Name: Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a estrutura do fator VIII em nanotubos lipídicos usando microscopia criogênica eletrônica. Este método combina organização helicoidal com algoritmos de reconstrução 3D para elucidar a estrutura ligada à membrana.

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Este trabalho é apoiado por uma concessão Nacional Scientist Desenvolvimento da American Heart Association: 10SDG3500034 e UTMB-BCN arranque fundos para SSM. Os autores reconhecem as instalações Cryo-EM e computação científica no Centro Sealy de Biologia Estrutural em UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), bem como os drs. Steve Ludtke e Ed Egelman para obter ajuda com os algoritmos de reconstrução helicoidais 2D e 3D.

1. Exemplo de Preparação <ol><li> Humana troca de tampão de FVIII-14 e do BDD-FVIII porcino BDD 15 contra tampão HBS-Ca (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, pH = 7,4) e concentrado para 1,2 mg / ml. Manter a solução proteica à temperatura de -80 ° C. </li><li> Preparar os nanotubos de lípidos (LNT), misturando galactosilceramida (GC) e fosfatidilserina (PS) a 1:04 w / w proporção em clorofórmio. Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de árgon e solubilizar os lípidos em tampão HBS de 1 mg / ml. Manter a solução LNT a 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-Microscopia eletrônica de FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Preparação de Amostras <ol><li> Brilho de descarga a 300 mesh Quantifoil R2 / 2 grades de cobre (lado carbono up) em uma mistura de O 2 e H 2 gás por 10 seg a 50 W. </li><li> Misturar as soluções de FVIII e LNT em tampão HBS-Ca em 1:1 w / w proporção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Aplique uma gota de 2,5 mLde amostra de FVIII-LNT à grade microscopia electrónica hidrofílico na câmara humidificada Vitrobot Mark IV (100% de humidade). </li><li> Blot e flash congelar a grade (uma mancha de 3,5 seg, força apagar 1) em líquido C 2 H 6, arrefecido por N2 líquido para obter gelo amorfo. </li><li> Redes de lojas em caixas de armazenamento sob N2 líquido (LN2). </li></ol></li><li> Coleta de Dados Cryo-EM NOTA: O JEM2100-LaB6 (ano 2010) está equipado com um sistema operacional TEMCON consistindo de um computador conectado à microscópio eletrônico, uma tela com janelas de leitura do sistema de vácuo, sistema de iluminação, HT, as correntes de lente e assim por diante, e dois painéis: esquerda e direita, colocado em ambos os lados da coluna. A mudança feixe de X, Y botões (SHIFT Y, SIFT Y) eo multifuncionais (DEF / STIG) botões são em ambos os painéis. No painel da esquerda é o botão de iluminação (Brigthness). No painel direito são: a ampliação (MAG / CAM COMPRIMENTO) e foco (Foco) maçanetas e os três imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) e um de difração (DIFF) modos de botões. Nós adquirimos os nossos dados em MAG1 em alpha 2. As condições mínimas doses de iluminação (MDS) necessários para a aquisição de dados Cryo-EM são definidas com F1 através de botões F6, top de linha no painel da direita. Neste protocolo as definições genéricas são usados: F1 - levantar / tela inferior, F2 - modo de pesquisa, F3 - Modo FOCUS, F4 - Modo PHOTO, F5 - MDS OFF / ON e F6 - BEAM BRANCO, usado para proteger o espécime de radiação danificar, desviando o feixe. <ol><li> Coloque-titular crio o na estação crio e encher o Dewar do titular ea estação crio com LN2. Quando a temperatura atinge -192 ° C, obturador aberto na ponta titular, local previamente congelado grade Cryo-EM, para o lugar designado e prenda com um grampo de anel. </li><li> Insira titular crio o no microscópio eletrônico. Encher o Dewar do titular crio o ea câmara anti-contaminador com LN2. Aguarde até que o titular se estabilize por 30-60 min. Pressione F6 e emtransformar o filamento em. Quando o filamento está saturado, pressione F6 e abra obturador no suporte para ver o grid. </li><li> Imprensa Baixo Mag / alfa 1 (fixado em 200X mag) e localizar áreas com gelo fino na grade. </li><li> Mudar para MAG 1/alpha 2 para definir o modo de dose mínima (MDS) e adquirir dados Cryo-EM em doses baixas de elétrons, sem danificar a amostra. <ol><li> Pressione F2 para definir o modo de pesquisa. Definir ampliação a 40.000 x. Aumentar feixe com botão brigtness a dose mínima de elétrons ~ 0,04 e - / a 2 · s. Imprensa DIFF para alternar para o modo de difração. Defina o comprimento da câmara a 120 cm, com botão de MAG / CAM comprimento. Localizar áreas da grade dentro das áreas pré-seleccionadas em LOWMAG que têm nanotubos de lípidos nos orifícios do filme de carbono. </li><li> Pressione F4 para definir o modo de foto em 40.000 ampliação X e definir iluminação com botão BRILHO em doses de 16-25 e - / a 2 · s. Pressione o botão padrão Focus para definir as condições de foco ajustando o Z-alturada amostra com os Z Botões Cima / Baixo (painel de controle à direita). Definir