Name: Um tumor modelo de estresse cirúrgico para explorar os mecanismos de pós-operatório Imunossupressão e Avaliar Novel perioperatórios Imunoterapias Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprenda a criar um modelo de tumor em camundongo para avaliar imunoterapias perioperatórias que reduzem metástases pós-cirúrgicas. Este método demonstra como o estresse cirúrgico afeta a progressão do câncer.

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Os autores gostariam de agradecer a você Kim Yates, Eileen Franklin, e Rebecca Tjepkema (cuidados de animais e veterinários Serviços, Universidade de Ottawa) para assistência em cirurgias de animais. Lee Tai-Hwa é apoiado por uma Fonds de recherche santé Quebec Fellowship. Este trabalho foi apoiado por subvenções de funcionamento do Instituto de Pesquisa Canadian Cancer Society Inovação Grant, Ontario Ministry of Award Pesquisa e Desenvolvimento Pesquisador precoce e Fundação Canadense para Inovação - Líder do Opportunity Grant para Rebecca Auer.

1. Mantendo 4T1 Células Tumorais in vitro <ol><li> Cultura de células tumorais modificadas 4T1 em DMEM completo (DMEM, 10% FBS, 1x penicilina / estreptomicina), em placas de cultura de tecidos de 10 cm. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 de cultura de tecidos incubadora. </li><li> Culturas Dividir 2-3 vezes / semana. Para manter a viabilidade das células óptimas não deve exceder 80% de confluência. Não use pilhas para o estabelecimento in vivo tumores primários se as culturas foram repicadas in vitro por&gt; 1 mês, pois isso diminui a malignidade e potencial metastático de células anteriormente subculturas. </li></ol> 2. Colheita 4T1 Células Tumorais para Injeção <ol><li> Aspirar o meio de cultura a partir da placa de cultura de tecido utilizando uma pipeta de Pasteur. </li><li> Adicionar 10 ml de 1x PBS estéril contendo 2 ml de EDTA. Deixe a solução de PBS incubar na placa a 37 ° C, 5% de CO 2 de tecido de cultura incubadora durante 5-7 min. </li><li> Colheita solução PBS a partir de chapa, rinsing a placa 2-3x com solução, a transferência para 15 ml de tubo cónica. </li><li> Centrifugar células durante 5 min a 500 xg, a 4 ° C, numa centrífuga de bancada. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em MEMD isento de soro. </li><li> Determinar a concentração de células utilizando um contador de células. </li><li> Diluir as células em meio isento de soro para 1x10 6 cells/500 ul (1x10 5 células/50 ul (para injecção e colocar as células em gelo. </li></ol> 3. Injetando Ratos com 4T1 Células Tumorais Todos os estudos com animais realizados foram de acordo com as diretrizes institucionais nos Serviços Veterinários Cuidados Animais da Universidade de Ottawa recomendações para todos os animais que receberam injeções ortotópico ou implantes tumorais. <ol><li> Trate os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 hora antes da cirurgia para tratamento da dor. </li><li> Induzir e manter o mouse sob anestesia com isoflurano 2,5% durante o período de duração do injeçãoção. Aperte a pata do rato para detectar resposta reflexa. Se nenhuma for detectada, os níveis eficazes de anestesia são atingidos. Lubrificante ocular esterilizada é então aplicado, para evitar a secagem da córnea. </li><li> Coloque um 30 G ½ na seringa &quot;Ultra-fino&quot; com exatamente 50 mL de células suspensão. Certifique-se de que todas as bolhas de ar são removidas da seringa coluna tocando no lado da seringa para retirar as bolhas de ar. </li><li> Coloque o mouse (sob anestesia) ventral voltada para cima. </li><li> Limpe o local da injecção com um algodão embebido em álcool e introduzir a agulha na horizontal e diretamente para o quarto bloco de gordura mamária, dispensar lentamente o volume de seringa. </li><li> Utilize um cotonete para limpar qualquer vazamento possível. </li><li> Permitir que os ratos recuperar da anestesia. </li><li> Manter buprenorfina (0,05 mg / kg) para o manejo da dor administrada sc cada 8 horas, durante 2 dias. </li></ol> 4. Administrando Tratamento Perioperatória em 4T1 Tumor Tendo BALB / c Mice <ol><li> Aos 13 dias de injeção de células pós-tumor, medir o tumor primário usando um paquímetro externo. Meça o maior diâmetro longitudinal (comprimento) eo maior diâmetro transversal (largura) com a pinça. A fórmula elipsoidal modificado é usado para calcular o volume do tumor (volume do tumor = 1/2 (comprimento de uma largura de 2) </li><li> Aos 13 dias de injeção de células pós-tumor, o tumor primário deve medir cerca de 1 cm 3. Quando esta medida do tumor é atingido, preparar reagente terapia perioperatória. </li><li> Vírus oncolítico é uma terapêutica inovadora que se pode administrar no período perioperatório. Prepare vírus oncolítico (1x10 9 UFP / 1 ml) em 1x PBS estéril e colocar em gelo, antes da injecção. </li><li> Rato Seguro e lugarem limitador para injecção intravenosa veia da cauda. </li><li> Gentilmente