Name: Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprenda a detectar e caracterizar células tumorais circulantes em amostras de sangue humano e de xenotransplante murino usando o sistema CellSearch. Este método auxilia na seleção de terapias direcionadas para pacientes oncológicos.

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Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Ontário de Pesquisa do Câncer (# 08NOV230), a Fundação Canadense para Inovação (# 13199), o cancro da próstata Canadá, Janssen Oncologia, o Programa Regional Cancer Londres, e apoio de doadores de John e Donna Bristol através Fundação Londres Ciências da Saúde (para ALA). LEL é apoiado por uma Frederick Banting e Charles Best Canadá Scholarship Award de Pós-Graduação de Doutorado. ALA é apoiado por uma CIHR New Investigator Award e um Prêmio Pesquisador Precoce do Ministério da Investigação e Inovação Ontário.

Todos os estudos em humanos descritos neste manuscrito foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa Humana da Universidade Ocidental. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com as recomendações do Conselho Canadense de Cuidados Animal, no âmbito de protocolos aprovados pela Western University Uso de Animais Subcomissão. 1. Padrão CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes, utilizando o CSS 1. Coleta de sangue humano e Preparação para processamento no Instrumento Preparação <ol><li> Usando técnicas de flebotomia assépticas padrão, desenhe um mínimo de 8,0 ml de sangue humano em um tubo de 10 ml CellSave (doravante referido como o tubo de conservante CTC), que contém ácido etileno diamino (EDTA) e um conservante celular proprietária. Inverta os 5x tubo para prevenir a coagulação do sangue. As amostras podem ser processados ​​imediatamente ou armazenado à temperatura ambiente durante até 96 horas. </li><li> REMOÇÃOreagentes e CSS da geladeira e deixe aquecer até à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Usando uma pipeta descartável de 10 ml e pipetador automático, recolher 7,5 ml de sangue a partir do tubo de conservante CTC e dispensar lentamente sangue em tubo de um instrumento de processamento de preparação adequadamente rotulado. </li><li> Adicionar 6,5 ml de tampão de diluição de cada amostra. Misture invertendo amostra de 5x. Amostra Centrifugar a 800 xg por 10 minutos com o freio na posição &quot;off&quot;. Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para carregar todas as amostras do paciente no sistema para processamento. As amostras devem ser processadas no prazo de 1 hora de preparação. </li></ol> 2. Preparação de Controle de Processamento no Instrumento Preparação <ol><li> Suavemente vortex o frasco controle e inverter 5x para misturar. </li><li> Com cuidado, retire a tampa do frasco de controlo e coloque um instrumento tubo processamento preparação invertido em cima do frasco destampado. Em um movimento rápido, inverter acontrolar frasco e despeje o conteúdo para dentro do tubo de processamento. Enquanto invertida, agite delicadamente as laterais do frasco de controlo para liberar qualquer conteúdo remanescente. </li><li> Retire cuidadosamente o frasco de controlo invertido a partir do tubo de processamento, garantindo que nenhum líquido é perdido e colocar de lado. Usando uma pipeta de 1000 mL, recolher qualquer conteúdo restantes do frasco e tampa e pipeta suavemente para dentro do tubo de processamento. </li><li> Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para carregar o controle no sistema para processamento. </li></ol> 3. Digitalização de amostra sobre o Instrumento de Análise <ol><li> Siga as instruções na tela do instrumento de preparação para descarregar todas as amostras do sistema. Vagamente cap cada cartucho dispositivo magnético e toque no dispositivo magnético usando as mãos ou bancada do laboratório para libertar quaisquer bolhas que estão presos às extremidades do cartucho. Uma vez que todas as bolhas tenham sido removidos, firmemente cobre o cartucho, coloque o dispositivo magnético plana, e euncubate no escuro durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. As amostras devem ser digitalizados dentro de 24 horas de