desfocagem entre -1,5 e -2,5 m. </li><li> Alinhe SEARCH e modo FOTO, desenhando um quadrado na janela VISTA AO VIVO no monitor da câmera digital no modo de pesquisa correspondente à área a ser trabalhada no modo de foto. </li><li> Pressione F3 para definir o modo de foco em 100.000 ampliação X. Foco de iluminação para cobrir o chip CCD (~ 4-5 cm de raio) e fora do eixo para não irradiar a área a ser trabalhada no modo de foto. Ajuste de desfocagem para ~ -1,5 e -2,5 mM com o botão de foco e corrigir o astigmatismo da imagem com botões DEF / STIG. </li></ol></li><li> Selecione o FVIII-LNT a ser trabalhada no modo de Pesquisa por meio da aquisição de imagens ao vivo na janela de exibição ao vivo na tela da câmera digital. Centralize o FVIII-LNT no quadrado desenhado na janela de visualização em directo. </li><li> Gravar uma imagem digital da câmera CCD de 52.000 X ampliação eficaz e 0,5 seg exposição mudando para o modo foto e clicando no AcquirBotão E na micrografia monitor da câmera digital. As condições de aquisição de imagem são definidas como o branco do feixe (SHUTTERS) aberto apenas quando a imagem é adquirida no modo de foto. </li><li> Verifique a qualidade e desfocagem da imagem adquirida, pressionando CTRL-F para obter Transformada Rápida de Fourier (FFT). </li></ol></li></ol> 3. Reconstrução 3D NOTA: O software de análise de imagem utilizado para a análise 2D e 3D: EMAN2 e IHRSR estão disponíveis gratuitamente. EMAN2 pode ser baixado do http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. O software IHRSR pode ser obtido a partir de Prof Egelman: egelman@virginia.edu. Os refinamentos finais IHRSR são executados no Texas Advanced Computing agrupamento de centro: http://www.tacc.utexas.edu/ na Universidade do Texas, Austin. O algoritmo de reconstrução 3D mostrado na Figura 1 consiste em duas etapas principais: em primeiro lugar a seleção de um conjunto homogêneo de segmentos helicoidais (partículas) com a referência livre alignme 2Dnt (RFA) algoritmos implementados em EMAN 2, segunda alcançar uma reconstrução 3D com base nos parâmetros helicoidais e algoritmos de projeção de volta incorporadas IHRSR. O primeiro passo utiliza os programas desenvolvidos para a seleção de conjuntos de partículas homogêneas para a reconstrução 3D com partículas SPA Individual (algoritmos) para os quais EMAN2 foi especificamente desenvolvido e distribuído: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Este passo foi adaptada aos dados Cryo-EM. O segundo passo é conseguido com o algoritmo IHRSR, que é concebido especificamente para o tipo de conjuntos helicoidais obtidos com as formas de Factor VIII recombinante. Este algoritmo foi extensivamente documentada através da literatura científica 12. <ol><li> Realizar análise de imagem em 2D com a suíte de processamento de imagem EMAN2 científico: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 para selecionar partícula homogênea (segmento helicoidal) conjuntos para a reconstrução helicoidal. <ol><li> Selecione micrografias Cryo-EM com straight e bem organizada tubos helicoidais com o software da câmera digital e ferramentas de visualização. </li><li> Inverter, normalizar e filtrar por raios-X pixels na GUI e2workflow.py, reconstrução partícula única opção (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importe as imagens invertidas, normalizados e de pixel de raios-X filtrados na GUI e2helixboxer.py. Selecione tubos helicoidais FVIII-LNT e segmento em 256 x 256 pixels (2.9 Å / PIX), com 90% de sobreposição usando: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Avaliar a desfocagem das micrografias originais e aplicar a função de transferência de contraste (CTF) correção (apenas correção de fase) para os segmentos helicoidais dos mesmos micrografias com a opção e2ctf.py incorporado no e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Gerar partículas iniciais (segmentos helicoidais) define na GUI e2workflow.py opção - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Calcular médias classe 2D com o algoritmo e2refine2d.py aplicação referência livre de classificação k-média para selecionar os conjuntos de dados homogêneos com o mesmo LNT diâmetro e grau de ordem helicoidal (Figura 2), seguindo o roteiro: &quot;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - input = INPUT.hdf - LCN = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = média - normproj-classkeepsig &#39;, alterando o valor NCLs conformidade. <ol><li> Classifique as definidas no &#39;LCN = 151&#39; 150 classes de mais de 8 iterações com &#39;classkeep = 0,8&#39; dados iniciais, o que significa que as partículas com menos de 80% de similaridade com a média classe são excluídos da classe dada. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Mesclar partículas a partir das médias de classecom difração helicoidal pronunciado em e2display.py para criar conjunto de dados intermediário. </li><li> Classificar os dados intermediários estabelecidos em 50 classes &#39;LCN = 51&#39; para diferenciar classes com mesmo diâmetro e grau de ordem. </li><li> Mesclar partículas de classes com mesmo diâmetro e grau de ordem em e2display.py para criar o conjunto de dados final para a reconstrução tridimensional: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Executar a reconstrução helicoidal com o algoritmo iterativo helicoidal real espaço Reconstrução (IHRSR), como descrito no Egelman 17, 18. <ol><li> Estime o aumento, Δz (A) da hélice FVIII-LNT do Fourier combinado transformar as partículas no conjunto de dados final. </li><li> Defina o ângulo azimutal ΔΦ (º), executando refinamentos IHRSR paralelas com um Δz constante, aumentando ΔΦ de 576; a 60 ° em incrementos de 5 °. </li><li> Executar 100 ciclos IHRSR consecutivos para cada conjunto com um cilindro inexpressivo como um volume inicial e os parâmetros iniciais Δz helicoidais e ΔΦ conforme definido no 3.2.1 dados finais. e 3.2.2. </li><li> Inspecione os volumes finais para a convergência dos parâmetros helicoidais e correspondência entre as médias de classe da classificação 2D do conjunto final de dados e as projeções da reconstrução IHRSR final. </li><li> Impor simetria para as reconstruções 3D finais, correspondente à unidade de distribuição assimétrica observada nos volumes 3D assimétricos finais: de 4 vezes para o FVIII humano-LNT e 5 vezes para a porcino FVIII-LNT. Correr mais 100 ciclos de refinamento para gerar uma reconstrução 3D simetrizada final. </li><li> Calcule a curva de correlação Shell Fourier para ambos os volumes, primeiro separando os estabelecidos em pares e ímpares dados correspondentes: &#39;e2proc2d.py &lt;ENTRADA&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Em seguida, execute 100 IHRSR refinamentos consecutivos, tal como descrito no ponto 3.2.3. Calcule o FSC dos volumes 3D criadas a partir dos conjuntos de dados pares e ímpares: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Visualize e Segmento os volumes FVIII-LNT em UCSF quimera. </li><li><ol><li> Abra os volumes finais da etapa 3.2.5. em UCSF Chimera e definir o nível de contorno para 0.005 no TOOLS&gt; VOLUME DE DADOS&gt; opção VIEWER VOLUME. </li><li> Em Ferramentas&gt; VOLUME DE DADOS&gt; mapa de segmento, selecione o volume no guia mapa de segmento e clique em cada segmento de mercado o volume. </li><li> Segmentos do Grupo corresponde a uma célula unidade, selecionando com CTRL + SHIFT e clique grupo. </li><li> Cor dos segmentos por célula unitária e hélice com Ações&gt; opção de cor para enfatizar as características estruturais. </li></ol></li></ol> 4. Electron Tomografia <ol><li> Coradas negativamente FVIII-LNT Preparação de Amostras <ol> &lt;li&gt; Preparar amostras de FVIII-LNT como para as experiências Cryo-EM. </li><li> Fulgor descarrega grelha de cobre de malha 300-revestidas de carbono (do lado de carbono acima) numa mistura de O 2 e gás H2 durante 10 segundos a 50 W como para experiências Cryo-EM. </li><li> Aplique uma gota de 2,5 mL de suspensão FVIII-LNT com 6 nm nanopartículas de ouro coloidal para a grade, seque o excesso de líquido e manchar negativamente pela aplicação de 5 mL solução 1% acetato de uranila por 2 min. Seque o excesso de líquido e secar a grade. </li></ol></li><li> Coleta de Dados Electron Tomografia <ol><li> Transfira a grade no suporte de inclinação única. </li><li> Transfira o titular no microscópio eletrônico. </li><li> Colete série de inclinação automaticamente com o software SerialEM 19 ° em incrementos de 2 num intervalo angular de -60 ° a 60 ° e gravar imagens com uma câmera CCD de 52.000 X ampliação efetiva, -6 a -10 mM desfocagem e da dose de elétrons de 150 - 170 elementosctrons / a 2 · s por tomografia. </li></ol></li><li> Electron Tomografia Reconstrução do FVIII-LNT Nota: Reconstruir a série inclinado pFVIII-LNT e hFVIII-LNT adquirida em 4.2. com a opção ETomo do software IMOD seguindo o tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> Usando uma janela de terminal, abra a tomografia em 3dmod. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin o tomograma por 4 com o IMOD BINVOL comando para diminuir o tamanho da tomografia. </li><li> Selecione o ângulo adequado para rodar o nanotubo lipídico ao longo do eixo Y no tomografia finalmente resolvido usando o comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Gire a tomografia completa com o comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Cortar o nanotubo lipídico selecionado orientada ao longo do eixo Y com o comando IMOD CLIP redimensionar. </li><li> Abra o sub-tomografia cropped com 3dmod. </li><li> Clique sobre o tomograma para visualizar o arranjo de moléculas de factor VIII ao longoas fatias no eixo Z e ao longo do eixo Y no volume sub-tomografia. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência e eles podem ser contatados diretamente em relação a qualquer dos procedimentos publicados neste manuscrito.

