Um tumor modelo de estresse cirúrgico para explorar os mecanismos de pós-operatório Imunossupressão e Avaliar Novel perioperatórios Imunoterapias Rato

O objetivo geral deste procedimento é observar o efeito da imunoterapia administrada no período perioperatório na redução da metástase e de um modelo de tumor e estresse cirúrgico em camundongos. Isso é feito injetando primeiro quatro células tumorais T um na almofada de gordura da memória do camundongo para estabelecer um tumor primário. No dia 13 ou um dia antes da cirurgia oncológica, é administrada imunoterapia, que se supõe atenuar a doença metastática pós-operatória no dia 14, após a implantação das células tumorais.

O tumor primário é ressecado, seguido por estresse cirúrgico adicional na forma de nefrectomia abdominal e um subconjunto de camundongos. A etapa final é sacrificar e quantificar o número de nódulos tumorais de pulmão metastáticos em todos os camundongos. Em última análise, este modelo de camundongo de metástases espontâneas e estresse cirúrgico é usado para mostrar o efeito benéfico da imunoterapia perioperatória.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oncologia cirúrgica, como o impacto da cirurgia de grande porte no sistema imunológico e, como resultado, na formação de doença metastática no período pós-operatório, e como as terapias imunológicas podem ser usadas para atenuar esse efeito. Demonstrando este procedimento estará Christiano 10 dusa, um técnico de pesquisa e laboratório da Dra. Rebecca Para configurar a cultura de células tumorais. Comece colocando 41 células tumorais não modificadas em DMEM completo em placas de cultura de tecidos de 10 centímetros e incubando-as a 37 graus Celsius 5%CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.

Divida as culturas duas a três vezes por semana, conforme necessário, para que as células não excedam 80% de confluência. Dentro de um mês após a configuração da cultura de células, comece a colher as células tumorais aspirando o meio de cultura da placa de cultura de tecidos. Adicione 10 mililitros de um PBS X estéril contendo dois mililitros de EDTA e incube a placa a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por cinco a sete minutos.

Em seguida, depois de remover a solução de PBS da placa, enxágue a placa duas a três vezes com PBS e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue as células em uma centrífuga de bancada a 500 Gs e quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a aspiração, os sobrenadantes ressuspendem o pellet celular e o DMEM livre de soro.

Em seguida, use um contador de células para determinar a concentração de células e dilua as células com meio livre de soro para uma vezes 10 elevado a seis células por 500 microlitros e coloque as células no gelo uma hora antes da cirurgia. Injete um camundongo por via subcutânea com 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina para controle da dor. Depois de anestesiar o mouse com flúor 2,5% ISO, aperte a almofada do pé para garantir um nível adequado de anestesia.

Em seguida, carregue uma seringa ultrafina de calibre 30 de meia polegada com precisamente 50 microlitros da suspensão de células tumorais. Bata na lateral da seringa para desalojar as bolhas de ar. Continuando a anestesia com flúor ISO, coloque o lado ventral do camundongo para cima na mesa cirúrgica.

Agora introduza a agulha horizontalmente e diretamente na quarta almofada de gordura da memória e distribua lentamente o volume da seringa. Deve demorar cerca de um minuto a terminar a injeção. Use um cotonete para limpar qualquer vazamento após a injeção.

Permita que o camundongo se recupere da anestesia antes de devolvê-lo à gaiola. Continue o controle da dor administrando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea a cada oito horas por dois dias a 13 dias após a injeção de células. Use um paquímetro externo para medir o tamanho do tumor primário.

Meça o maior diâmetro ou comprimento longitudinal e o maior diâmetro ou largura transversal com um paquímetro. A fórmula elipsoidal modificada é usada para calcular o volume do tumor como metade do comprimento vezes a largura ao quadrado. Neste momento, supondo que o tumor primário meça aproximadamente um centímetro cúbico, o reagente de terapia perioperatória de escolha, que neste caso é o vírus oncolítico em um x, PBS estéril foi preparado.

Carregue uma seringa de insulina de calibre 27 de meia polegada com precisamente 100 microlitros da terapia com vírus oncolíticos. Remova todas as bolhas de ar da seringa. Em seguida, coloque um rato em uma contenção, deixando a cauda acessível.

Usando água morna da torneira, aqueça suavemente a cauda. Para visualizar as veias laterais da cauda, selecione a veia lateral da cauda e injete-a com o vírus oncolítico. Se a agulha for inserida adequadamente em uma veia lateral, nenhuma resistência deve ser sentida ao pressionar a seringa.

Quando terminar, retorne o mouse à sua gaiola durante a noite em 14 dias após a injeção de células. Trate o camundongo por via subcutânea com 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina uma hora antes da cirurgia para controle da dor, induza e mantenha a anestesia usando flúor 2,5% ISO. Depois de fazer uma incisão na pele de um a dois centímetros, remova suavemente todo o tumor primário quatro T um da almofada de gordura mamária, o tumor e quaisquer detritos anexados devem sair inteiros.

Guarde o tumor em Formina para posterior análise imuno-histoquímica. Após a excisão do tumor, feche a incisão com dois a três grampos de nove milímetros. O próximo passo é realizar uma grande cirurgia em um subconjunto de camundongos.

Comece com uma incisão na linha média ventral através da pele e da camada subcutânea. Em seguida, faça uma incisão de três a quatro centímetros no cotovelo linear para acessar o peritônio. Agora, mova as entranhas sobrepostas para um lado para expor o lado interno esquerdo do abdômen.