preparação. </li><li> Ligue o instrumento de análise e inicializar a lâmpada. Depois de aquecida (~ 15 min), coloque o cartucho de verificação do sistema para o instrumento de análise e selecione a guia teste QC. Siga as instruções na tela para executar as medidas de controle de qualidade necessários. </li><li> Coloque uma amostra para o instrumento de análise e selecione a guia Teste do Paciente. Todas as informações salvas do instrumento de preparação será exibido. Clique em Iniciar para iniciar a digitalização da amostra. O sistema irá realizar um foco grosso e detecção de borda do cartucho dispositivo magnético. </li><li> Ajuste todas as bordas, se necessário, utilizando as teclas direcionais. Selecione Aceitar. O sistema irá realizar um bom foco e iniciar a digitalização da amostra. </li><li> Após a digitalização de controle os resultados devem ser validados utilizando os critérios definidos para as células contaminadas em alta (CK + DAPI + CD45 - APC +) e baixo (CK + DAPI + CD45 - FITC +) concentrações. Após a digitalização de amostra do paciente, os resultados devem ser revistos para CTCs capturados utilizando os critérios definidos CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. CTC Caracterização de marcadores definidos pelo usuário usando o CSS 1. Preparação de marcadores definidos pelo usuário e Instrumento de Inicialização <ol><li> Diluir o anticorpo de interesse, utilizando ligação primária diluente de anticorpo para a concentração desejada em um copo de reagente marcador através da seguinte fórmula, em que a concentração de trabalho é a concentração do anticorpo após a adição à amostra e a concentração de estoque é a concentração de anticorpo na copo reagente. Para várias amostras, ajustar os volumes de anticorpos, tal como descrito na Tabela 1. Coloque o copo reagente marcador para a posição 1 no cartucho de reagente e lOAD o cartucho para CSS. Banco de Concentração = (concentração de trabalho x 850 ul) / 150 mL </li><li> Recolha de sangue, amostras de preparar, e carregar o instrumento de preparação, tal como descrito acima no padrão CTC Enumeração das amostras de sangue do paciente, utilizando o protocolo de CSS. Para habilitar disso marcador personalizado, selecione Definido pelo usuário Ensaio quando solicitado pelo instrumento de preparação. Digite o nome do marcador e selecione Salvar. Como as amostras são carregados no instrumento, o operador será solicitado a indicar qual deve receber marcador personalizado selecionando Sim ou Não, se necessário. </li></ol> 2. Amostra de digitalização de marcadores definidos pelo usuário sobre o Instrumento de Análise <ol><li> Ligue o instrumento de análise, inicializar a lâmpada, e realizar o controle de qualidade e sistemas de verificação, conforme descrito na Seção 3.2 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes usando o CSS </strong&gt; protocolo. </li><li> Coloque uma amostra para o instrumento de análise e selecione a guia Configuração. Para inicializar o canal FITC, selecione CellSearch CTC como o ID de Kit na seção Teste de Protocolos. A partir deste menu, selecione CTC Research, clique no botão Editar e defina o tempo de exposição se o desejar. Recomenda-se que um tempo de exposição de 1,0 seg não ser excedido quando se utiliza o kit de CSS CTC como este pode aumentar de passagem de purga para outros canais fluorescentes utilizados para a identificação do CTC. </li></ol> 3. Adaptação do CSSProtocol padrão para uso em pré-clínica do rato Modelos ** Adaptado de Veridex Mouse / Rato CellCapture Kit (não mais disponível no mercado) 1. Rato coleta de sangue e armazenamento <ol><li> Antes da recolha de sangue, funcionamento ~ 30 ul de EDTA 0,5 M, para trás e para a frente através de uma agulha G 22, deixando uma pequena quantidade de EDTA no cubo. </li><li>Coletar um mínimo de 50 mL de sangue do rato dos ratos previamente injetados com células tumorais humanas através de rotas ortotópico, veia da cauda, ​​ou intracardíacas. Recolha de sangue a partir da veia safena (para análise CTC série) ou por meio de punção cardíaca (por análise CTC terminal). Remova a agulha e distribuir sangue para a 1 ml EDTA microtainer tubo de coleta de sangue. Misture por