aqueça cauda do rato na água quente da torneira para visualizar veias da cauda laterais. </li><li> Coloque um 27 G ½ em &quot;seringa de insulina&quot;, com precisão de 100 l de terapia vírus oncolítico. Certifique-se de que todas as bolhas de ar são removidas da seringa coluna. </li><li> Injetar o mouse com 1x10 8 PFU/100 mL / rato para uma das veias da cauda laterais. Se a agulha está adequadamente inserido na veia lateral, sem resistência deve ser sentida quando pressionando a seringa. </li></ol> 5. A ressecção completa do tumor primário e abdominal Esquerda Nephrectomy <ol><li> Aos 14 dias de injeção de células pós-tumor, iniciar cuidados perioperatórios rotina seguinte Universidade de Ottawa Animal Care e Serviço Veterinário aprovado protocolos. Trate os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,05 mg / kg) 1 hora antes da cirurgia para tratamento da dor. Induzir e manter a anestesia utilizando 2,5% de isoflurano durante a cirurgia. Under condições e utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis esterilizados, local da cirurgia é raspado e limpo. Animais são administrados fluidos subcutâneos e lubrificante ocular antes da cirurgia. </li><li> Fazer uma pequena incisão (1-2 cm de comprimento) para suavemente e remover completamente o tumor primário 4T1 de almofada de gordura mamaria. </li><li> Feche a incisão com 2-3 9 milímetros grampos. </li><li> Exponha o abdômen, cortando através da pele e tecido subcutâneo ao longo da linha média ventral do rato. </li><li> Faça uma incisão na linha alba (3-4 cm) para acessar o mouse peritônio. </li><li> Exponha o lado interior esquerdo do abdômen, movendo as entranhas sobrejacentes para o lado. Certifique-se que os intestinos são mantidos úmido com uma solução salina embebido gaze estéril. </li><li> Usando um par sem corte de pinça cirúrgica, segure suavemente o rim esquerdo. </li><li> Usando um fio de seda trançada revestida 3-0 cera amarrado em um laço, ligadura do hilo do rim esquerdo e prenda com 3 nós cirúrgicos. Retire o rim esquerdo com Surgitesoura cal. </li><li> Inspecione o empate sutura cuidadosamente para garantir que hemostasia adequada seja alcançada. </li><li> Feche a camada subcutânea com uma sutura loop contínuo usando 5-0 trançado camada de pele absorvível, em seguida, usando grampo 9 milímetros grampos. Passos 5,2-5,10 deve exigir 10 min / animal. </li><li> Manter buprenorfina (0,05 mg / kg) para o manejo da dor administrada sc cada 8 horas, durante 2 dias. </li></ol> 6. Eutanásia Ratos e Processamento e Quantificação de pulmão Tumor Burden <ol><li> Aos 28 dias pós-injeção 4T1 tumor, eutanásia camundongos de acordo com a Animal Care e Serviços Veterinários protocolo da Universidade de Ottawa. </li><li> Spray para baixo do mouse com etanol 70%. </li><li> Fazer incisão inicial com uma tesoura, logo abaixo da caixa torácica. </li><li> Expor o tórax, cortando através da pele e na camada subcutânea na linha média ventral da cavidade torácica do rato. </li><li> Faça incisões laterais através da pele e do tecido de cada lado até o neck do mouse. </li><li> Dissecar os pulmões agarrando suavemente o pulmão, enquanto cortando fora o tecido conjuntivo acima e abaixo dos pulmões. </li><li> Presoak extraído pulmões em PBS frio para remover o sangue residual, em seguida, coloque em 10% de formalina tamponada a. </li><li> Fotografia cada pulmão para avaliação de metástases tumorais. Pesar pulmões para carga tumoral quantificação. </li></ol>

<ol><li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+postoperative+metastatic+disease+by+inhibiting+surgery-induced+dysfunction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preventing postoperative metastatic disease by inhibiting surgery-induced dysfunction in natural killer cells.</a> Cancer Res. 73, 97-107 (2013).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A ressecção cirúrgica é o esteio da terapia para pacientes com tumores sólidos localizados. Mesmo com a ressecção completa, muitos pacientes desenvolvem uma recorrência metastática e, finalmente, morrer de sua doença. O período pós-operatório imediato fornece um ambiente ideal para a formação de metástases de cancro, modulada, em grande parte, pela supressão das células NK pós-operatório. Apesar disso, continua a ser uma janela terapêutica, que é largamente ignorado. Atualmente não há terapias anti-câncer perioperatórios padrão destinadas a prevenir metástases pós-operatórias. O desafio atual é identificar terapias seguras e promissoras que ativarão as células NK no período perioperatório impedindo assim o estabelecimento da doença micrometastática. Estas terapias devem ser rigorosamente caracterizados para a segurança e eficácia em modelos animais pré-clínicos e, em seguida, traduzido em ensaios clínicos cuidadosamente concebido. A relação primárianale de desenvolver um modelo de tumor do rato do estresse cirúrgico é explorar mecanismos de supressão imunológica