Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores
15 de fevereiro de 2014
Este protocolo descreve um método padrão para simultânea ressonância magnética funcional e estimulação cerebral profunda no roedor. O uso combinado dessas ferramentas experimentais permite a exploração de actividade a jusante global em resposta à estimulação elétrica em praticamente qualquer alvo cérebro.
Oi, eu sou John Ya.E eu sou Dan Alba. Hoje vamos demonstrar a ressonância magnética funcional. Estimulação cerebral profunda simultânea em um rato.
Podemos usar essa técnica para mapear respostas funcionais em todo o cérebro para estimulação cerebral profunda em uma variedade de alvos. Este procedimento envolve implantação de eletrodo estereotáxico, aquisição de FMRI, uma análise das respostas funcionais. O primeiro passo é o implante do eletrodo.
Implantaremos um eletrodo unilateralmente no núcleo subtalâmico. Começaremos anestesiando o animal completamente e monitorando os parâmetros fisiológicos, incluindo oxigenação e temperatura corporal durante todo o procedimento. Comece a preparar o local da cirurgia removendo os pelos e prenda o animal a uma estrutura estereotáxica.
Use pomada para lubrificar os olhos do animal durante o procedimento. Aplique anti-séptico no local e aplique cortinas no campo esterilizado. Para completar a preparação do local cirúrgico.
Remova a pele e a fáscia que cobrem o crânio, garantindo que bgma e lambda estejam descobertos. Use um bisturi para tornar a superfície do crânio mais áspera para melhorar a fixação do cimento mais tarde no procedimento. E use algodão estéril no eletrocautério para hemostasia sobre a superfície óssea e corte de tecidos.
Use uma agulha presa ao braço estereotáxico para tocar a localização exata do bgma como referência para a localização da craniotomia e marque a localização no crânio com a agulha para o núcleo subtalâmico. Este será 3,6 milímetros de torema posterior e 2,5 milímetros laterais da linha média. Use uma broca pequena para fazer um pequeno furo no crânio, limpando e sondando as bordas do furo.
Use uma agulha de calibre pequeno para perturbar completamente a superfície dural e limpar qualquer sangramento adicional ou vazamento de líquido cefalorraquidiano. Agora vamos colocar um parafuso compatível com ressonância magnética no crânio para ancoragem. Faça um furo no crânio contralateral e posterior à futura localização do eletrodo.
Coloque o parafuso fundo o suficiente para ser seguro, mas sem pressionar a dura-máter ou o córtex, usamos um microeletrodo de tungstênio de dois canais caseiro compatível com ressonância magnética para estimulação. Inspecione o eletrodo para garantir que esteja reto e que os fios não estejam partidos. Coloque o eletrodo no braço estereotáxico na posição vertical e toque a ponta no bgma.
Mova o eletrodo para a posição da região alvo do cérebro usando a estrutura estereotáxica para medição e toque a superfície cortical. Abaixe o eletrodo usando a estrutura estereotáxica para medição. Certifique-se de que não haja flexão no eletrodo.
Durante este processo, coloque primeiro uma camada inicial de cimento, garantindo um serviço de crânio seco. Depois que a primeira camada estiver seca, dobre o eletrodo posteriormente e aplique cimento adicional para aumentar a estabilidade. Deixe o cimento secar completamente antes da remoção do animal.
O animal pode agora ser ressuscitado ou imediatamente preparado para ressonância magnética funcional. O segundo passo é preparar o animal para a aquisição do FMRI e do FMRI. Isso pode ser realizado imediatamente após a cirurgia ou vários dias depois.
Um capacete deve ser usado para imobilizar completamente a cabeça do animal em relação à bobina. O animal deve ser endotraqueal, intubado e ventilado. Uma variedade de anestésicos pode ser usada.
Usamos dme, toine e combin com isof de baixa dose. A paralisia do flúor deve ser realizada usando a geometria da tampa de aquisição de pantônio perto da junção do tubo de ventilação com o tubo endotraqueal. Ajuste as configurações do ventilador para estabilizar o TAL CO2 final.
Na faixa normal, geralmente perto de 3% as temperaturas devem ser monitoradas usando uma sonda retal fixada na base da cauda. Um banho-maria circulante deve ser ajustado para estabilizar a temperatura corporal dentro da faixa normal. A oximetria de pulso também pode ser adquirida na área da pata traseira, colocada sobre a área a ser escaneada para melhorar a qualidade da imagem.
Coloque uma bobina de superfície diretamente sobre as regiões do cérebro a serem digitalizadas. Prenda a bobina firmemente ao capacete e ao suporte. Conecte o sistema de estimulação ao conector do eletrodo e prenda os fios no lugar.