inversão ou tubo suavemente movimento para evitar a coagulação do sangue. O sangue pode ser processado imediatamente ou armazenado à temperatura ambiente durante até 48 horas após a adição de um volume igual de CytoChex conservante celular. </li></ol> 2. CTC Enriquecimento <ol><li> Remover reagentes CSS da geladeira e deixe aquecer até à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Transferir o equivalente de 50 ul de sangue inteiro a um fluxo de 12 milímetros x 75 milímetros de citometria tubo. Adicionar 500 ul de tampão de diluição de cada amostra, lava-se todo o sangue que permanece sobre os lados do tubo. Se necessário, a uma curta rotação centrífugapode ser usado para coletar todo o sangue restante. </li><li> Suavemente vortex o ferrofluido anti-EpCAM e adicionar 25 ul de cada amostra, colocando a ponta da pipeta directamente para a amostra. Adicionar 25 mL de reagente de captura Enhancement e vortex suavemente para misturar. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Coloque os tubos de amostras para o ímã e incubar por 10 min. Embora os tubos de amostra estão ainda no íman, utilizar uma pipeta de vidro para aspirar cuidadosamente o líquido residual, sem tocar na parede do tubo ao lado do íman e descartar. </li></ol> 3. CTC Coloração <ol><li> Retire os tubos de amostra do íman e ressuspender em 50 mL de ácido nucléico da tintura, 50 ul de reagente de coloração, 1,5 ul de anti-rato de CD45-APC, 5,0 ul de anti-HLA-Alexa Fluor 488, e 100 ul de permeabilização Reagente. Para várias amostras, estes reagentes podem ser previamente misturados e 206,5 uL de mistura pode ser adicionada a cada tubo. Vortex suavemente para misturare incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 500 mL de tampão de diluição, vortex suavemente, tubos lugar de amostra para o ímã, e incubar por 10 min. Embora os tubos de amostra estão ainda no íman, utilizar uma pipeta de vidro para aspirar cuidadosamente o líquido residual, sem tocar na parede do tubo ao lado do íman e descartar. Retire os tubos de amostra do íman e ressuspender em 350 ul de tampão de diluição. Vortex suavemente para misturar. </li></ol> 4. Magnetic dispositivo de carregamento <ol><li> Utilizando uma ponta de carregamento de gel, transferir cuidadosamente a totalidade do volume do tubo de ensaio para um cartucho no dispositivo magnético. Comece na parte inferior do cartucho e retirar lentamente a ponta medida que a amostra é distribuída. </li><li> Uma vez que toda a amostra foi transferida, vagamente cobre o cartucho dispositivo magnético e toque no dispositivo magnético usando as mãos ou bancada do laboratório para libertar quaisquer bolhas que estão presos às extremidades do cartucho, conforme descrito no Section 3.1 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes usando o CSS. </li><li> Pop quaisquer bolhas utilizando uma agulha esterilizada 22 G, aprisionando-entre o bisel e o bordo do cartucho. Uma vez que todas as bolhas de ter sido removido, firmemente cobre o cartucho, colocar o dispositivo magnético plana, e incubar no escuro durante pelo menos 10 min. As amostras devem ser digitalizados dentro de 24 horas de preparação. </li></ol> 5. Digitalização de amostras separadas manualmente sobre o Instrumento de Análise <ol><li> Ligue o instrumento de análise, inicializar a lâmpada, e realizar o controle de qualidade e sistemas de verificação, conforme descrito na Seção 3.2 da Norma CTC enumeração de amostras de sangue de pacientes que utilizam o protocolo CSS. </li><li> Coloque a amostra no instrumento de análise e selecione a guia Configuração. Limpe todos os dados existentes sobre o botão de dados do dispositivo magnético, clicando no botão Formatar da Amostra. Ativar o canal a FITCª definir o tempo de exposição a 1,0 seg, como descrito na Seção 2.2 do CTC Caracterização de marcadores definidos pelo usuário usando o CSS. </li><li> Clique na aba teste do paciente e selecione Editar para inserir a informação da amostra. Selecione CellSearch CTC como o ID de Kit e CTC Research como o Protocolo de Teste. Insira as informações necessárias permanecendo como indicado como o asterisco. Salve as informações da amostra e clique em Iniciar. </li></ol>

