Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de espinhos dendríticos em super resolução. Isso é feito primeiro preparando um hipocampo primário de rato chamado o segundo passo é visualizar as espinhas dendríticas por meio de transfecção e coloração de GFP. Em seguida, a aquisição de espinhas dendríticas marcadas com GFP é realizada em super resolução usando um microscópio SIM.

A etapa final é reconstruir os dados brutos da imagem em 3D prontos para análise de imagem subsequente. Em última análise, a GFP expressando neurônios primários do hipocampo fotografados em super-resolução é usada para mostrar mudanças sutis na morfologia da coluna dendrítica. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia confocal convencional, é que ela permite estudar a morfologia da coluna dendrítica com mais detalhes.

Este método pode ajudar a examinar as principais questões em andamento na neurociência, como alterações dependentes moleculares e farmacológicas na forma das espinhas dendríticas. A microscopia de eliminação estruturada é baseada na projeção de padrões de linha na amostra, e isso fornece informações extras que podem ser extraídas por um programa de computador e fornece imagens extra nítidas e que permitem que você observe as mitocôndrias do MI e outras pequenas estruturas na célula. Uma demonstração visual deste método é importante para obter uma reconstrução válida de uma imagem SIM é crucial para percorrer as etapas que fornecem uma boa qualidade dos dados brutos.

Uma etapa preparatória importante envolve o revestimento das lamínulas, trabalhando em uma coifa laminar estéril. Use uma pequena pinça estéril para colocar as lamínulas individuais em poços individuais de uma placa de 12 poços. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de polilisina a cada poço para submergir as lamínulas.

Depois de lavar os poços, adicione um mililitro de meio de plaqueamento e deixe as lamínulas na incubadora de cultura de tecidos por até 24 horas antes de plaquear as células. O procedimento será demonstrado por HU é SH, aluno de doutorado em nosso grupo. Depois de isolar o embrião de um rato, use uma pinça fina para remover e descartar o cerebelo do cérebro.

Separe os dois hemisférios fazendo um corte sagital ao longo da linha média sob um microscópio de dissecação, use um par de pequenas pinças para segurar suavemente o mesencéfalo e remover o mesencéfalo. Com outro par de pinças, deixe intacto o restante do hemisfério contendo o córtex e o hipocampo. Em seguida, remova cuidadosamente as meninges, reoriente o tecido para que o hipocampo fique voltado para cima.

O hipocampo pode ser identificado por sua estrutura característica em forma de CS. Usando uma pinça fina, disseque o hipocampo e coloque-o em um novo prato de 30 milímetros contendo um X-H-B-S-S. Depois de remover os campos de hipopótamos de todos os embriões, conte o número total de campos de hipopótamos e corte-os em pedaços pequenos.

Reúna as peças em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo três mililitros de um X-H-B-S-S. Depois de centrifugar e remover o sobrenadante, adicionar seis microlitros de tripsina por hipocampo. Depois de incubar e lavar os fragmentos do hipocampo conforme descrito no protocolo de texto, tatue lentamente os fragmentos 30 vezes com uma pipeta pastor polida até que todos os pedaços de tecido estejam homogeneamente dispersos em células únicas.

Tome cuidado para evitar qualquer bolhas. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de revestimento, pré-avisados a 37 graus Celsius. Depois de contar as células usando uma semente de coloração vital azul trian, 50.000 células por poço de uma placa de 12 poços em um mililitro de meio de revestimento para um volume total de dois mililitros.

Depois de balançar a placa para distribuir as células uniformemente, incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Após dois a três dias, substitua 0,5 mililitros do meio de plaqueamento por meio de cultura contendo 10 FUDR micromolares. Para transfecto, os neurônios adicionam uma lipectomia.

Misture gota a gota para uma mistura de DNA e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em uma capela de fluxo laminar, 10 minutos antes do final da mistura de lipectomia de DNA de 30 minutos, incubação, pipeta o meio condicionado da placa de cultura original ou primeira para uma segunda 12. Poço e armazene esta placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono na primeira placa de cultura.

Substituiu rapidamente o meio condicionado por um mililitro de meio de incubação pré-aquecido para evitar que as células secassem. Coloque as duas placas de volta na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. No final da incubação de lipectomia de DNA de 30 minutos, a mistura de lipectomia de DNA está pronta para ser adicionada às células.

Adicione suavemente 200 microlitros gota a gota da mistura de lipectomia de DNA a cada poço e incube por 45 minutos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Após a incubação de 45 minutos, use uma pequena pinça para levantar as lamínulas que seguram os neurônios. Enxágue-os mergulhando-os em um prato de três centímetros contendo meio neurobasal fresco e quente e coloque-os em um poço.