Neste trabalho é apresentada uma metodologia para diferenciar entre duas entidades ligadas à membrana das proteínas altamente homólogas: FVIII humano e porcino auto-montada em nanotubos lipídicas nas condições encontradas no corpo humano. No processo descrito, o FVIII humano e porcino são organizados com sucesso de modo helicoidal em nanotubos de lípidos, que é a etapa mais crítica. O próximo passo crítico é o de preservar a amostra em gelo amorfo fino por congela...

A coagulação sanguínea do Factor VIII (FVIII) é um grande glicoproteína de 2332 aminoácidos organizados em seis domínios: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Após a activação da trombina de FVIII actua como co-factor para o Factor IXa no complexo de tenase ligada à membrana. A ligação de FVIII activado (FVIIIa) em FIXa de um modo conforme a membrana melhora a eficiência proteolítica FIXa mais do que 10 5 vezes, o que é crítico para a eficiência da coagulação sanguínea 4. Apesar do papel importante do FVIII desempenha na coagulação e a formação do complexo tenase, a estrutura de FVIII ligado à membrana funcional ainda não foi resolvido. Para resolver esta questão, nanotubos de bicamada lipídica (LNT) ricos em fosfatidilserina (PS), capazes de FVIII de ligação com elevada afinidade 8, 9, e assemelhando-se a superfície de plaquetas activadas têm sido desenvolvidos 10. Organização helicoidal consecutiva de FVIII obrigado a LNT foi provado ser efetividadeve para a determinação da estrutura do FVIII estado ligado à membrana por Cryo-EM 5. Funcionalizado LNT são um sistema ideal para o estudo de proteínas de proteínas e interacções proteína-membrana de proteínas associadas à membrana de forma helicoidal organizadas por Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM tem a vantagem em relação aos métodos tradicionais estruturais, tais como cristalografia de raios-X e RMN, que o espécime é preservado em mais próximo do ambiente fisiológico (tampão, membrana, pH), sem aditivos e isótopos. No caso de FVIII, estudar a estrutura ligada a membrana com esta técnica é ainda mais relevante fisiologicamente, como o LNT assemelham pelo tamanho, forma e composição da pseudopodia das plaquetas activadas, onde os complexos TENase montar in vivo. Defeitos e deficiência de FVIII causa hemofilia A, uma doença hemorrágica grave que afeta 1 em cada 5.000 homens da população humana 4, 6. O mais eterapia ffective para hemofilia A é a administração do FVIII humano recombinante (hFVIII) ao longo da vida. Uma complicação importante da terapia de FVIII recombinante A hemofilia A é o desenvolvimento de anticorpos inibitórios para a forma humana que afecta aproximadamente 30% dos doentes com hemofilia A 13. Neste caso, o FVIII porcino (pFVIII) concentrado é usado, como FVIII exibe suína baixa reactividade cruzada com os anticorpos inibidores contra FVIII humano e formas de complexos funcionais com FIXa humano 7. Estabelecer a organização ligada à membrana de ambos suína e formas de FVIII humanos é importante para compreender a base estrutural da função co-fator FVIII e implicações para a hemostasia sangue. Neste estudo, descrevemos uma combinação de nanotecnologia lipídico, Cryo-EM, e a análise da estrutura concebida para resolver a organização ligada à membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas. Os dados Cryo-EM apresentados e estruturas 3D para porci helicoidal organizadone FVIII humano e em carregado negativamente LNT mostram o potencial da nanotecnologia proposto como base para a determinação da estrutura do FVIII e factores e complexos em um ambiente de membrana fisiológica coagulação ligadas à membrana.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 com LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>operado em 200 kV</td></tr><tr><td>com software de TEMCON</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Cryo-suporte</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>resfriado a -175 &deg; C</td></tr><tr><td>com unidade de controle de temperatura</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD Gatan 4K x 4K</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4.096 x 4.096 pixels a 15 &mu; m/pixel resolução física</td></tr><tr><td>Solarus Modelo 950 limpador de plasma</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grade de cobre de 300 mesh 3 mm revestida</td> com carbono <td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>limpa por plasma por 10 segundos em alta potência</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 mesh</td><td>Microscopy Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>Grades de de 300 mesh revestidas com carbono com furos de 2 mm de diâmetro&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetato de uranila di-hidratado</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>Solução a 1%, filtrada</td></tr><tr><td>Galactosil ceramida</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoil-sn-glicero-fosfo-L-serina</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>Software EM Digital Micrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM software EMAN</td><td>download</td><td></td> grátis<td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; < / a></td></tr> <tr><td>software EM Spider</td><td>download</td><td></td> grátis<td><a href = "http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html ">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html< / a></td></tr> <tr><td>software EM IHRSR</td><td>download</td><td></td> grátis <td>Programas disponíveis em Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr> <tr><td>software EM (IMOD)</td><td>download grátis</td><td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Software EM (SerialEM)</td><td>download</td><td></td> grátis<td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>download</td><td></td> grátis<td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