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</ol>

O autor (ALA) recebeu financiamento que foi fornecida pelo Janssen Oncologia, cuja empresa-mãe Johnson &amp; Johnson também possui Janssen Diagnostics LLC, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Apesar do desenvolvimento de muitas novas tecnologias CTC desde a introdução da CSS em 2004, esta técnica ainda é a única tecnologia clinicamente aprovado hoje no mercado e, portanto, é considerada o padrão ouro atual para a detecção e enumeração CTC. Este manuscrito demonstrou que embora o CSS tem padrões de controle de qualidade rigoroso que pode estar sujeito a viés de interpretação e que a identificação CTC em amostras de pacientes é muito diferente de identificação em amostras enriquecidas. Foram identificados seis...

Em 2013 estima-se que 580.350 pessoas morrerão de câncer e que 1.660.290 novos casos da doença serão diagnosticados nos Estados Unidos sozinho 1. A maioria das mortes ocorrem subsequente ao desenvolvimento da doença metastática 2. A atual falta de terapias eficazes no tratamento de metástases e uma compreensão limitada da cascata metastática faz nesta fase da doença altamente letal. A presença de células tumorais circulantes (CTCs) na corrente sanguínea tem sido demonstrada estar correlacionada com doença metastática 3. Estas células são extremamente raros e a sua detecção é indicativo de sobrevida de mama metastático 4, 5 da próstata, colo-rectal e cancro da 6. Nestes pacientes, a presença de ≥ 5 (mama e próstata) ou ≥ 3 (colorectal) CTC em 7,5 ml de sangue é indicativo de um pior prognóstico quando comparado com os pacientes com menos ou nenhuma CTC detectáveis ​​na samvolume de e sangue. Além disso, a alteração no número CTC durante ou após intervenção terapêutica tem sido demonstrado ser úteis como um indicador da resposta ao tratamento, muitas vezes, mais cedo do que as técnicas actualmente utilizadas 7-10. Estimou-se que, em pacientes com cancro metastático, CTC ocorrem com uma frequência de cerca de 1 por CTC 10 5 -10 7 células mononucleares de sangue e em pacientes com doença localizada, essa frequência pode ser ainda mais baixa (~ 1: 10 8). A natureza raras dessas células pode tornar difícil a precisão e fiabilidade detectar e analisar CTC 11. Vários métodos (avaliação previamente 12-14) têm sido utilizados para o enriquecimento e detectar estas células através da exploração de propriedades que os diferenciam dos componentes do sangue circundante. Em geral, CTC enumeração é um processo de duas etapas que exige uma etapa de enriquecimento e um passo de detecção. Tradicionalmente, as etapas de enriquecimento de contar com as diferenças de Physpropriedades iCal de CTCs (tamanho da célula, densidade, deformabilidade) ou na expressão de marcador de proteína (ou seja, a molécula de adesão de células epiteliais [EpCAM], citoqueratina [CK]). Seguindo o enriquecimento, a detecção CTC pode ser realizada em um número de maneiras diferentes, sendo o mais comum dos quais são os ensaios baseados em ácidos nucleicos e / ou citometria de abordagens. Cada uma dessas estratégias são únicos, com vantagens e desvantagens, no entanto todos eles não têm padronização; uma necessidade para a entrada no ambiente clínico. O sistema CellSearch (CSS), foi desenvolvido para proporcionar um método normalizado para a detecção e enumeração de CTC raras no sangue humano, através de microscopia de fluorescência e técnicas à base de anticorpos 4-6. Esta plataforma é actualmente considerado o padrão ouro no CTC enumeração e é a única técnica aprovado pelo os EUA Food and Drug Administration (FDA) para uso na clínica 15. O CSS é um dois consistin plataforma componenteg, (1) o sistema CellTracks Autoprep (doravante referido como o instrumento de preparação), que automatiza a preparação de amostras de sangue humano, e (2) o CellTracks Analyzer II (doravante referido como o instrumento de análise), que analisa estes amostras seguintes preparação. Para distinguir CTC contaminem leucócitos o instrumento de preparação utiliza um anticorpo mediado, separação magnética abordagem baseada em ferrofluido e fluorescência de coloração diferencial. Inicialmente, o sistema de etiquetas CTC, utilizando anticorpos anti-EpCAM conjugados com nanopartículas de ferro. A amostra é então incubada num campo magnético, e todas as células não marcadas são aspirados. Células tumorais seleccionadas são ressuspensos e incubados em um de fluorescência da mancha diferencial, que consiste de anticorpos fluorescentemente marcadas e um reagente de coloração nuclear. Finalmente, a amostra é transferida para um cartucho magnético, chamado um magnest (daqui em diante referido como o dispositivo magnético), e scanned usando o instrumento de análise. O instrumento de análise é usado para digitalizar amostras preparadas com diferentes filtros de fluorescência, cada um otimizado para a partícula fluorescente apropriado, usando uma lente objetiva de 10X. CTCs são identificadas como células que estão vinculados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, e 19), ea mancha nuclear 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Por outro lado, os leucócitos contaminantes são identificadas como células que estão vinculados por anti-CD45-aloficocianina (APC) e DAPI. Após a análise, as células de tumor possíveis definidos por computador são apresentados ao utilizador. A partir dessas imagens, o usuário deve empregar análise qualitativa utilizando os parâmetros definidos e coloração diferencial discutidos acima para determinar quais eventos são CTCs. Além de fornecer um método padronizado para CTC enumeração, o CSS permite a caracterização molecular de CTCs com base em marcadores de proteínas de interesse. Este interrogatório cum ser efectuada ao nível de uma única célula, utilizando um isotiocianato de fluoresceína (FITC), canal de fluorescência não é necessária para a identificação CTC 16. Embora esta plataforma proporciona a capacidade para a caracterização molecular, o processo detalhado de desenvolvimento do protocolo e optimização não é bem definida. Três marcadores comercialmente disponíveis foram desenvolvidas pelo fabricante para utilização com o EAP, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), o crescimento epidérmico humano do receptor do factor 2 (HER2), e factor de crescimento semelhante à insulina-1 receptor (IGF-1R). Análise HER2, em combinação com o CSS, tem sido utilizado por vários grupos para ilustrar o potencial de caracterização CTC para informar a tomada de decisão clínica e mudar potencialmente diretrizes de tratamento existentes. Por exemplo, Fehm et al. 17 demonstraram que aproximadamente um terço dos pacientes com cancro da mama com tumores HER2-primário tinha HER2 + CTC. Além disso, Liu et al.18 informou recentemente