Cubra o animal para melhorar o isolamento no ambiente refrigerado do ímã. Agora é hora de inserir o animal no centro do ímã. Use uma imagem de batedor S simples de três simples para posicionamento preciso do animal dentro do scanner globalmente.
Calço com referência à superfície cortical para melhorar a homogeneidade do campo magnético. Em seguida, use o FMAP para calçar localmente as regiões do cérebro a serem usadas para varreduras funcionais. Adquira uma única fatia ponderada em T dois em um plano sagital médio.
Crie um gradiente de disparo único. Varredura Echo EPI com tamanho de matriz de 96 por 96, campo de visão de 2,56 por 2,56 centímetros. Tempo de repetição de 1000 milissegundos, tempo de eco de 14 milissegundos e largura de corte de um milímetro com quatro varreduras fictícias seguidas de 70 repetições.
Cada varredura com esses parâmetros deve durar um segundo. Por um tempo total de varredura de 70 segundos, alinhe esta varredura EPI à comissura anterior da imagem sagital T dois anterior para consistência geométrica entre os sujeitos, configure a estimulação, a frequência, a largura de pulso e o paradigma de estimulação e sincronize o gatilho de estimulação com as saídas de RF da sequência de varredura. Aqui usamos uma frequência de largura de pulso de 130 hertz de 90 microssegundos e um paradigma de estimulação de 60 segundos de descanso, seguido por 30 segundos de estimulação e, finalmente, 120 segundos de descanso.
Em seguida, configure o tipo de corrente de estimulação, incluindo a amplitude de corrente desejada e a saída de corrente bipolar. A varredura EPI garante que a estimulação seja acionada adequadamente após a aquisição, verifique para garantir uma resposta robusta usando as ferramentas de análise de dados descritas na seção a seguir. Se isso não ocorrer, verifique as conexões do estimulador.
Depois que todas as varreduras forem necessárias, varreduras anatômicas devem ser executadas para medir a posição aproximada do eletrodo e garantir a posição do eletrodo dentro do alvo pretendido. Depois, o rato pode ser ressuscitado e preservado para novos experimentos. Finalmente, depois que todos os experimentos necessários foram executados, o animal pode ser sacrificado no cérebro perfundido com formalina.
Com o trato do eletrodo removido, ocultar resolução T duas varreduras ponderadas podem ser realizadas para identificar o trato do eletrodo e sua relação com as estruturas próximas. Nesse caso, o trato do eletrodo termina logo ventral à cápsula interna no núcleo subtalâmico, confirmando a precisão do implante. Em seguida, processaremos e analisaremos os resultados de nossas verificações funcionais.
Para isso, usaremos um programa escrito personalizado que roda no matlab, embora outros pacotes de software para análise FMRI possam ser usados de maneira semelhante no matlab. Use códigos SPM para aplicar corpo rígido em todas as tentativas de estímulo. Em seguida, crie um segmento médio de imagens, conservando o curso de tempo das varreduras, execute manualmente a remoção do crânio após a aplicação de um limite de corte.
Agora vamos gerar mapas de coeficiente de correlação para as regiões cerebrais de interesse. A redução de ruído pode ser realizada usando um tamanho mínimo de cluster ou suavização passa-baixa de três por três. O paradigma de estimulação deve ser inserido e um pequeno atraso de paradigma pode ser definido para explicar o atraso hemodinâmico.
Para cada voxel, o coeficiente de correlação da mudança da intensidade do sinal ao longo do tempo pode ser calculado em relação ao paradigma de estimulação. Isso pode ser mapeado em cada fatia para identificar regiões neuroanatômicas onde a resposta da bola se correlaciona fortemente com o protocolo experimental. As regiões de interesse podem ser definidas manualmente ou usar um polígono como aproximação.
A mudança percentual do sinal dentro desta região de interesse pode então ser determinada usando o sinal de pré-estimulação como linha de base. Esses valores podem então ser exportados para análise estatística. Aqui, realizamos estimulação cerebral profunda no núcleo subtalâmico e as respostas em nosso mapa de coeficiente de correlação estão em regiões cerebrais distantes desse núcleo.
Aqui vemos regiões positivas, em negrito e corticais anteriores ao local da estimulação na fatia mais posterior. O artefato do eletrodo estimulante é visível quando a mudança na intensidade do sinal em negrito ao longo do tempo é calculada para uma amostra de região cortical de interesse. O resultado é exibido na tela com o paradigma de estimulação exibido aqui por uma barra amarela.
Isso pode ser usado para quantificar a resposta ousada e, para análise posterior, acabamos de demonstrar estimulação cerebral profunda com ressonância magnética funcional simultânea em modelo de roedor. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para ressonância magnética funcional simultânea e estimulação cerebral profunda em roedores. Esta técnica permite o mapeamento das respostas cerebrais à estimulação elétrica em diversos alvos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neuroimagem
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- A ressonância magnética funcional fornece informações sobre a atividade cerebral.