e metástase após a cirurgia e avaliar immunotherapies inovadores com potencial para uso futuro em pacientes com câncer submetidos a cirurgia para remover o tumor primário. Para alcançar este objetivo, foi desenvolvido um modelo de carcinoma mamário murino 4T1 juntamente com o estresse cirúrgico. Enquanto a linha celular 4T1 de murino é um &quot;carcinoma mamário&quot;, a razão para utilizar esta linha de células é a reprodutibilidade das metástases espontâneas que nos permite avaliar os efeitos de trauma cirúrgico em um modelo de cancro realista. Neste contexto, a origem real da malignidade é menos importante do que a biologia do tumor e o potencial metastático. O segundo componente fundamental do nosso modelo é o desenvolvimento de um procedimento cirúrgico de animais para se assemelhar de perto a cirurgia de câncer humano. Neste modelo estresse cirúrgico animal, o principal 4T1 tumor de mama é retirado após atingir 1 cm3. Porquecirurgias de câncer em pacientes humanos envolvem supressão imunológica significativa, uma nefrectomia-abdômen aberto em grupos de tratamento &quot;estresse cirúrgico&quot; é adicionalmente realizada. Como ele se compara com a ressecção do tumor mais convencional em humanos, a natureza invasiva de uma nefrectomia esquerda completo é muito comparável a vários tipos de tratamentos cirúrgicos para tumores sólidos, incluindo a cirurgia para o câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de rim, câncer de pâncreas, pulmão e esôfago câncer. Além disso, argumentam que as profundas mudanças fisiológicas que ocorrem no período perioperatório, devido à laparotomia + nefrectomia, reproduz adequadamente as mudanças fisiológicas que ocorrem esmagadora seguinte cirurgia invasiva para a maioria dos tumores sólidos. Para controlar fatores perioperatórios que podem levar ao estresse excessivo cirúrgico e mortalidade, a duração da anestesia e cirurgia e manter a temperatura do corpo durante a cirurgia é precisamente definido. Todos estes parâmetros são precisamente executado umd definido em nosso protocolo de cirurgia para espelhar cuidados perioperatórios de rotina em pacientes com câncer humanos. O momento dos tratamentos perioperatória é um componente crítico adicional para o modelo de resgate perioperatória. Ratinhos portadores do tumor 4T1 tenham sido previamente tratados com 3 regimes de vacina contra a gripe: neoadjuvante (dada 5 dias antes da cirurgia), peri-operatória (dada no mesmo dia de cirurgia) e perioperatória + multidose (dada no dia da cirurgia, seguida por 2 doses adicionais dado 5 dias de intervalo). Notavelmente, todos os três modos de tratamento com a vacina diminuiu significativamente as metástases do pulmão 22. No entanto, a vacina contra a gripe administradas no período perioperatório em dose única metástases reduzidos de forma mais eficaz. Coletivamente, estas experiências destacar a importância do período perioperatório imediato como uma janela terapêutica estreita para intervir no processo metastático. Uso perioperatório de imunoterapias inovadoras, tais como oncolytic vírus e vacinas foi exclusivamente limitada a nosso grupo de pesquisa. Nós demonstramos pela primeira vez que a administração perioperatória de vírus novo ORF oncolitico e vaccinia pode reverter a supressão das células NK após cirurgia em modelos animais 1. Mais importante ainda, este resgate da função imune correlaciona com uma diminuição da formação de metástases de pós-operatório. Em estudos humanos, os pacientes no pós-operatório de cirurgia de câncer tinham reduzido citotoxicidade das células NK e perioperatória OV aumenta significativamente a atividade das células NK em pacientes com câncer 1. Usando vacinas profiláticas disponíveis comercialmente, foi demonstrado que a administração da vacina da gripe perioperatória reduziu significativamente as metástases tumorais e melhorou a citotoxicidade das células NK em modelos de tumores pré-clínicos. Em estudos em humanos, a vacina contra influenza aumentou significativamente a atividade das células NK em doadores humanos saudáveis ​​e pacientes de cirurgia de câncer 22. Muitas abordagens são usadas para reduzir cancrecorrência er, incluindo quimioterapia e radioterapia, mas estas terapias são normalmente administrados semanas a meses antes (neoadjuvante) ou após (adjuvante) cirurgia. A investigação neste domínio mostra que o pós-operatório imediato é fundamental para determinar as taxas de recorrência do tumor a longo prazo. Assim, as intervenções clínicas em forma de imunoterapias durante este período crítico pode ter benefícios substanciais de longo prazo. Os nossos estudos usando um mouse modelo de metástase pulmonar espontânea e estresse cirúrgico oferecem uma oportunidade única para explorar novas terapias e determinar seu potencial para prevenir a imunossupressão perioperatório em pacientes de cirurgia de câncer e assim também reduzir as taxas de recorrência do câncer.

