Name: Criação de um In Vitro Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Aprenda a criar um modelo in vitro reprodutível da barreira hemato-encefálica de rato usando co-cultura de células endoteliais e astrócitos. Este método permite estudar propriedades de barreira e mecanismos de transporte.

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O apoio financeiro para VECT-HORUS é reconhecido a partir do Fonds Único Interministerial (projeto FUI / MEDUL) e VECT-HORUS eo laboratório UMR7259 da Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC e PREVENTAD projetos colaborativos) . O laboratório UMR7259 reconhece também o apoio financeiro do CNRS e de Aix-Marseille Université.

1. Produção de Rato Os astrócitos Para cada preparação de utilizar 10 ratos Wistar neonatais de ambos os sexos. <ol><li> Sacrificar os ratos, cortando cabeças com um par de tesouras e transferi-los imediatamente em uma placa de Petri seca sob uma capela de fluxo laminar. Remover o cérebro do crânio, sem o cerebelo e transferi-los imediatamente numa placa de Petri contendo tampão de dissecção gelado: HBSS suplementado com 1% de albumina de soro bovino (de baixo nível de endotoxinas BSA), penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml. </li><li> Cortar os cérebros em metade, para separar os dois hemisférios cerebrais e transferi-los para uma placa de Petri limpa com tampão de dissecção em gelo. Corte o nervo óptico e remover as meninges sob microscópio estereoscópico. </li><li> Lavar as peças corticais extensivamente em 50 ml de tampão de dissecção gelado. </li><li> Coloque os pedaços de corticais a partir de 3 cérebros em um tubo Falcon de 15 ml e dissociar pipetando cima e para baixo um golpe de Estadole de vezes com uma pipeta descartável de 10 ml equipado com uma ponta de azul em 6 ml de tripsina a 0,05% - EDTA a 0,02% durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 24 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e os seguintes antibióticos, penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml, uma mídia chamado meio de células da glia (MGC) e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Lotes FBS foram selecionados e validados para o crescimento e sobrevivência de cutures astrócitos. </li><li> Ressuspender o sedimento contendo as células dissociadas em 10 ml MGC e placa em uns 75 cm 2 t-se o frasco (T75). Troca da mídia no dia seguinte para remover os restos celulares e DNA. Substituir o meio de cultura duas vezes por semana. </li><li> Após 1 semana de proliferação, agitar suavemente as células da glia com um agitador orbital a 60 rpm durante 24 horas a 37 ° C no MGC. Se o T75 não pode ser colocado em uma incubadora com 5% de CO 2/95% de ar a 37 ° C, atmosfera húmida, suplementar os meios com HEPES a 5 mM. Lave as células duas vezes com retirar as células microgliais não aderentes. </li><li> Três semanas após a sementeira, lavar as células duas vezes com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicionar 3 ml de tripsina quente 0,05%-EDTA a 0,02%, incubar a 37 ° C e esperar até que a camada de células é disperso (geralmente 5 min). Inibir a actividade da tripsina por adição de 10 ml de MGC, transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml e centrifugar a 120 xg durante 8 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento astrócitos em 90% FBS - 10% DMSO, transferi-los para criotubos (2 x 10 6 células por cryovial) e loja em nitrogênio líquido. </li></ol> 2. Isolamento de rato Microvasos Cérebro Nossos procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê da Faculdade de Medicina de Marselha de Ética e em conformidade com os regulamentos nacionais e europeus (directiva da UE N. º 86/609). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais utilizados. <ol><li> Para cada preparação e para uma experimental utilizador, usar 3 cinco semanas de idade os ratos Wistar. </li><li> Segunda-feira da primeira semana, dois frascos T75 preparar o revestimento com colagénio de tipo IV e a fibronectina, tanto a 1 ug / cm 2 em cultura água estéril (10 ml por T75). Permitir a aderir a 37 ° C até microvasos semeadura. </li><li> Quarta-feira da primeira semana, a eutanásia os ratos sob um fluxo crescente de CO 2 para induzir sonolência, perda de postura e respiração interrupção, seguida por uma luxação cervical. Pulverizar as cabeças com etanol 70%. Corte as cabeças com um par de tesouras e