que até 50% dos pacientes com HER + câncer de mama metastático HER2 não tinha + CTCs. Herceptin, um receptor HER2 interferindo anticorpo monoclonal demonstraram beneficiar muito a pacientes cujos tumores expressam níveis suficientes de HER2, é um tratamento vulgarmente utilizado para pacientes com tumores HER2 + primárias 19-21. No entanto, esses estudos sugerem que Herceptin pode estar sendo sub-utilizada de forma otimizada e que a caracterização CTC pode ajudar na previsão de resposta ao tratamento. Em última análise, a caracterização CTC pode ter o potencial para melhorar o atendimento personalizado. Pesquisa CTC é o único que tem em grande parte utilizou uma abordagem de cabeceira-to-de bancada. Este método, ao contrário de bancada-a-cabeceira investigação, que muitas vezes pode levar anos para afetar o atendimento ao paciente, permitiu CTCs entrada rápida no ambiente clínico. No entanto, os médicos hesitam em utilizar os resultados da análise CTC no tratamento do paciente-mak decisãoção, devido a uma falta de compreensão da sua biologia subjacente. Portanto mouse modelos pré-clínicos adequados de técnicas de metástase e análise CTC complementar deve ser utilizado, a fim de investigar essas questões pendentes. Em geral, existem dois tipos de modelos pré-clínicos usados ​​para estudar a cascata metastática, (1) os modelos de metástase espontânea, o que permite o estudo de todos os passos da cascata metastática, e (2) os modelos de metástases experimentais, os quais só permitem o estudo de passos posteriores no processo metastático como extravasamento e a formação do tumor secundário 22. Modelos de metástase espontâneas, envolvem injeções de células tumorais em locais ortotópico apropriadas (por exemplo, injeção de células de câncer de próstata na próstata para o estudo do câncer de próstata). As células são então dado tempo para formar os tumores primários e metástase espontânea para locais secundários, tais como o osso, pulmão, e nódulos linfáticos. Emcontraste, os modelos de metástase experimentais envolvem injeção direta de células tumorais na corrente sanguínea (por exemplo, via veia da cauda ou injeção intracardíaca às células-alvo para locais específicos) e, portanto, ignorar as etapas iniciais de intravasation e disseminação para os órgãos secundários 22. Até agora, a maioria das análises CTC em sistemas modelo in vivo tem sido realizada utilizando qualquer 23 ou adaptados CTC técnicas à base de citometria de base humana (por exemplo, AdnaTest) 24. Embora útil, nenhuma dessas técnicas reflete adequadamente CTC enumeração usando o padrão ouro CSS. Com base na aprovação clínica, natureza padronizada, e o uso generalizado do CSS, o desenvolvimento de uma técnica de captura e detecção do CTC para modelar in vivo que utiliza a preparação da amostra equivalente, processamento, e critérios de identificação seria vantajoso que os resultados sejam comparáveis ​​àqueles obtido a partir de amostras de doentes. No entanto, devido ao volume de requirements do instrumento de preparação não é possível processar pequenas quantidades de sangue, utilizando esta plataforma automatizada. . Além disso, o trabalho anterior por Eliane et al 25 demonstraram que a contaminação das amostras com células epiteliais do mouse (que também se enquadram na definição CTC padrão [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) pode levar a erros de classificação de rato células epiteliais escamosas como CTCs. Para tratar dessas questões de uma técnica adaptada que permite a utilização dos reagentes CSS CTC combinados com um procedimento de isolamento manual foi desenvolvido. A adição de um antigénio de leucócitos humanos marcados com FITC (HLA) de anticorpos para o doseamento permite que as células de tumor humano a ser distinguido de rato células epiteliais escamosas. Este manuscrito descreve o padrão, desenvolvido comercialmente e protocolo CSS otimizado para o processamento de amostras de pacientes de sangue e armadilhas comuns que podem ser encontrados, incluindo discrepânciast itens que podem levar a erros de classificação do CTC. Além disso, a personalização do ensaio CSS para examinar as características de proteína definida pelo utilizador de CTC capturados e uma técnica CSS comparável adaptado que permite o enriquecimento e a detecção dos CTC de pequenos volumes de sangue de rato, em modelos pré-clínicos de metástases são descritos.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD44-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD44-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano HLA-Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>311415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Ligação Diluente de Anticorpo Primário</td><td>Leica</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave Preservative Tubes</td><td>Veridex</td><td>952820 (pacote de 20) 79100005 (pacote de 100)</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Controle CTC CellSearch</td><td>Veridex</td><td>7900003</td><td></td></tr><tr><td>Kit CTC</td><td>CellSearch Veridex</td><td>7900001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Controle CXC CellSearch</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>Kit CXC CellSearch</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Buffer</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td><td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td><td></td>de 1 ml</tr><tr><td>10 ml Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>sorológica</tr><tr><td>1,000 &micro; l Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &micro; l Ponteiras</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta</tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>fluxo</tr><tr><td>200 &micro; l Pontas</td><td></td><td></td><td></td>de carregamento de gel</tr><tr><td>200 &micro; l Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G Agulha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 pol Pipeta Pasteur descartável</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>serológica de 5 ml</tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>capilar automatizada</tr><tr><td>Tubo de coleta de sangue capilar (EDTA)</td><td>BD Microtainer</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch Analyzer II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>Inclui magnests e cartuchos de verificação</td></tr><tr><td>Sistema AutoPrep CellSearch</td><td>Centrífuga Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Ímã</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect&nbsp;</td><td>R& Lâmpada Pequena para Látex D Systems</td><td>MAG997</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adaptação do semi-automática de circulação tumor de células (ctc) ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de pesquisa