helicoidal organização dos fatores de coagulação sanguínea viii em lipid nanotubos

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> A microscopia crio-electrão (Cryo-EM) é uma abordagem poderosa para investigar a estrutura funcional de proteínas e complexos em um ambiente de estado e da membrana hidratada 2. Factor de coagulação VIII (FVIII) 3 é um sistema multi-domínio de glicoproteína do plasma sanguíneo. Defeito ou deficiência de FVIII é a causa para o tipo de hemofilia A - um distúrbio de sangramento grave. Após a activação proteolítica, FVIII liga à serina-protease do Factor IX na membrana das plaquetas carregadas negativamente, que é crítica para a coagulação do sangue normal de 4. Apesar de o papel central de FVIII desempenha na coagulação, a informação estrutural para o seu estado ligado à membrana é incompleta 5. Concentrado de FVIII recombinante é o medicamento mais eficaz contra o tipo A hemofilia A e comercialmente disponível de FVIII pode ser expressa como o ser humano, ou de porcino, ambos os complexos funcionais que formam com o Factor IXa humano 6,7. &quot;&gt; Neste estudo apresentamos uma combinação de microscopia Cryo-elétron (Cryo-EM), a nanotecnologia ea estrutura lipídica análise aplicada para resolver a estrutura ligada à membrana das duas formas de FVIII altamente homólogas:. Humana e suína A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal das duas formas de FVIII recombinante funcional em nanotubos de lípidos carregados negativamente (LNT) é descrita. Os resultados representativos demonstram que a nossa abordagem é suficientemente sensível para determinar as diferenças na organização helicoidal entre os dois altamente homóloga em sequência (86% de identidade de sequência ) proteínas. protocolos detalhados para a organização helicoidal, Cryo-EM e tomografia eletrônica (ET) de aquisição de dados são dadas. The bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) análise da estrutura aplicada para obter as reconstruções 3D de humanos e suínos FVIII-LNT é discutido. As estruturas de FVIII-LNT humana e porcina apresentados demonstram o potencial da metodologia proposta para Calculate a organização funcional, ligada à membrana de coagulação sanguínea do Factor VIII em alta resolução.

FVIII suína recombinante humana e foram organizadas com sucesso de modo helicoidal em carregada negativamente simples LNT bicamada, assemelhando-se à superfície das plaquetas activadas. Helicoidal A organização do humano e de porcino FVIII-LNT foi consistente ao longo das micrografias digitais recolhidas (Figura 2). A LNT controle eo humano e FVIII-LNT tubos helicoidais suínos foram selecionados e segmentado, com o GUI e2helixboxer.py e conjuntos de dados iniciais criados com a GUI e2wo...

Nós apresentamos uma combinação de microscopia de Cryo-electron, nanotecnologia lipídica, e a análise da estrutura aplicada para resolver a estrutura ligada a membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas: humana e porcina. A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal as duas formas FVIII recombinante funcionais em nanotubos de lipídios negativamente carregados (LNT) é descrito.

Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

O objetivo geral deste procedimento é mostrar como definir a estrutura do heli do fator VIII organizado em nanotubos lipídicos por microscopia crioeletrônica. Isso é feito primeiro organizando o fator VIII purificado em hélice em nanotubos lipídicos e coletando dados de microscopia crioeletrônica em temperatura de nitrogênio líquido e baixas doses de elétrons. Em seguida, a estrutura ligada à membrana do fator VIII é calculada combinando partículas únicas e algoritmos de reconstrução 3D helicoidal.Em seguida, os dados de tomografia eletrônica são coletados e a reconstrução 3D é gerada. Em última análise, as estruturas de nanotubos lipídicos do fator VIII calculadas são validadas segmentando os volumes 3D e comparando-os com as reconstruções de tomografia. O método demonstrado pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural e da coagulação sanguínea, como qual é a organização ligada à membrana do fator VIII e como ela se relaciona com sua função na coagulação.O GM 2100 lab six está equipado com um sistema operacional TE con que consiste em um computador conectado ao microscópio eletrônico. Uma tela com janelas que lêem o sistema de vácuo, sistema de iluminação, correntes de lente HT e dois painéis esquerdo e direito colocados em ambos os lados da coluna, o deslocamento do feixe, os botões XY e os botões multifuncionais ou de vara surda estão em ambos os painéis. No painel esquerdo está o botão de iluminação ou brilho.O painel direito abriga os botões de ampliação e foco e os três botões para imagem mag um, mag dois e mag baixo e um para o modo de difração. Para este protocolo, adquira dados em mag um em alfa dois usando configurações genéricas. Defina as condições mínimas de iluminação de dose ou MDS necessárias para a aquisição de dados crio-eletromagnéticos com os seis botões F1 a F localizados na linha superior do painel direito.Use F1 para levantar ou abaixar a tela F dois para o modo de pesquisa e F três para focar. Escolha F quatro para o modo de foto, F cinco para desligar e ligar o MDS e F seis para feixe em branco, que é usado para proteger a amostra contra danos causados pela radiação, desviando o feixe. Depois de preparar amostras criogênicas EM, de acordo com o protocolo de texto, coloque o suporte criogênico na estação criogênica e, com nitrogênio líquido, preencha o fazedor do suporte e a estação criogênica.Quando a temperatura atingir 192 graus Celsius negativos, abra o obturador na ponta do suporte, coloque a grade EM criogênica previamente congelada no local designado e use um anel clamp para prendê-lo. Em seguida, insira o suporte criogênico no microscópio eletrônico e use nitrogênio líquido para reabastecer o porta-criogênico e a câmara do antiator. Depois que o suporte estiver estabilizado por 30 a 60 minutos, ligue o filamento.Quando o filamento estiver saturado, pressione F seis e abra o obturador no suporte. Para visualizar a grade, pressione baixo mag alfa um e localize áreas na grade com gelo fino. Em seguida, mude para mag um alfa dois para definir a dose mínima ou o modo MDS e adquira dados criogênicos EM em baixas doses de elétrons para não danificar a amostra.Escolha F dois para definir o modo de pesquisa e defina a ampliação em 40.000 x. Use o botão de brilho para ampliar o feixe para a dose mínima de elétrons de cerca de 0,04 elétrons por angstrom ao quadrado vezes segundos. Em seguida, pressione diff para alternar para o modo de difração com o botão de comprimento do came magnético.Defina o comprimento da câmera para 120 centímetros. Em seguida, localize áreas na grade que possuem nanotubos lipídicos nos orifícios do filme de carbono dentro das áreas pré-selecionadas. Em seguida, pressione F quatro para definir o modo de foto em 40.000 x de ampliação e use o botão de brilho para definir a iluminação em doses de 16 a 25 elétrons por angstrom quadrado vezes segundos.Em seguida, pressione o botão de foco padrão para definir as condições de foco, ajustando a altura Z da amostra com os botões Z para cima e para baixo Defina a desfocagem entre 1.5 e 2.5 micrômetros negativos. Alinhe o modo de pesquisa e foto desenhando um quadrado no