- A estimulação cerebral profunda é utilizada para modular a atividade neuronal.
- A combinação dessas técnicas permite uma análise abrangente.
- Este método é aplicável em modelos de roedores para pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Explorar a atividade cerebral global em resposta à estimulação.
- Avaliar os efeitos da estimulação cerebral profunda em diversos alvos.
- Ampliar o entendimento da função cerebral e da conectividade.
Métodos Utilizados
- Implante estereotáxico de eletrodo
- Aquisição de ressonância magnética funcional
- Análise das respostas funcionais
- Mapeamento da atividade cerebral
Resultados Principais
- Identificação de regiões cerebrais ativadas pela estimulação.
- Caracterização das alterações na conectividade funcional.
- Compreensão da dinâmica dos padrões de resposta cerebral.
- Aplicações potenciais no entendimento de distúrbios neurológicos.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta poderosa para a pesquisa em neurociência.
- Permite a investigação da função cerebral em tempo real.
- Estudos futuros podem se basear nesta abordagem para obter insights mais profundos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A estimulação cerebral profunda simultânea e a fMRI em roedores permitem o mapeamento preciso da modulação de circuitos neurais, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de terapias de neuromodulação. Essa abordagem fornece leituras quantitativas de todo o cérebro que aumentam a confiança preditiva em estudos pré-clínicos de DBS ao vincular parâmetros de estimulação às respostas funcionais da rede. Ela preenche uma lacuna crítica na tradução de dados de estimulação pré-clínicos para o desenho de ensaios clínicos, oferecendo insights imparciais, em nível sistêmico, sobre os efeitos neuronais downstream.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento das respostas neuronais downstream à estimulação em alvos específicos, como o núcleo subtalâmico.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de leituras funcionais de todo o cérebro que esclarecem o envolvimento de vias e efeitos fora do alvo.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao correlacionar parâmetros de estimulação com respostas BOLD mensuráveis em circuitos relevantes para a doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara circuitos neurais validados para avaliação de compostos ao estabelecer conexões funcionais de linha de base e perfis de resposta evocada por estimulação.
- Saída Quantitativa: Gera medições reprodutíveis de mudança percentual do sinal em nível de vóxel, que permitem a otimização de parâmetros de dose-resposta e de estimulação.
- Reutilização da Plataforma: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado para avaliar efeitos neuromoduladores em múltiplos alvos cerebrais, apoiando campanhas escaláveis de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela alvos humanos da EIP, como o NST para Parkinson, permitindo a avaliação pré-clínica da eficácia da estimulação e da modulação da rede neural.
- Continuidade Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao fornecer biomarcadores de imagem do engajamento do alvo e alterações na conectividade funcional.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir ou não ao quantificar a consistência e especificidade das respostas neurais entre diferentes paradigmas de estimulação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao fluxo de trabalho de descoberta ao permitir a investigação de circuitos orientada por hipóteses no início da validação de alvos, avançando para o aperfeiçoamento de ensaios para triagem e apoiando a validação pré-clínica por meio de leituras funcionais reprodutíveis.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao mapear a atividade cerebral induzida por estimulação em regiões conectadas.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio do posicionamento consistente de eletrodos, paradigmas de estimulação e análise quantitativa do sinal BOLD.
- Análise: Fornece mapas de coeficientes de correlação e métricas de variação percentual do sinal que permitem comparação entre condições e avaliação estatística da modulação da rede.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao identificar redes responsivas à estimulação alinhadas com circuitos terapêuticos conhecidos em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de neuroimagem reutilizável para avaliar diversos alvos de neuromodulação e parâmetros de estimulação em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na modulação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio do mapeamento funcional de todo o cérebro.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de anestesia, monitoramento fisiológico e design de eletrodos com minimização de artefatos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar ou não ao vincular parâmetros de estimulação a respostas quantificáveis na rede, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de neuromodulação com base na conectividade funcional validada e na especificidade de resposta.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica, física de ressonância magnética e eletrofisiologia para garantir o posicionamento preciso dos eletrodos e o controle de artefatos.
- Depende de equipamentos de estimulação compatíveis com ressonância magnética, sistemas de monitoramento fisiológico e pipelines personalizados de análise de imagens.
- Necessita padronização entre equipes dos paradigmas de estimulação, coquetéis anestésicos e manutenção de parâmetros fisiológicos em diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes alvos cerebrais, exigindo o recalibramento das coordenadas estereotáxicas e a validação do posicionamento dos eletrodos.
- Inclui limitações práticas, como artefatos residuais induzidos pelos eletrodos e influências anestésicas no acoplamento neurovascular, que devem ser consideradas na interpretação dos dados.