transferi-los para uma placa de Petri, seco, sob uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Remover o cérebro do crânio, sem o cerebelo e os nervos ópticos, em seguida, transferi-los para uma placa de Petri arrefecida em gelo e encheu-se com tampão de dissecção gelado (HBSS suplementado com BSA a 1%, penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml) . </li><li> Corte o cérebro ao meio para separar os dois hemisférios cerebrais e mesencéfalo separada da deebrain. Transfira os forebrains em uma placa de Petri limpa no gelo com tampão de dissecação. </li><li> Pegue um par de hemisférios de uma nova placa de Petri com tampão dissecção fria para remover cuidadosamente as meninges dos forebrains sob um microscópio estereoscópico com N ° 5 fórceps curvos. Em seguida, limpar o interior do cérebro para remover o acolchoado de mielina e obter uma concha de córtex. Estes passos não deve demorar mais do que 2 horas para a preservação do tecido e célula de sobrevivência. </li><li> Dissociar o córtex do cérebro em 3 6 ml de tampão de dissecção gelado em 7 ml de um homogeneizador Dounce de 10 movimentos abaixo e acima com cada um dos dois pilões de folgas diferentes, 71 mM, seguido por 20 um. </li><li> Dividir a suspensão para obter o equivalente de um córtex em 1 ml de um tubo Falcon de 50 ml e centrifugar a 1000 g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Digerir a suspensão a partir de um córtex com 1 ml de uma solução enzimática contendo uma mistura de colagenase / dispase (60 ug / ml I11; 0,3 U / ml), ADNase tipo I (35 ug / ml - 20 K unidades / ml) e gentamicina (50 ug / ml) num agitador durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Misture a 1 ml de uma digest córtex com 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X e separado por centrifugação de densidade dependente de 3.600 xg durante 15 min à temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente o disco superior (mielina e parênquima cerebral) e o sobrenadante para um tubo Falcon de 50 ml limpos e repetir a centrifugação. Manter o sedimento resultante contendo os microvasos cerebrais, a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente descarte do disco superior e o sobrenadante. Ressuspender ambos os sedimentos resultantes contendo os microvasos cerebrais com 1 ml de HBSS frio 1X e transferir para um tubo Falcon de 50 ml limpo. </li><li> Lave os microvasos por adição de 20 ml de HBSS frio 1X e centrifugar a 1000 g durante 5 min. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Além disso digerir os microvasos a partir de um córtex com 1 ml da mesma solução enzimática, tal como descrito na etapa 2.9, durante uma hora a 37 ° C em um shAker. </li><li> Em seguida, misturar os microvasos digeridos de cada um dos três córtices em um tubo e ainda separar-se em dois tubos Falcon de 50 ml para se obter os microvasos extraídos a partir do equivalente de uma vez e meia (1,5) córtex por tubo. Adicionar 30 ml de tampão de dissecção gelado e centrifugação a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento de microvasos em 10 ml de DMEM/F12 suplementado com 20% de plasma pobre em plaquetas bovino soro derivado, o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 2 ng / ml), heparina (100 ug / ml), gentamicina (50 ug / ml) e HEPES (2,5 mM), chamado meio de células endoteliais (ECM) suplementado com puromicina a 4 ug / ml. </li><li> Pegue os dois frascos T75 revestidos da incubadora, aspirar o excesso de revestimento e placa microvasos de cada tubo em um frasco T75 (microvasos extraídos de 1,5 córtex por frasco T75). </li></ol> 3. Purificação e Proliferação de RBEC Primocultures <ol><li> Purificação: quarta-feira a sexta-feira, adicionar puromycin a 4 ug / ml para o meio de cultura. Troca da mídia na quinta-feira. Na sexta-feira, lavar as células e adicionar puromycin a 2 mg / ml, até segunda-feira. </li><li> Proliferação: na segunda-feira da segunda semana, lavar as células e adicionar insulina, transferrina e suplemento de selenito de sódio ao meio de cultura até as culturas chegar a 90% de confluência na quarta-feira da segunda semana. </li></ol> . 