modo de pesquisa na janela de visualização ao vivo no monitor da câmera digital correspondente à área a ser fotografada no modo de foto, pressione F três para definir o modo de foco em 100.000 x de ampliação. Em seguida, concentre a iluminação para cobrir o chip CCD e fora do eixo para não irradiar a área a ser fotografada.No modo foto, ajuste a desfocagem entre 1,5 e 2,5 micrômetros negativos para corrigir o astigmatismo da imagem, se necessário. No modo de pesquisa, selecione F oito L e T a serem fotografadas adquirindo imagens ao vivo na janela de visualização ao vivo no centro do monitor da câmera digital, F oito L e T no quadrado desenhado na janela de visualização ao vivo. Mude para o modo de foto e clique no botão adquirir no monitor da câmera de micrografia digital.Para gravar uma imagem digital na câmera CCD, pressione CTRL F para obter uma transformada de Fourier rápida para verificar a qualidade e o desfoque da imagem adquirida. Depois de usar os softwares gratuitos de processamento de imagens científicas Eman two e I-H-R-S-R para realizar análise de imagem 2D e reconstrução helicoidal de acordo com o protocolo de texto. Para visualizar e segmentar os volumes F oito L e T, abra as reconstruções 3D finais nas ferramentas UCSF cera select, mapa de segmentos de dados de volume e, na guia mapa de segmentos, selecione o volume e clique em segmento para segmentar os dados de volume.Em seguida, pressione control shift e clique em agrupar para agrupar segmentos correspondentes a uma célula unitária. Para enfatizar os recursos estruturais, escolha a cor das ações para colorir os segmentos por célula unitária e hélice. Para coletar os dados de tomografia eletrônica, a grade de microscopia eletrônica corada negativamente é transferida para um único suporte de inclinação antes de transferir o suporte para a inclinação do microscópio eletrônico.Séries de fator VIII suíno organizado aliado em nanotubos lipídicos foram coletadas com o software EM seriado. De acordo com o protocolo de texto, o Tom foi reconstruído em IM e visualizado em 3D mod para diminuir o tamanho do para usar imad bin Val tobin em quatro, em seguida, use o comando IM mod rotate vol para selecionar o ângulo adequado para girar o nano tubo lipídico ao longo do eixo Y e girar o tommo completo com o IM mod clip resize comando crop, o nanotubo lipídico selecionado ao longo do eixo Y usa o mod 3D para abrir o subtommo cortado. Por fim, clique no Tommo Graham para visualizar o arranjo das moléculas do fator VII ao longo das fatias no eixo Z e ao longo do eixo Y no volume subtomo.Como mostrado aqui, os oito F humanos e suínos recombinantes foram organizados com sucesso em lts de bicamada única carregados negativamente, assemelhando-se à superfície plaquetária ativada. Esta figura mostra que a ordem helicoidal dos oito F humanos e suínos ligados à membrana e a bicamada lipídica nas melhores médias de classe LNT e F oito LNT 2D são bem definidas e revelam as variações na organização helicoidal entre as duas proteínas. Esses painéis representam as reconstruções 3D iniciais para o F oito L e T humano e suíno que foram realizadas com 1000 partículas representativas dos conjuntos de dados F oito L e T humanos e suínos finais aqui, os gráficos de correlação da casca de Foer para F oito LNT humano e suíno indicam uma resolução de 20,5 angstroms em uma correlação de casca de Fourier igual a 0,5 nesta figura.Os volumes finais mostram oito F oito humanos e 10 F oito porcinos Cada molécula humana de F oito é traduzida em 41,2 angstroms e girada em 42,0 graus em relação à anterior, e cada molécula de F oito em suínos é traduzida em 35,9 angstroms e girada em 35,2 graus em relação à molécula anterior, correspondendo aos parâmetros helicoidais das reconstruções 3D finais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir dados de microscopia crioeletrônica da proteína marrom da membrana organizada em nanotubos lipídicos e calcular uma estrutura 3D próxima à condição fisiológica.Este vídeo é um primeiro passo em direção a uma estrutura ligada à membrana de alta resolução de uma proteína de coagulação, que pode ser aplicada a outras proteínas que funcionam em um ambiente lipídico.

