culturas no gelo por 30 minutos, depois transfira-as para um banho-maria a 42 graus Celsius e submeta-as a choque térmico por 60 segundos.Não utilize células eletrocompetentes. A concentração relativamente alta de sal e a baixa concentração de DNA podem causar arco nas células após a transformação. Retorne as culturas ao gelo por dois minutos, então adicione 750 microlitros de meio SOC ou LB e permita que recuperem por 30 minutos a 37 graus Celsius.Na próxima placa, incubar a mistura em placas de LB com canamicina ou outro antibiótico apropriado a 37 graus Celsius durante a noite e analisar 10 colônias por sequenciamento. Observe que este método pode resultar em um fundo mais alto e em um maior número de eventos de recombinação não direcionados em comparação com o clonagem tradicional baseada em ligação. A transformação biológica de tabaco com uma pistola de genes foi previamente descrita no JoVE.Aqui, são revisados os principais passos e diferenças em relação aos protocolos anteriores. Após amplificar e isolar as construções, prepare os projéteis para a pistola de genes conforme descrito no artigo do JoVE por woods e zeto e carregue-os na pistola de genes para transfeção do tecido epidérmico de folhas de Nico Tania Benham Miana tobacco. Escolha uma folha grande próxima à base de uma planta com três a cinco meses de idade.Coloque cuidadosamente com a face inferior voltada para cima sobre toalhas de papel úmidas em uma placa de Petri de 15 centímetros, usando proteção adequada para os olhos e ouvidos. Ajuste a pressão de hélio do canhão de genes para 200 a 250 PS.I. Aponte cuidadosamente o canhão de genes entre as nervuras na face inferior de uma folha, a cerca de três a cinco centímetros acima dela. Libere o segurança e entregue as partículas à folha.Use cada projétil duas vezes no mesmo local da folha. Mude para outro local e repita o processo se a folha explodir, descarte-a e comece com uma nova folha. Existe alguma variação na resistência da folha devido às condições de crescimento, como idade, umidade, entre outras.Após todas as aplicações, cubra a folha e armazene-a por dois a três dias em baixa luminosidade sobre a bancada. Examine a folha em um microscópio estereoscópico equipado com fluorescência UV e procure células individuais expressando GFP. Quando células expressando GFP forem encontradas, use uma tesoura de dissecação para extrair cuidadosamente seções de folha de cinco a dez milímetros.Mergulhe imediatamente cada fragmento foliar individual no poço de uma lâmina de microscopia de poço profundo contendo cerca de 200 microlitros de Triton X 100 a 0,1%. O detergente ajuda a prevenir a formação de bolhas de ar na superfície, e a lâmina de microscopia de poço profundo permite uma área maior de imagem para análise celular utilizando um microscópio confocal equipado com filtros apropriados e uma objetiva imersão em água de 40 x. Neste estudo, os três diferentes construtos de marcação de organelas com GFP foram comparados ao GFP não marcado e a rubis.Coag.A microscopia confocal de GFP foi utilizada para detectar a fluorescência de GFP em células individuais transformadas de forma transitória em experimentos controle nos quais o GFP não marcado foi expresso. A fluorescência é observada somente no núcleo e no citosol, mas não nos cloroplastos, que são identificados pela autofluorescência vermelha da clorofila, como visto neste exemplo de uma célula transfectada com um construto de GFP apenas no cloroplasto Rubis Oag. O construto GFP foi expresso nos grandes organelas.A célula está delineada em branco. O amarelo indica áreas de colocalização do construto com clorofila, indicando que o construto é direcionado ao cloroplasto, como mostrado nesta imagem de uma célula transfectada com triag um: a expressão de GFP é observada no cloroplasto, nas periferias, no citosol e em pequenas organelas pontuadas, acreditadas como peroxissomos. Da mesma forma, células transfectadas com triag dois também expressam GFP no cloroplasto, no citosol e nos peroxissomos. O triag três, que consiste em um sinal de peroxissomo inserido dentro de uma região de baixa complexidade da sequência do cloroplasto, localiza-se apenas no cloroplasto e no peroxissomo.Observe que esta célula está em uma camada foliar diferente. Esta figura resume a expressão observada nos compartimentos de uma célula epidérmica típica de folha de tabaco. Os tamanhos e localizações relativos dentro da célula são mostrados, assim como os níveis relativos de expressão observados por meio de transfeção por partículas e microscopia confocal.Observe que a GFP sem marcação se localiza no citosol e no núcleo, o controle PIMT dois GFP se localiza no cloroplasto e triag um GFP, triag dois GFP e Triag 3G FP se localizam no cloroplasto e peroxissomo, conforme previsto. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como construir um plasmídeo com montagem Gibson, entregá-lo diretamente nas folhas de tabaco e observar a expressão da GFP em até três dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar 150 nanogramas por microlitro de DNA do vetor para a montagem Gibson e 1500 nanogramas por microlitro do seu construto final de DNA para preparar suas balas de canhão genético. Após este procedimento, outros métodos, como a transfeção com agrobactéria, podem ser realizados para obter expressão gênica estável em vez de transitória.

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Descrição de um vírus induzida silenciamento de genes método (VIGS) para knock-down da expressão gênica...

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo...

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Induzida por vírus silenciamento de genes é uma ferramenta útil para a identificação de genes envolvidos na resistência de plantas não hospedeiras. Nós demonstramos o uso de bactérias patogênicas que expressam GFPuv em identificar plantas silenciados genes suscetíveis a agentes patogênicos não hospedeiras. Esta abordagem é simples, rápido e facilita a triagem em grande escala e protocolo semelhante pode ser aplicado ao estudo de várias outras interacções planta-microorganismo.

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras

Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução de RNA silenciar supressores.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Descreve-se um desenho de experiências abordagem que pode ser utilizada para determinar e modelar a influência dos elementos de regulação de transgenes, de crescimento e de desenvolvimento de parâmetros de planta, e as condições de incubação sobre a expressão transiente de anticorpos monoclonais e proteínas repórter em plantas.

Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Aprenda a realizar expressão gênica transiente em células epidérmicas de tabaco usando Assembleia Gibson e gene gun. Este método simplifica a clonagem sem enzimas de restrição e permite visualização por microscopia confocal.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

Explorar mais vídeos