A cirurgia é um componente crítico no tratamento do cancro curativo de tumores sólidos, mas apesar da ressecção completa, muitos pacientes desenvolvem uma recidiva metastática e por fim a morte da sua doença. Cada vez mais, o período pós-operatório, como um resultado da resposta ao stress fisiológico para a cirurgia, incluindo a coagulação do sangue, a libertação de factores de crescimento, e a supressão imunitária, é reconhecido que o tempo crítico para o desenvolvimento de metástases. O nosso grupo 1,2 e 3-5 outros têm mostrado que o período pós-operatório imediato é um tempo excepcionalmente susceptíveis para a formação de metástases. Um dos principais mecanismos responsáveis ​​pelos efeitos prometastatic da cirurgia é a disfunção pós-operatória de células natural killer (NK), as células 1-3. As células NK são linfócitos citotóxicos do sistema imune inato envolvida no controle do crescimento de tumores e metástases 6. A disfunção de células NK após a cirurgia tenha sido documentada in tanto pacientes humanos 1,7-9 e modelos animais 1,10,11. Supressão de células NK no pós-operatório se correlaciona com o aumento das metástases em modelos animais de metástases espontâneas e implantados 1,11-14, enquanto que em estudos com humanos, baixa atividade NK durante o período perioperatório está associada a uma maior taxa de recorrência e mortalidade 15,16 câncer. Apesar disso, não existem actualmente terapias contra o câncer que abordam especificamente as alterações prometastatic que ocorrem imediatamente após a cirurgia de câncer. O período perioperatório representa uma janela terapêutica de oportunidade em que para intervir no processo metastático. Enquanto as terapias do cancro tradicionais, tais como a quimioterapia citotóxica, são consideradas demasiado tóxico para ser administrado a doentes em recuperação de uma cirurgia 17, terapias imunológicas são candidatos ideais para a administração perioperatória. Utilização perioperatória de recombinante IL-2 e IFN-y foram exploradas in fase inicial de ensaios clínicos que demonstram seu potencial para evitar a supressão de células NK no pós-operatório e melhorar a sobrevida livre de progressão 18-21. Infelizmente, o desenvolvimento tem sido dificultada pela tolerabilidade desta terapia citocina inespecífica combinado com grande cirurgia 17. Os vírus também são potentes ativadores inespecíficos das células NK. A nossa investigação tem demonstrado previamente que a administração pré-operatória de vírus em replicação, como novos medicamentos anti-cancro Oncolíticos Vírus (OV) e nonreplicating vacinas virais, tais como a vacina da gripe, pode inibir a disfunção das células NK induzido pela cirurgia e atenuar a doença metastática 1,22. O modelo cirúrgico descrito neste trabalho tem facilitado a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na propagação e crescimento de células tumorais após a cirurgia e nos permitiu explorar novas terapias alvo que podem ser administradas no período perioperatório. Para atingir esta meta, um animalmodelo de estresse cirúrgico e espontânea maço metástase desenvolvidos. O modelo faz uso de tumores de carcinoma da mama do rato (Balb / c 4T1) - que são capazes de formar metástases espontaneamente a partir da glândula mamaria primária para múltiplos locais distantes, em particular os pulmões. No dia 0, as células de cancro da mama são implantadas no rato almofada de gordura da mama. No dia 14 pós implantação do tumor, a ressecção completa do tumor mamário primário é realizada em todos os animais. Um subconjunto de animais recebe estresse cirúrgico adicional sob a forma de uma nefrectomia abdominal. No dia 28 de nódulos tumorais de pulmão em salientou cirurgicamente e sem controle camundongos cirurgia comparação são isolados e quantificados. Neste modelo animal de cancro e a cirurgia, os efeitos da cirurgia em metástases do cancro são estudadas e a eficácia da administração perioperatória de imunoterapias inovadoras, incluindo a replicação e nonreplicating imunes-estimulantes baseados viralmente são testados para o primeiro tempo.