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este estudo descreve um ensaio que mede a microplaca novel FV actividade de coagulação, durante a formação de coágulos de fibrina no plasma humano, que não havia sido descrita anteriormente. O método utiliza um leitor de microplacas cinético para medir continuamente a variação da absorvância a 405 nm durante a formação de coágulos de fibrina no plasma humano.

Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

Relatamos uma aplicação inteligente de nanotubos de carbono para estabilização cinética de partículas lipídicas que contêm nanoestruturas automontadas em seus núcleos. A preparação de partículas lipídicas requer concentrações bastante baixas de nanotubos de carbono, permitindo seu uso em aplicações biomédicas, como administração de medicamentos.

Preparação Facile da Internamente auto-montados Lipid partículas estabilizada por nanotubos de carbono

Este protocolo descreve a aplicação de tomografia combinada fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) e imagiologia de micro-computadorizada (microCT) para visualizar tromboêmbolos cerebral. Esta técnica permite a quantificação da carga de trombo e evolução. A técnica de imagem NIRF visualiza fluorescente etiquetado trombo no cérebro extirpado, enquanto que a técnica microCT visualiza trombo no interior de animais vivos usando ouro-nanopartículas.

Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Com suporte sólido, isento de proteína, dobro fosfolipídeo BICAMADA membranas (DLBM) podem ser transformadas em redes de nanotubo de lipídios complexos e dinâmicos e podem servir como modelos 2D de baixo para cima do retículo endoplasmático.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

Este protocolo descreve um processo para a fabricação de redes lipídicas de nanotubos usando motilidade de quinase deslizante em conjunto com vesículas lipídicas unilamellar gigantes.

Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.

Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais

Os ensaios de trombólise in vitro muitas vezes têm lutado para replicar as condições in vivo, seja no trombo modelo que está sendo digerido ou no ambiente em que a trombólise está ocorrendo. Aqui, exploramos como o acoplamento do loop de Chandler e do ensaio de fibrinólise de fluxo fluorométrico em tempo real (RT-FluFF) é usado para monitoramento de lise de coágulo de alta fidelidade, ex-vivo.

Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Aprenda a estrutura do fator VIII em nanotubos lipídicos usando microscopia criogênica eletrônica. Este método combina organização helicoidal com algoritmos de reconstrução 3D para elucidar a estrutura ligada à membrana.

Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos

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