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

A maioria das mortes relacionadas ao câncer ocorrem subseqüente para o desenvolvimento da doença metastática. Este estádio da doença altamente letal está associada com a presença de células tumorais (CTCs) circulante. Estas células raras foram demonstrou ser de relevância clínica em mama metastático, próstata e colorretal. O atual padrão ouro na detecção clínica CTC e enumeração é o sistema CellSearch aprovado pela FDA (CSS). Este manuscrito descreve o protocolo padrão utilizado por esta plataforma, bem como dois protocolos adicionais adaptados que descrevem o processo detalhado de optimização marcador definido pelo utilizador para a caracterização da proteína de CTC paciente e um protocolo similar para o CTC captura em volumes muito baixos de sangue, usando o padrão reagentes de estilo CSS, para estudar em modelos de ratos pré-clínicos in vivo de metástase. Além disso, as diferenças de qualidade entre CTC sangue doador saudável enriquecida com células de cultura de tecidos contra samp sangue do pacienteles são realçados. Finalmente, vários itens comumente discrepantes que podem levar a erros de classificação do CTC são delineadas. Tomados em conjunto, estes protocolos irá fornecer um recurso útil para os utilizadores desta plataforma interessados ​​em pesquisa pré-clínica e clínica pertencente a metástase e CTCs.

Padrão CTC enumeração Assay A sensibilidade e especificidade do CSS tem sido bem documentada na literatura. No entanto, para validar a recuperação CTC equivalente, cravado (1.000 LNCaP células cancerosas da próstata humana) e amostras de sangue humano não enriquecido de doadores voluntários saudáveis ​​foram processados ​​no CSS usando o protocolo CSSCTC padrão. Como esperado, as amostras não enriquecido estavam livres dos CTC, 0,00 ± 0,00%, e a recuperação do CTC mostrou ser 86,9 ± 4,71% para ...