<table><tbody><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning Cell-Gro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Chiron, Guelph</td><td></td><td></td>RXN309968</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter Corp</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>1/2 Seringa ultrafina</td><td>Terumo</td><td>30 G, SS05M3009</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Grampos</td><td>Braintree</td><td>ACS BX</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Sutura absorvível trançada</td><td>Covidien</td><td>UL-202</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Sutura de seda trançada com cera</td><td>Covidien</td><td>S-194</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Fisher</td><td>SF100-20</td><td></td></tr><tr><td>4T1 Células tumorais</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos BALB / c</td> Charles <td>Rivers Labs</td><td>Código de cepa: 028</td><td></td></tr></tbody></table>

um tumor modelo de estresse cirúrgico para explorar os mecanismos de pós-operatório imunossupressão e avaliar novel perioperatórios imunoterapias rato

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

A ressecção cirúrgica é um tratamento fundamental para a maioria dos pacientes de cancro, mas a cirurgia induz disfunção do sistema imune e isto tem sido associada ao desenvolvimento da doença metastática em modelos animais e em doentes com cancro. Trabalho pré-clínico do nosso grupo e outros demonstraram uma profunda supressão da função imune inata, especificamente células NK no período pós-operatório e este desempenha um papel importante no desenvolvimento de metástases reforçada após a cirurgia. Relativamente poucos estudos com animais e ensaios clínicos têm-se centrado na caracterização e reverter os efeitos negativos da cirurgia de câncer. Utilizando um modelo animal rigorosa de metastização espontânea tumores e estresse cirúrgico, foi demonstrado o aumento da cirurgia do cancro no desenvolvimento de metástases do pulmão. Neste modelo, as células de cancro da mama 4T1 são implantados na almofada de gordura mamaria do rato. No dia 14 pós implantação do tumor, a ressecção completa do tumor mamário primário é performed em todos os animais. Um subconjunto de animais recebe estresse cirúrgico adicional sob a forma de uma nefrectomia abdominal. No dia 28 de nódulos tumorais de pulmão são quantificados. Quando a imunoterapia foi determinada imediatamente antes da cirurgia, uma profunda activação das células imunes, que inibem o desenvolvimento de metástases após cirurgia foi detectado. Enquanto o modelo de cirurgia do tumor da mama 4T1 permite a simulação dos efeitos de estresse cirúrgico abdominal em metástases de tumores, a sua aplicabilidade a outros tipos de tumor deve ser testado. O desafio atual é identificar immunotherapies seguros e promissores em modelos pré-clínicos de mouse e traduzi-los em terapias perioperatórios viáveis ​​para ser dado aos pacientes de cirurgia de câncer para prevenir a recorrência da doença metastática.

