Imagem Através do Pupal Caso de Drosophila melanogaster

Neste vídeo, demonstraremos novas técnicas que nos permitem obter imagens do púbis de Drosophila Melanogaster sem comprometer a integridade estrutural do puer. Ao manter a caixa da pupila intacta, minimizamos o impacto da imagem no desenvolvimento e viabilidade da pupa. Usamos um microscópio confocal de varredura ressonante de 8.000 hertz para imagens de imagem.

É importante ressaltar que a velocidade de varredura muito rápida e a alta sensibilidade deste microscópio reduzem muito o branqueamento, permitindo longos períodos de observação. Com esse método, conseguimos visualizar uma variedade de processos biológicos celulares, incluindo comportamento, fop, podia, morfogênese, fagocitose e mitose. Com esta técnica, podemos observar eventos in situ por longos períodos de tempo sem danificar o organismo.

As observações obtidas com esses métodos podem ser usadas para entender uma variedade de fenômenos biológicos neste estágio relativamente inacessível do desenvolvimento da drosófila, o povo do queijo, o estágio apropriado, nós os examinamos ainda no frasco procurando indicadores-chave no estágio de desenvolvimento para estudar as divisões celulares, procuramos pipa que desviaram a cabeça, mas ainda não mostram pacotes verdes e mecônio e o abdômen dorsal. Os indivíduos são soltos tocando o estojo com um pincel úmido, transferindo água para dissolver a cola salivar. As pipas são então gentilmente soltas, apanhadas com o pincel e transferidas para uma placa de Petri contendo água.

As pessoas são bem lavadas na água para limpar a caixa de comida ou detritos. Em seguida, os alinhamos, com o lado dorsal para cima, para garantir que estejam no estágio correto. Manuseie-os com cuidado.

Eles podem morrer facilmente se até mesmo um pequeno orifício for feito no tubo. Indivíduos selecionados são cuidadosamente colocados e placa de Petri com fundo de vidro e orientá-lo de modo que a característica de interesse é mais próximo da lamínula e tão paralelo à superfície quanto possível. Para observar a asa da pupila, apoiamos a pupa contra o suporte, como um comprimento fino, a massa de modelar ou a cera dental, garantindo que eles não se movam após a orientação.

Em seguida, convidamos o prato para garantir que o recurso de interesse seja visível e bem orientado. Normalmente, monte várias pipas ao mesmo tempo contra a possibilidade de que uma não esteja expressando a proteína fluorescente ou não esteja em um estágio desejado. Uma vez que as pipas estão todas montadas e orientadas corretamente, tocamos a base de cada pipa com um pincel umedecido com diodo dilin glicol, uma montanha não tóxica que corresponde ao índice de refração do óleo puro ou de uma água diluída com água.

Isso serve a um duplo propósito de reduzir a difração do caso da pupila e reduzir a refração da imersão As lentes são usadas depois de montarmos e organizarmos corretamente o pupi. Passamos para o microscópio confocal de varredura a laser. Usamos um invertido como um SP cinco equipado com um scanner de ressonância.

O prato é montado no microscópio e localizamos o puput usando a óptica do microscópio. Assim que a pupa for encontrada, ajuste o foco para que a característica de interesse, neste caso, a asa, fique visível. Identificamos a asa pela presença de um grande elemento traqueal que atravessa o meio da asa.

Quando a região de interesse é identificada e o microscópio é focado, passamos para a objetiva 20 x seca. Depois de reconfirmar o foco, mudamos o microscópio para o modo confocal. Ajustamos os parâmetros do confocal para minimizar a exposição à luz.

A intensidade da luz é mantida abaixo de 10% de transmissão. Para maximizar o brilho, abrimos o orifício para 130 mícrons para a lente 20 x com azuma quatro e definimos o ganho para 900 volts. Com essas configurações, podemos obter imagens por horas sem afetar a duração do intervalo mitótico ou a saúde do animal.

Em seguida, definimos o número de seções Z e a frequência de captura de imagem para corresponder às características do fenômeno biológico que estamos tentando observar, por exemplo, intervalos de imagem de um minuto capturam suficientemente todas as características importantes da divisão celular. Mas intervalos de três segundos são importantes para observar a dinâmica dos filos podias. Concentre-se para cima e para baixo através do epitélio até encontrar o recurso desejado.

Se necessário, use o microscópio e o modo XYZT para coletar pilhas Z ao longo do tempo. A duração dos filmes também é um parâmetro importante. Fizemos vídeos de até 10 horas.

Ao criar imagens de várias moléculas fluorescentes simultaneamente, tentamos diminuir a duração total da imagem. Em princípio, cada etiqueta fluorescente causa maior produção de espécies reativas de oxigênio. Na prática, não observamos letalidade associada à imagem de linhas triplamente marcadas por uma hora ou menos.

Se o tecido alvo ou o processo for menor que cerca de cinco mícrons, você provavelmente precisará usar uma lente de imersão. Lembre-se de que essas lentes focalizam o laser em um ponto mais fino, aumentando assim a intensidade da luz, e você deve ajustar os parâmetros de imagem de acordo, Os filmes são transferidos do microscópio confocal para um computador que executa o programa de análise de imagem da rodovia, Fiji. Com Fiji, podemos abrir, medir e manipular recursos nas imagens multidimensionais geradas pelo confocal.

Este método de imagem nos permitiu estudar a posição dos núcleos em relação ao ciclo celular. Na asa da pupila, coletamos uma pilha Z do topo do epitélio até os núcleos mais observáveis inferiores em intervalos de um minuto. Nesses filmes, observamos apenas divisões ocorrendo nas seções confocais apicais mostradas aqui à esquerda, as seções mais basais mostradas à direita revelam o retorno de núcleos recém-divididos da camada superficial, mas não contêm outras características de mitose.

Esses dados mostram que o epitélio da asa da pupila que se divide rapidamente é semelhante ao disco da asa larval e a outros MedOne. Epitelial em que os núcleos se movem para a superfície apical do epitélio durante a mitose. Apesar dessa semelhança, o epitélio da asa da pupila é relativamente estratificado, com a maioria dos núcleos muito próximos da camada superior.

Métodos anteriores de imagem de drosófila durante os estágios iniciais do desenvolvimento da pupila foram prejudicados, em grande parte devido a tentativas de remover ou penetrar no caso da pupila. Descrevemos aqui uma nova abordagem que nos permite visualizar células adultas durante o desenvolvimento sem afetar a viabilidade do organismo. Nosso método é qualitativamente diferente dos outros, pois mantém o caso da pupila totalmente intacto.

A combinação de microscopia confocal com varredura ressonante nos permite visualizar tecidos em desenvolvimento dentro de 20 mícrons do caso da pupila. As principais limitações na resolução da profundidade são a distância de trabalho da lente e o espalhamento da caixa no tecido. No entanto, nosso método nos permite resolver características das células epiteliais do ápice à base.

Usamos essa técnica para observar mitose, filo, podia, morfogênese e fagocitose. Além disso, estudamos até três marcas fluorescentes distintas em uma amostra. Acreditamos que as abordagens aqui descritas abriram o período inicial de desenvolvimento da pupila para o estudo das camadas epiteliais mais externas.

Quando combinada com o poder da genética geal, essa acessibilidade pode melhorar ainda mais nossa compreensão do desenvolvimento adulto.