Mantenha os intestinos úmidos com uma gaze estéril embebida em solução salina. Em seguida, usando uma pinça cirúrgica romba, segure o rim esquerdo suavemente. Em seguida, use uma sutura de seda trançada revestida com cera 3.0 amarrada em um laço para ligar o hilo do rim esquerdo.

Prenda a sutura com três nós cirúrgicos. Agora remova o rim esquerdo com uma tesoura cirúrgica. Inspecione cuidadosamente o laço de sutura para garantir que a hemostasia adequada seja alcançada.

Em seguida, feche a camada subcutânea com uma sutura de alça contínua usando cinco pontos absorvíveis trançados oh. Em seguida, grampeie a camada de pele usando grampos de nove milímetros. A nefrectomia deve levar 10 minutos por animal.

Quando recuperado, devolva o animal à sua gaiola e continue o controle da dor por dois dias, administrando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina subcutânea a cada oito horas aos 28 dias após a injeção de quatro T um tumor, eutanasiar o camundongo e borrifá-lo com 70% de etanol. Comece a remoção do pulmão usando uma tesoura para fazer uma incisão inicial logo abaixo da caixa torácica. Corte a pele e a camada subcutânea ao longo da linha média ventral da cavidade torácica para expor o tórax.

Em seguida, faça incisões laterais através da pele e do tecido de cada lado até o pescoço. Agora, segure suavemente os pulmões enquanto corta o tecido conjuntivo até que os pulmões estejam livres. Corte a traqueia acima da bifurcação, que manterá os lobos esquerdo e direito juntos.

Em seguida, mergulhe os pulmões extraídos em PBS frio para remover qualquer sangue residual e coloque-os em acabamento de formina tamponada a 10%, fotografando os pulmões para avaliação de metástases tumorais e pesando-os para quantificação da carga tumoral. 14 dias após a ressecção de quatro tumores T um, os pulmões foram colhidos e visualizados para metástases mostradas aqui como o pulmão de um camundongo que não fez nefrectomia abdominal. Alguns tumores metastizados são visíveis.

Em contraste, uma nefrectomia cirúrgica imediatamente após a ressecção do tumor resultou em um aumento visível no número de metástases pulmonares. Esta fotografia mostra pulmões de um camundongo tratado com vírus oncolítico após ressecção de tumor e nefrectomia mostrados aqui são pulmões de um camundongo tratado com uma vacina contra influenza após ressecção de tumor e nefrectomia A contagem dos nódulos tumorais de pulmão em cada uma dessas categorias mostra um claro aumento no número de metástases pulmonares e camundongos com cirurgia de nefrectomia em comparação com aqueles sem cirurgia, ou aqueles com intervenção terapêutica pré-operatória. Os pulmões dos camundongos com cirurgia de nefrectomia, mas sem terapia pré-operatória, pesam significativamente mais do que as outras categorias de teste.

Assim, a administração pré-operatória de vírus oncolítico replicante e vacina inativada contra influenza resgatou significativamente os efeitos prometastáticos de cirurgia de grande porte após ressecção tumoral. Esses gráficos mostram o número de tumores pulmonares em camundongos com números normais ou intactos de células NK e em camundongos cujas células NK foram farmacologicamente esgotadas usando anasi ALO GM um. Os camundongos depletados de NK tiveram um efeito terapêutico reduzido das imunoterapias perioperatórias com vírus oncolítico ou vacina contra influenza.

Isso sugere que as células NK desempenham um papel mediador na prevenção de metástases após o tratamento vacinal. Para caracterizar ainda mais a função das células NK, a morte ex vivo de células NK foi avaliada purificar DX cinco células positivas de controles estressados cirurgicamente e não tratados foram cultivadas com células-alvo yak one. A linha sólida preta indica a capacidade de matar células NK de camundongos não tratados e a linha pontilhada preta demonstra a capacidade de matar células NK de camundongos estressados cirurgicamente.

A diminuição na porcentagem de citotoxicidade mostrada pela mudança para baixo da linha sólida preta para a linha pontilhada preta demonstra um defeito na função citotóxica das células NK e nos camundongos após a cirurgia. As linhas sólidas cinzas indicam a morte de células NK de camundongos que receberam terapia imunológica, vírus oncolítico ou vacina contra influenza, mas sem cirurgia. As linhas pontilhadas cinza indicam a capacidade de matar células NK de camundongos que receberam terapia imunológica perioperatória e cirurgia.

A diminuição na porcentagem de citotoxicidade mostrada pela mudança para baixo da linha sólida cinza para a linha pontilhada cinza demonstra um defeito na função citotóxica das células NK e nos camundongos após a cirurgia, apesar de receberem terapia imunológica perioperatória. Mais importante ainda, as linhas pontilhadas cinza ainda são muito mais altas do que as linhas pontilhadas pretas. Isso sugere que pode ser possível resgatar a disfunção citotóxica de células NK induzida pela cirurgia com imunoterapia perioperatória.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um modelo animal de metástases espontâneas e estresse cirúrgico, estabelecendo os melhores tumores primários. Ressecção dos tumores primários induzindo estresse cirúrgico adicional por nefrectomia e avaliação de nódulos tumorais metastáticos pulmonares no ponto final. Além disso, você deve entender como esse modelo pode ser usado para estudar os efeitos supressores da cirurgia no sistema imunológico inato e a capacidade das imunoterapias de reverter esse efeito.