Um modelo reprodutível rato de estresse cirúrgico, que resulta no aumento dramático de metástases pulmonares foi desenvolvido. No dia 28 após a inoculação do tumor 4T1 (e 14 dias após a ressecção do tumor + / - nefrectomia abdominal), os pulmões foram retirados e visualizados por metástases. Cirurgia aumenta claramente a quantidade de metástases pulmonares em comparação com ratos não tratados, como demonstrado por meio de fotografias de pulmão (Figura 1A), contagem de nódulos de pulmão (Figura 1B) e o peso do pulmão (Figura 1C). Administração pré-operatória de replicação do vírus oncolítico e vacina inativada contra influenza resgata significativamente os efeitos prometastatic de cirurgia de câncer (Figuras 1A-C). Para determinar se as células NK desempenham um papel mediador na prevenção de metástases do tratamento pós-vacina, as células NK foram farmacologicamente esgotados usando anti-asialo GM-1 no modelo de metástases de tumores. Na ausência de NKcélulas, observou-se uma anulação do efeito terapêutico de imunoterapias perioperatórios (Figuras 2A e 2B). Estes dados sugerem que a remoção de metástases tumorais em nosso modelo estresse cirúrgico é mediada principalmente por meio de vírus e vacina contra a gripe ativação oncolítico das células NK e NK subseqüente lise tumoral mediada. Para melhor caracterizar a função das células NK após a administração perioperatória de vírus oncolítico e vacina contra a gripe, ex vivo NK morte celular foi avaliada. Resumidamente, agrupados e ordenados DX5 + células NK foram isolados a partir de esplenócitos de cirurgicamente forçado e ratinhos de controlo. Foram co-cultivadas durante 4 horas com crómio marcado YAC-1 de células alvo, em Effector diferentes para atingir proporções, seguido por medição da libertação de crómio sobrenadante com um contador gama. Um defeito significativo cirurgia induzida em citotoxicidade das células NK, juntamente com uma recuperação significativa da NK morte após a administração perioperatória de vírus oncolítico e influenza vacina em comparação com a cirurgia por si só foi observada (Figuras 2C e 2D). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a supressão das células NK perioperatória podem ser tratados com sucesso e doença metastática reduzida com terapias imunoestimulantes novos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> Figura 1. Vacina de vírus influenza e Novel anti-câncer oncolítico como terapia perioperatória contra aumento induzido por cirurgia de metástases pulmonares. Avaliação da 4T1 metástases tumorais de pulmão no dia 28 de grupos de tratamento indicado pela (a) fotografias de pulmões representativos, (B) enumeração de tumor de pulmão nódulos e (C) pesos pulmonares. Os dados são representativos de três experiências semelhantes com n = 5-10/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,0001;<html> ns, não significativo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> Figura 2. Estresse cirúrgico aumenta metástases tumorais pulmonares, ao alterar as células NK. (A, B) Quantificação de metástases de tumores pulmonares em ratinhos salientou cirurgicamente tratados com terapia perioperatória romance. (C, D) A capacidade de DX5 + purificada a partir de células NK cirurgicamente forçado e controlos não tratados, para matar células tumorais. Os dados são apresentados como a percentagem média (+ / - SD) de libertação de crómio de poços triplicados para o E indicada: rácios t. Os dados são representativos de três experiências semelhantes em que n = 4-5/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,005; ns, não significativa)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um modelo de tumor do rato do estresse cirúrgico é usado para explorar como a imunossupressão pós-operatória promove a doença metastática e avaliar terapias perioperatórios immunostimulatory.

Um tumor modelo de estresse cirúrgico para explorar os mecanismos de pós-operatório Imunossupressão e Avaliar Novel perioperatórios Imunoterapias Rato

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

O objetivo geral deste procedimento é observar o efeito da imunoterapia administrada no período perioperatório na redução de metástases, utilizando um modelo murino de tumor e estresse cirúrgico. Isso é realizado primeiramente pela injeção de quatro células tumorais T1 na bolsa de gordura mamária do camundongo, a fim de estabelecer um tumor primário. No dia 13, ou um dia antes da cirurgia oncológica, é administrada a imunoterapia, a qual se hipotetiza atenuar a doença metastática pós-operatória no dia 14, após o implante das células tumorais.O tumor primário é ressecado, seguido por estresse cirúrgico adicional na forma de nefrectomia abdominal e um subconjunto de camundongos. O passo final consiste em sacrificar e quantificar o número de nódulos tumorais metastáticos nos pulmões de todos os camundongos. Em última análise, este modelo de camundongo de metástases espontâneas e estresse cirúrgico é utilizado para demonstrar o efeito benéfico da imunoterapia perioperatória.