No segundo 12, placa de poço contendo o meio condicionado. Em seguida, incube os neurônios transfectados a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Para se preparar para a coloração imunológica, aspire suavemente o meio dos poços que contêm as lamínulas.

Em seguida, adicione 500 microlitros de 4% de PFA quente com cuidado para evitar danificar os dendritos. Depois de incubar e lavar o bloco de células com solução de 1% TBSB em temperatura ambiente por 30 minutos após lavar novamente, adicione o anticorpo primário diluído na incubação, misture e incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, incube durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave.

Na manhã seguinte, remova o anticorpo primário e lave novamente a partir daqui, mantenha as lamínulas protegidas da luz. Em seguida, adicione o anticorpo conjugado fluorescente secundário diluído na incubação. Misture e incube em temperatura ambiente por duas horas.

Em seguida, remova o anticorpo secundário e lave as células com uma pinça fina. Remova as lamínulas dos poços e seque o excesso de TBS com um lenço de papel. Por fim, monte as lamínulas usando o meio de montagem e sele com esmalte.

Para iniciar a imagem do SIM, ligue o laser de 488 nanômetros, a lâmpada de mercúrio, o controlador de palco, o controlador pizo e a lâmpada halógena para luz transmitida. Inicie o software SIM no modo e ou para nsim. Depois de colocar uma gota de óleo de imersão na objetiva, verifique se não há bolhas de ar na gota de óleo.

Coloque a lamínula com os neurônios do hipocampo no microscópio stage. Mova a objetiva para cima até que o óleo toque a amostra. Lembre-se de colocar uma tampa sobre o palco durante o procedimento de aquisição para proteger a amostra da luz ambiente e diminuir a luz na sala o máximo possível.

No software SIM, selecione a configuração óptica IFI e selecione um bloco de filtro vazio entre um para inspeção visual com configuração de luz branca sample foco. Em seguida, desligue a luz branca e ligue a lâmpada de mercúrio. Abra o obturador e selecione o filtro verde para procurar um dendrito suficientemente brilhante.

Ao encontrar um dendrito de interesse suficientemente brilhante e centralizar um segmento de interesse no campo de visão, feche o obturador. Defina o software para a configuração óptica 3D SIM 4 88 e as configurações da câmera da seguinte forma. Defina o modo de leitura para em.

Ganhe um megahertz de 16 bits. Defina o tempo de exposição para 100 milissegundos. Defina a potência do laser para 5%Defina o ganho EM para 200.

Com a velocidade de focagem definida para extra fina, foque no objeto de interesse. Ajuste rapidamente as configurações da câmera da seguinte maneira. Para obter um valor de intensidade entre 30, 040 5, 000, defina a potência do laser para 0% a 20% Defina o tempo de exposição para 50 milissegundos a dois segundos.

Defina o modo de leitura para em. Ganhe um megahertz de 16 bits. Defina o ganho EM de zero a 300.

Defina o ganho de conversão para um x para 5,1 x. Defina o formato para live para sem Benning. Defina o formato de captura como sem Benning.

Em seguida, defina as configurações da pilha de três DZ no painel de sequência ND da seguinte forma, defina o intervalo para dois mícrons. Defina o tamanho do passo para 120 nanômetros e clique na posição inicial. Em seguida, selecione a configuração óptica, 3D SIM 4 88 na seção lambda.

Depois de selecionar o 3D SIM como o modo de aquisição, execute a aquisição da sequência ND e salve os dados brutos que os dendritos e as espinhas dendríticas visualizadas com microscopia confocal e sim são mostrados aqui. As aquisições foram reconstruídas a partir de imagens confocais e SIM. Os dendritos foram rastreados e os espinhos foram classificados automaticamente com o software após o ajuste dos parâmetros principais, como comprimento do pescoço, diâmetro do pescoço e diâmetro da cabeça.

As áreas encaixotadas mostram uma coluna dendrítica individual fotografada com microscopia confocal e sim e reconstruída a partir de suas pilhas Z correspondentes, representando diferenças na resolução e precisão das reconstruções 3D resultantes. De acordo com o SIM, a análise quantitativa de alta resolução do diâmetro da cabeça e do pescoço revelou que a microscopia sim mede dimensões significativamente menores do que a microscopia confocal para as mesmas espinhas dendríticas, indicando que a SIM é capaz de detectar mudanças menores na morfologia da coluna dendrítica. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de adquirir imagens brutas de alta qualidade para uma reconstrução posterior mais válida da mesma imagem.

A microscopia de iluminação estruturada também pode ser eficaz para imagens de células vivas, permitindo a investigação da dinâmica de células como células hela, neurônios ou bactérias e coli. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como preparar, visualizar e explicar o padrão de imagem dos neurônios primários do hipocampo em uma super resolução.