4 Diferenciação: Configurar o modelo in vitro BBB <ol><li> Segunda-feira da segunda semana, prepare filtros (polietileno, 12 poços, dos poros de tamanho 1,0 mm) através do revestimento com uma mistura de colágeno tipo IV e fibronectina tanto no 0.5μg/cm 2 em água cultura estéril (500 mL de mistura no compartimento superior e 1,5 ml de água estéril de cultura no compartimento inferior). Permitir a aderir a 37 ° C até RBEC semeadura. </li><li> Segunda-feira da segunda semana, cinco dias antes do estabelecimento da co-cultura, descongelar os astrócitos de criotubos a 37 ° C e transferêncianum Falcon de 15 ml com 10 ml MGC. Centrifugar a suspensão a 120 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento em astrócitos MGC e placa a uma densidade de 30 x 10 3 culas por cm 2 em placas de 12 poços. </li><li> Quarta-feira da segunda semana, imediatamente antes de dissociação com tripsina RBEC, lavar duas vezes o filtro pré-revestido com meio DMEM/F12. Pré-encher as câmaras com ECM: 1,5 ml no compartimento inferior e 0,5 ml no compartimento superior. </li><li> Quarta-feira da segunda semana, lavar duas vezes o RBEC com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicionar 4 ml de tripsina quente 0,05% - EDTA a 0,02% a 37 ° C por frasco T75 durante exactamente 30 segundos. Em seguida, remover 3,5 ml de solução de tripsina e observar ao microscópio. Quando a camada de células começa a separar a partir da matriz, ajuda-los batendo suavemente a ponta do frasco T75 até que todas as células estão a flutuar. </li><li> Adicionar 9 ml de ECM por frasco T75 e transferir para um tubo Falcon de 15 ml. Muito dissociar suavemente o celularsuspensão por pipetagem para cima e para baixo, 4 vezes com uma pipeta de 10 mL, equipado com uma ponta amarela (evitar a produção de bolhas na solução). Contar as células em suspensão (a aproximadamente 3 x 10 6 cells/T75) e a placa imediatamente em filtros de pré-revestido e pré-cheios a uma elevada densidade (160 x 10 3 células / filtro, portanto, aproximadamente 18 filters/T75) (Figura 8 ). O dia seguinte (quinta-feira), mudar o meio de duas vezes o compartimento superior para remover os detritos celulares. </li><li> Quinta-feira da segunda semana, um dia antes do estabelecimento do processo de co-cultura, substituir o meio de cultura dos astrócitos por 1,5 ml de meio de diferenciação (ECM com hidrocortisona em 500 nM), que pode ser suplementado com 1/3 de meio condicionado a partir do compartimento basal de um co-cultura anterior (3 dias de contacto entre as células endoteliais e astrócitos). </li><li> Sexta-feira da segunda semana é definido como o dia 0 de diferenciação; substituir o meio de cultura a partir da Conta filtrosining o RBEC com a mídia diferenciação. Transferir os filtros RBEC nas cavidades que contêm os astrócitos. Sob estas condições, em modelos in vitro e diferenciar expressam proteínas relacionadas com a junção dentro de 3 dias. </li><li> Os modelos de manter sua diferenciação ideal durante mais de 3 dias, entre segunda e quarta-feira da terceira semana. </li></ol>

Michel Khrestchatisky é diretor do laboratório UMR7259, cofundador e conselheiro científico da empresa de biotecnologia VECT-HORUS.

Nós descrevemos a implementação de um protocolo reprodutível semanal para o isolamento e revestimento de microvasos cerebrais, após purificação e cultura de RBEC e mais criação de co-culturas com astrócitos primários de rato para gerar um modelo in vitro BBB com propriedades características de BBB. Estabelecer com sucesso padronizados em culturas in vitro de BBB exige condições ideais nas várias etapas seqüenciais do processo. O modelo foi (a) optimizada para obter a permeabilidade paracelular menor, o que continua a ser o &quot;Santo Graal&quot; de modelos in vitro de BBB, e (b) validado por efluxo e mecanismos RMT. Produção, purificação e Proliferação de RBEC O maior desafio quando o cultivo RBEC é conseguir a reprodutibilidade entre diferentes culturas. Padronização do protocolo exige ferramentas de alta qualidade para disseção, reagentes de alta qualidade e respeito das datas de validade de reagentes. O experimentador deve ser hábil em micro-dissecção sob microscópio estereoscópico para a remoção rápida de meninges e grandes vasos da superfície do córtex. Uma vez que os cérebros são isolados e mecanicamente dissociados, um dos principais desafios é a digestão enzimática óptima dos microvasos do cérebro isoladas de fresco. O tipo e qualidade das enzimas utilizadas é crítica. Foi utilizada uma mistura de tipo colagenases I e II e dispase em alta concentração, com baixa variabilidade entre lotes. Também importante é a duração da digestão enzimática e da razão entre o peso