Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

O objetivo geral deste procedimento é gerar esferas myos. Estruturas semelhantes a EB compostas de células musculares esqueléticas de células-tronco embrionárias humanas. Isso é feito reprogramando as células por infecção lentiviral de Baf 60 C. O segundo passo do procedimento é infectar as mesmas células com um segundo vírus, o lentivírus myo D.

As células infectadas são então induzidas a formar agregados semelhantes a EB por cinco dias em meio de cultura à base de soro. Em seguida, o meio EB é trocado por um meio de diferenciação livre de soro, e os agregados são cultivados por mais duas semanas em esferas de mios. Em última análise, a imunofluorescência é usada para visualizar seções de agregados incorporados na OCT.

A principal vantagem desta técnica é a degeneração de alto rendimento de células musculares esqueléticas que derivam de progenitores mesenquimais ou mesodérmicos não requerem classificação de fatos e, portanto, é compatível com um sistema cultural tridimensional O dia anterior à infecção de células-tronco embrionárias humanas em seis placas de poços adicione clonagem de células-tronco embrionárias humanas e suplemento de recuperação ao meio a 1000 x para uma concentração final de dois micromolares no próximo dia infectar as células-tronco embrionárias humanas com banho de alto título 60 CGFP lentivírus. Primeiro, dissocie um poço de células em uma única suspensão celular, adicionando um mililitro de tripa e incubando a placa por cinco minutos. Em seguida, colete e transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros.

Adicione nove mililitros do meio preparado e gire as células a 1.200 RPM por cinco minutos enquanto espera até um mililitro de mt. SIR, um. Adicione poli cérebro a seis microgramas por mililitro de concentração final e o suplemento de recuperação de células-tronco embrionárias humanas a dois micromolares.

Em seguida, ressuspenda as células nesta solução e transfira-as para um único poço de uma placa de fixação baixa de seis poços. Agora adicione o banho concentrado 60 C vírus em uma multiplicidade de infecção de 100 milhões. Incube a placa por três horas com o vírus.

Em seguida, colete as células e divida-as em dois poços de placa revestidos de matrigel. Para cada placa, adicione dois mililitros de mt, SIR, um com suplemento de dois micromolares e, em seguida, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua a mídia por novas mídias.

As células parecerão já ter se aglomerado após 48 horas do início da infecção. Verifique a fluorescência para avaliar a eficiência da infecção. Continue as mudanças diárias de mídia até que as células estejam em 80% de confluência e, em seguida, dissocie as células e o vírus myo D das células usando o mesmo protocolo.

Manter as células infectadas com mudanças diárias de meio até atingirem 80% de confluência no dia anterior a esse ponto de crescimento. Placa MES em placas revestidas de matrigel a 1000 células por centímetro quadrado para passar as células infectadas para a placa ME'S. No dia seguinte.

Use trip ALI para dissociá-los e transferir as células para um tubo de 15 mililitros para as células. Adicione nove mililitros de meio de células-tronco embrionárias humanas e centrifugue-os. Adicione 1.200 RPM por cinco minutos.

Resus, suspenda as células peletizadas em seis mililitros frescos de meio de células-tronco embrionárias humanas. Agora remova o meio de duas placas de mes e adicione as células infectadas a elas. Incube as células por vários dias.

Uma vez, adicione 80% de confluência. Remova todos os meios e adicione um mililitro de colagenase quatro. Adicione um miligrama por mililitro após cinco minutos em colagenase a 37 graus Celsius.

Substitua a colagenase por um mililitro de meio de células-tronco embrionárias humanas. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, raspe as colônias usando uma ponta de pipeta de 10 mililitros, transfira as colônias para um tubo de 15 mililitros e deixe-as assentar. Após três minutos, remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de células estaminais embrionárias humanas.

Em seguida, coloque as células em uma proporção de um a quatro para placas de metanfetamina. As células infectadas precisam estar em um número alto e ter formado colônias de boa qualidade para este procedimento. Remova a mídia de cada poço e adicione um mililitro de colagenase. Quatro.

Adicione um miligrama por mililitro de concentração como antes, e a reação da colagenase após cinco minutos, substituindo-a por meio EB. E então use rapidamente um microscópio para raspar as colônias. Usando uma ponta de pipeta de 10 mililitros, é possível dissociar as células em pequenos aglomerados de células.

Colete esses agregados em um tubo de 15 mililitros e, depois de assentarem por cerca de três minutos, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em três mililitros de meio EB e transfira tudo para um único poço de uma placa de fixação baixa de seis poços. Incube esta placa durante a noite no dia seguinte. Verifique se há grandes pedaços de colônia.

Se algum for encontrado. Divida-os fluindo-os através de uma pipeta de cinco mililitros algumas vezes. Se houver muitas células individuais flutuantes, colete os agregados por sedimentação e substitua por meio EB fresco.

Substitua a mídia a cada dois dias após cinco dias de cultivo. Colete os agregados celulares e lave-os uma vez com dois mililitros de PBS, permitindo que as células sedimentem sob gravidade normal. Em seguida, substitua o PBS por três mililitros de meio MS e retorne as células aos mesmos poços de placa nos próximos 15 dias de cultura.

Substitua o meio a cada três dias. Durante esse tempo, as mesosferas se formarão. As células-tronco embrionárias humanas foram infectadas com banho 60 C carregando fluorescência GFP.

Após 72 horas, as celas foram classificadas. As células que expressam BAF 60 C foram cultivadas até cerca de 75% de fluência de co e depois infectadas com lentivírus mioD. A expressão gênica exógena foi detectada nas células infectadas por PCR quantitativo em tempo real.

A expressão e distribuição no nível da proteína foram examinadas. Em seguida, a GFP corresponde à expressão de baf 60 C, e um anticorpo myo D foi usado para verificar a expressão de myo D. 15 dias após as células-tronco embrionárias humanas começarem a formar agregados semelhantes a EB.

Uma parte das esferas de myos foi incluída no composto OCT e seccionada a seção corada positiva para marcadores de cadeia pesada miogênica e miosina. A partir do dia 10, foi possível observar contração esporádica nas esferas de mios. Algumas esferas de myos assumiram formas diferentes ou incomuns, talvez devido à fusão entre as esferas de myos.

Esta técnica avançará a pesquisa no campo da modelagem e terapia de doenças, porque as esferas mio podem ser geradas a partir de células-tronco pluripotentes de pacientes afetados por diferentes distúrbios musculares. Por esse motivo, as myo esferas fornecem um modelo de edição de doença adequado para limpeza de medicamentos e patogênese de doenças.