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da oncologia cirúrgica, como a forma como cirurgias maiores impactam o sistema imunológico e, consequentemente, a formação de doenças metastáticas no período pós-operatório, bem como como as terapias imunológicas podem ser utilizadas para atenuar esse efeito. Demonstrará este procedimento Christiano 10 dusa, um técnico de pesquisa e do laboratório da Dra. Rebecca. Para preparar o cultivo celular tumoral, comece colocando células tumorais 41 não modificadas em DMEM completo em placas de cultura tecidual de 10 centímetros e incube-as a 37 graus Celsius e 5%CO2 em uma estufa de cultura tecidual.Divida as culturas duas a três vezes por semana conforme necessário para que as células não excedam 80% de confluência. Dentro de um mês após o estabelecimento da cultura celular, comece a colher as células tumorais aspirando o meio de cultura da placa de cultivo de tecidos. Adicione 10 mililitros de PBS estéril 1 X contendo 2 mililitros de EDTA e incube a placa a 37 graus Celsius, 5% CO2, por cinco a sete minutos.Em seguida, após remover a solução de PBS da placa, lave a placa duas a três vezes com PBS e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. A seguir, centrifugue as células em uma centrífuga de bancada a 500 Gs e quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a aspiração dos sobrenadantes, re-suspenda o pellet celular em DMEM sem soro.Em seguida, utilize um contador de células para determinar a concentração celular e dilua as células com meio sem soro até uma concentração de um vezes 10 à sexta células por 500 microlitros e coloque as células no gelo uma hora antes da cirurgia. Injete um camundongo por via subcutânea com 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina para controle da dor. Após anestesiar o camundongo com 2,5% de ISO fluorina, pinçe a almofada da pata para garantir um nível adequado de anestesia.Em seguida, carregue uma seringa ultrafina de meia polegada com agulha de 30 graus com exatamente 50 microlitros da suspensão de células tumorais. Toque na lateral da seringa para desprender bolhas de ar. Mantendo a anestesia com fluoreto ISO, posicione o camundongo com a face ventral voltada para cima sobre a mesa cirúrgica.Agora introduza a agulha horizontalmente e diretamente no quarto coxim de gordura metacárpica e administre lentamente o volume da seringa. O procedimento deve levar cerca de um minuto para ser concluído. Utilize um cotonete para limpar qualquer vazamento após a injeção.Permita que o camundongo se recupere da anestesia antes de devolvê-lo à sua gaiola. Continue o manejo da dor administrando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea a cada oito horas durante dois dias, no 13º dia após a injeção de células. Use um paquímetro externo para medir o tamanho do tumor primário.Meça o maior diâmetro longitudinal ou comprimento e o maior diâmetro transversal ou largura com um paquímetro. A fórmula elipsoidal modificada é utilizada para calcular o volume tumoral como metade do comprimento multiplicado pelo quadrado da largura. Neste momento, considerando que o tumor primário apresenta aproximadamente um centímetro cúbico, o agente terapêutico perioperatório de escolha, que neste caso é o vírus oncolítico em um x, e o PBS estéril foram preparados.Carregue uma seringa de insulina de meia polegada com agulha de 27 gauge com exatamente 100 microlitros da terapia com vírus oncolítico. Remova todas as bolhas de ar da seringa. Em seguida, coloque um camundongo em um dispositivo de contenção, deixando a cauda acessível.Usando água morna da torneira, aqueça suavemente a cauda. Para visualizar as veias laterais da cauda, selecione uma veia lateral e injete o vírus oncolítico. Se a agulha for inserida corretamente em uma veia lateral, nenhuma resistência deverá ser sentida ao pressionar a seringa.Quando terminar, devolva o camundongo à sua gaiola durante a noite, 14 dias após a injeção celular Postum. Trate o camundongo subcutaneamente com 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina uma hora antes da cirurgia para controle da dor, induza e mantenha anestesia utilizando 2,5% de ISO fluorina. Após fazer uma incisão de pele de um a dois centímetros, remova cuidadosamente o tumor primário inteiro de quatro T um da prega de gordura mamária; o tumor e quaisquer detritos aderidos devem sair em uma única peça.Guarde o tumor em formol para análise posterior de imunohistoquímica. Após a ressecção do tumor, feche a incisão com dois a três grampos de nove milímetros. O próximo passo é realizar uma cirurgia maior em um subconjunto dos camundongos.Inicie com uma incisão mediana ventral através da pele e da camada subcutânea. Em seguida, faça uma incisão de três a quatro centímetros na linha do cotovelo para acessar o peritônio. Agora, desloque os intestinos sobrejacentes para um dos lados a fim de expor o lado interior esquerdo do abdome.Mantenha os intestinos úmidos com uma gaze estéril embebida em solução salina. Em seguida, usando uma pinça cirúrgica romba, segure suavemente o rim esquerdo. Depois, use um fio de seda trançada encerada 3,0 amarrado em forma de laço para ligar o hilo do rim esquerdo.Fixe o ponto com três nós cirúrgicos. Agora, remova o rim esquerdo com tesoura cirúrgica. Inspecione cuidadosamente o laço do ponto para garantir que a hemostasia adequada tenha sido