As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Este experimento tem como objetivo a detecção sensível, enumeração e caracterização de células tumorais circulantes provenientes de amostras de sangue de xenografias humanas e de camundongos. Primeiro, colete as amostras de sangue de humanos e/ou modelos de camundongos com câncer e, utilizando uma seleção positiva para células EPCA positivas, enriqueça as CTCs em meio aos leucócitos contaminantes. Em seguida, com coloração diferencial de CTCs e leucócitos, identifique e enumere as CTCs.Realize a caracterização molecular desejada dessas raras células tumorais circulantes em laboratório para auxiliar na seleção de terapias direcionadas para pacientes com câncer na clínica. Os resultados obtidos utilizando o sistema cell search demonstram que a análise de CTC pode ser efetivamente realizada em amostras de sangue de xenografos humanos e de camundongos. O desenvolvimento de protocolos adicionais definidos pelo usuário para caracterização de CTC no sistema cell search pode, em última instância, auxiliar na seleção de terapias direcionadas para os pacientes.Além disso, ensaios de CTC comparáveis adaptados para uso em xenografias em camundongos melhorarão nossa compreensão da biologia básica dessas células. Colete 7,5 mililitros da amostra de sangue de um tubo com conservante para CTC e dispense lentamente em um tubo de processamento. Adicione 6,5 mililitros de tampão de diluição a cada amostra de sangue.Inverta cinco vezes para misturar e centrifugue a 800 vezes G por 10 minutos. Com a alavanca na posição desligada para o preparo do controle, vortexe suavemente o frasco por cinco segundos e inverta cinco vezes para misturar. Em seguida, remova a tampa superior com um tubo de processamento invertido e, com um único movimento rápido, transfira a amostra.Bata suavemente nas laterais do frasco controle para obter a transferência máxima da amostra. Remova cuidadosamente o frasco controle invertido, garantindo que nenhum líquido seja perdido. Recolha o conteúdo restante do frasco e da tampa e adicione-o suavemente ao tubo de processamento.Siga as instruções exibidas na tela do instrumento de preparação para carregar todas as amostras de controle e dos pacientes no sistema para processamento. Siga as instru游戏副本es exibidas na tela do instrumento de preparação para descarregar todas as amostras do sistema. Agora, tampe frouxamente cada cartucho do dispositivo magnético e bata levemente para liberar bolhas das bordas.Em seguida, tampe firmemente o cartucho, posicione o dispositivo magnético na posição horizontal e incube no escuro por pelo menos 20 minutos. Ligue o instrumento de análise e inicialize a lâmpada. Carregue o cartucho de verificação do sistema no instrumento de análise.Selecione a guia teste de controle de qualidade e siga as instruções na tela para realizar as medidas necessárias de controle de qualidade. Em seguida, carregue uma amostra no instrumento de análise e selecione a guia teste do paciente. Clique em iniciar para inicializar a digitalização da amostra.Ajuste todas as bordas conforme necessário usando as teclas direcionais. Em seguida, selecione aceitar Para preparar marcadores definidos pelo usuário, dilua o anticorpo de interesse com o diluente de anticorpo primário bond. Coloque o copo do reagente marcador na posição um do cartucho de reagentes e insira o cartucho no sistema de busca celular para habilitar a adição de marcadores personalizados.Selecione o ensaio definido pelo usuário quando solicitado pelo instrumento de preparação. Insira o nome do marcador e selecione salvar. Após a conclusão do processamento da amostra, carregue uma amostra no instrumento de análise e selecione a guia de configuração.Para inicializar o canal ZI, selecione busca de células CTC como o ID do kit na seção de protocolo de teste. Nesse menu, selecione pesquisa CTC. Clique no botão editar e defina o tempo de exposição conforme desejado.Colete um mínimo de 50 microlitros de sangue de camundongo em um tubo microcoletor de 1 mililitro com EDTA e misture por inversão para prevenir coagulação. Para o enriquecimento de CTCs, transfira o equivalente a 50 microlitros de sangue total para um tubo de citometria de fluxo. Adicione 500 microlitros de tampão de diluição a cada amostra.Lave cuidadosamente o sangue das laterais do tubo, vorte o fluido anti-chem completamente e adicione 25 microlitros a cada amostra. Além disso, adicione 25 microlitros do reagente de realce de captura. Vorte as amostras suavemente e incube à temperatura ambiente por 15 minutos.Em seguida, coloque os tubos de amostra no ímã por 10 minutos. Aspire cuidadosamente o líquido residual sem tocar a parede do tubo próxima ao ímã e descarte, retire os tubos de amostra do ímã e adicione 50 microlitros de corante de ácido nucleico. 50 microlitros do reagente corante, 1,5 microlitro de anti-US CD45 APC 5,0 microlitros de anti-humano HLA DR 488 e 100 microlitros do reagente permeabilizante, vórtex suavemente e incube no escuro por 20 minutos.