alcançada.Em seguida, feche a camada subcutânea com ponto contínuo em alça utilizando fios absorvíveis trançados 5-0. Em seguida, feche a camada da pele com grampos de 9 milímetros. A nefrectomia deve levar 10 minutos por animal.Após a recuperação, devolva o animal à sua gaiola e continue o manejo da dor por dois dias, administrando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina subcutânea a cada oito horas. Após 28 dias da injeção do tumor 4T1, eutanazie o camundongo e pulverize-o com etanol a 70%. Inicie a remoção dos pulmões usando tesoura para fazer uma incisão inicial logo abaixo da caixa torácica. Corte a pele e a camada subcutânea ao longo da linha média ventral da cavidade torácica para expor o tórax.Em seguida, faça incisões laterais através da pele e do tecido de cada lado até o pescoço. Agora, segure suavemente os pulmões enquanto corta o tecido conjuntivo até que os pulmões estejam soltos. Corte a traqueia acima da bifurcação, que mantém os lobos direito e esquerdo unidos.Em seguida, mergulhe os pulmões extraídos em PBS frio para remover qualquer sangue residual e coloque-os em Formalina Tamponada a 10% para finalização, fotografando os pulmões para avaliação de metástases tumorais e pesando-os para quantificação da carga tumoral. Quatorze dias após a ressecção do tumor 4T1, os pulmões foram coletados e visualizados para metástases, mostrados aqui como o pulmão de um camundongo que não foi submetido à nefrectomia abdominal. Algumas metástases tumorais são visíveis.Em contraste, uma nefrectomia cirúrgica imediatamente após a ressecção tumoral resultou em um aumento visível no número de metástases pulmonares. Esta fotografia mostra pulmões de um camundongo tratado com vírus oncolítico após ressecção tumoral e nefrectomia; aqui são mostrados pulmões de um camundongo tratado com vacina contra influenza após ressecção tumoral e nefrectomia. A contagem de nódulos tumorais pulmonares em cada uma dessas categorias mostra um aumento claro no número de metástases pulmonares e de camundongos com cirurgia de nefrectomia, em comparação com aqueles sem cirurgia ou com intervenção terapêutica pré-operatória. Os pulmões dos camundongos submetidos à cirurgia de nefrectomia, mas sem terapia pré-operatória, pesam significativamente mais do que as demais categorias experimentais.Assim, a administração pré-operatória de vírus oncolítico replicante e vacina inativada contra influenza resgatou significativamente os efeitos prometastáticos de cirurgia de grande porte após ressecção tumoral. Esses gráficos mostram o número de tumores pulmonares em camundongos com número normal ou intacto de células NK e em camundongos cujas células NK foram esgotadas farmacologicamente usando anasi ALO GM um. Os camundongos com células NK esgotadas apresentaram um efeito terapêutico reduzido das imunoterapias peroperatórias com vírus oncolítico ou vacina contra influenza.Isso sugere que as células NK desempenham um papel mediador na prevenção de metástases após o tratamento com vacina. Para caracterizar ainda mais a função das células NK, a citotoxicidade de células NK ex vivo foi avaliada; células positivas para DX5 purificadas de camundongos sob estresse cirúrgico e controles não tratados foram cultivadas com células-alvo YAC-1. A linha contínua preta indica a capacidade de citotoxicidade das células NK de camundongos não tratados, e a linha pontilhada preta demonstra a capacidade de citotoxicidade das células NK de camundongos sob estresse cirúrgico.A diminuição na porcentagem de citotoxicidade mostrada pelo deslocamento descendente da linha sólida preta para a linha tracejada preta demonstra um defeito na função citotóxica das células NK em camundongos após cirurgia. As linhas sólidas cinzas indicam a capacidade de citotoxicidade das células NK de camundongos que receberam terapia imunológica, seja vírus oncolítico ou vacina contra influenza, mas sem cirurgia. As linhas tracejadas cinzas indicam a capacidade de citotoxicidade das células NK de camundongos que receberam terapia imunológica perioperatória e cirurgia.A diminuição na porcentagem de citotoxicidade mostrada pelo deslocamento descendente da linha sólida cinza para a linha tracejada cinza demonstra um defeito na função citotóxica das células NK em camundongos após cirurgia, mesmo recebendo terapia imunológica no período perioperatório. Mais importante ainda, as linhas tracejadas cinza ainda estão muito acima das linhas tracejadas pretas. Isso sugere que pode ser possível reverter a disfunção citotóxica induzida pela cirurgia nas células NK com terapia imunológica no período perioperatório.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um modelo animal de metástases espontâneas e estresse cirúrgico por meio do estabelecimento de tumores primários mamários. Ressecar os tumores primários, induzindo estresse cirúrgico adicional por nefrectomia, e avaliar os nódulos tumorais metastáticos pulmonares no ponto final. Além disso, você deverá compreender como este modelo pode ser usado para estudar os efeitos supressores da cirurgia sobre o sistema imunológico inato e a capacidade das imunoterapias de reverter esse efeito.

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