À temperatura ambiente. Adicione agora 500 microlitros de tampão de diluição e vortex. Coloque suavemente os tubos de amostra no ímã por 10 minutos.Aspire cuidadosamente o líquido residual e descarte-o. Em seguida, reconstitua os pellets em 350 microlitros de tampão de diluição, agitando suavemente em vórtex para homogeneizar. Aspire a amostra em uma ponteira para carregamento em gel e transfira para o dispositivo magnético iniciando na parte inferior da cartela e retirando lentamente a ponteira à medida que a amostra é dispensada.Após remover as bolhas de ar, utilizando uma agulha estéril de 22 calibres, tampe firmemente o cartucho, coloque o dispositivo magnético em posição plana e incube no escuro por pelo menos 10 minutos. Carregue a amostra no instrumento de análise e selecione a guia de configuração. Para apagar os dados existentes, clique no botão formatar amostra.Selecione CTC de busca celular como o ID do kit e protocolo de pesquisa CTC como o teste. Nesse menu, certifique-se de que o tempo de exposição apropriado foi selecionado. Selecione a guia de teste do paciente e selecione editar.Para inserir as informações da amostra, preencha as demais informações necessárias conforme indicado. Em seguida, salve as informações da amostra e clique em iniciar para validar. A recuperação de células tumorais circulantes, células de câncer de próstata humano adicionadas artificialmente e amostras de sangue humano não adicionadas provenientes de doadores voluntários saudáveis foram processadas no sistema Cell Search utilizando o protocolo padrão Cell Search para CTC.Como esperado, as amostras controle não apresentaram células tumorais circulantes. A recuperação de CTCs em amostras com espécie adicionada foi de 86,9%. Essas imagens da galeria de busca celular obtidas de amostras com espécie adicionada são de qualidade ótima, e as CTCs são fáceis de distinguir das não CTCs. A identificação de CTCs é ligeiramente mais desafiadora em pacientes com câncer, com muitas células apresentando tamanho menor e sendo menos facilmente distinguíveis das não CTCs.Além disso, ao revisar amostras de pacientes, seis categorias de eventos apresentaram itens comumente discordantes entre os observadores. São eles: eventos pequenos, eventos positivos no ZI, coloração tênue de citoceratina ou manchas irregulares, imagens pixelizadas, vazamento de citoceratina e dpi grande ou não sobreposto. A seleção do kit de CTC deve ser considerada ao desenvolver marcadores definidos pelo usuário utilizando uma linhagem celular conhecida por demonstrar positividade de 98 4% para os marcadores de células-tronco tumorais CD 44.O kit CTC baseado em FCI classificou apenas 69,3% das CTCs como positivas para CD44. No entanto, utilizando o kit CX C baseado em PE, 98,8% das CTCs foram classificadas como positivas para CD44. A otimização adequada de qualquer marcador definido pelo usuário exige validação utilizando linhagens celulares com alta densidade de antígeno, baixa densidade de antígeno e negativas para o marcador de interesse, a fim de garantir a sensibilidade e especificidade do ensaio. Este experimento avalia a sensibilidade e especificidade do protocolo adaptado de pesquisa de células murinas.Como esperado, as amostras enriquecidas não apresentaram CTCs em ambos os ensaios e a recuperação de CTCs. Usando o kit murino adaptado e o sistema automatizado padrão, as imagens obtidas com o protocolo manual adaptado para camundongos não diferiram daquelas observadas com a técnica automatizada padrão.A inclusão de HLA fita E neste ensaio garante que as células tumorais humanas possam ser facilmente diferenciadas das células epiteliais escamosas de camundongo, a diluição em série de amostras de sangue de camundongo com células adicionadas, e a correlação entre o número esperado de células e o número de células recuperadas. Confirme que esta técnica é tão sensível quanto o protocolo CSS padrão para o isolamento de pequeno número de CTCs. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o enriquecimento automatizado e manual de CTCs a partir de amostras de sangue xenogênico humano e de camundongo.Além disso, você deverá ter uma compreensão mais profunda das etapas necessárias para o desenvolvimento e otimização de protocolos de caracterização de CTCs para uso em combinação com o sistema Cell Search.

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Este vídeo descreve o ensaio de imunofluorescência de células tumorais circulantes (CTC), uma técnica para caracterizar os biomarcadores em células tumorais circulantes em amostras de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este ensaio pode ser usado para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, radiação e possíveis tratamentos de imunoterapia.

Ensaio de imunofluorescência CTC: uma técnica para caracterizar células tumorais circulantes

As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho experimental que permite a análise ex vivo da estimulação de células T humanas em um sistema de co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas.

Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

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Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

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