de concentração de enzima / tecido / volume de digestão. O melhor rendimento de produção microvascular cerebral foi obtido com o equivalente de córtex cerebral de 1 em 1 ml de colagenase / dispase misturar a 60 ug / ml durante as duas digestões, respectivamente, 30 minutos e 1 hora. Também importante é a eliminação de contaminação de célulass (astrócitos e principalmente pericitos). Essas células proliferam a taxa mais elevada do que as células endoteliais e não estabelecem junções apertadas com o último, impedindo, assim, o estabelecimento de uma monocamada de células homogêneas com boa restritividade paracelular. Considerando-se que as células endoteliais do cérebro expressaram níveis muito mais elevados de bombas de efluxo, especialmente P-gp, em comparação com os outros tipos de células encontradas no microvasos, que tolera melhor as concentrações de outro modo tóxicos de drogas do ligando de P-gp, enquanto que as células endoteliais não são eliminados. Tratamento puromicina a 4 ug / ml para os dois primeiros dias foi seguido de mais dois dias de 2 ug / ml para se obter uma boa pureza de células endoteliais. Esta seleção também pode favorecer células endoteliais capilares contra os de vênulas, arteríolas pré-capilares ou microvasos maiores, e levar a monocamadas mais apertados. Além disso, a utilização de soro bovino derivada de plasma pobre é um imperativo para obter culturas puras de células endoteliais 47,48. A-der plasmasoro IVED carece de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o qual é mitogénica para fibroblastos, para as células musculares lisas e, por conseguinte, pericitos. Observou-se que o tratamento de plástico e filtros com uma mistura de colagénio do tipo IV a partir de ratos e de fibronectina humana resulta uma vantagem significativa, com um aumento de 2 vezes do rendimento de proliferação em comparação com o colagénio do tipo I, a partir tradicionalmente recomendada da cauda de rato. Sinais importantes para a proliferação celular são fornecidos pela matriz extracelular, tais como a integrina e o factor de crescimento (bFGF) de activação 49. Concentração do tampão e pH dos meios de cultura têm sido descritos para impactar positivamente em paracelular aperto 50 e observou-se uma melhor reprodutibilidade entre as culturas, com a adição de tampão HEPES a 5 mM. Diferenciação de RBEC: Co-cultura Estabelecimento em Inserir Filtros Uma vez que as células endoteliais do cérebro têm been purificado e proliferaram durante 6 dias, podem ser semeadas em filtros. Plaqueamento de células a uma densidade elevada é importante para se obter uma monocamada perfeito. A densidade de sementeira de 160x10 3 células por 12 filtros de placas assim era necessária e suficiente para se obter uma monocamada confluente de 24 horas após a sementeira. No entanto, o isolamento de células endoteliais de capilares cerebrais primários a partir de seu ambiente é um paradoxo na construção de um modelo de certificação in vitro, pois sabe-se que as células primárias e as células endoteliais capilares do cérebro, nomeadamente, são fortemente regulados pelo ambiente e fatores indutores produzidos pela os diferentes tipos de células vizinhas. Células endoteliais capilares do cérebro cultivadas sozinho rapidamente de-diferenciar e perder alguns marcadores endoteliais cerebrais específicas. Assim, as células endoteliais primárias devem ser usadas em baixa passagem (P1) e re-ligado, pelo menos em parte, com o ambiente através de co-cultura com os astrócitos ou meio condicionado por astrócitos 47,51. Isto éverdadeiro para a diferenciação de astrócitos como as células endoteliais e astrócitos do cérebro estão envolvidas na indução de duas vias. Cultivar RBEC com astrócitos levou a uma forte indução do TJ interendoteliais 52,23. Os mecanismos moleculares de re-indução são ainda desconhecidas, ea pesquisa está em curso em vários laboratórios para identificar os fatores de modulação específicas secretadas pelos astrócitos, o que poderia promover a diferenciação de células endoteliais ideal 53,54. Factores segregados pelas células endoteliais do cérebro, como o factor de inibição de leucemia (LIF) foram mostrados para induzir a diferenciação de astrócitos 55,56. Antes de estabelecimento de co-cultura, os astrócitos foram expostas a meio de diferenciação contendo o glicocorticóide hidrocortisona agonista do receptor, e a co-cultura em meio condicionado. A hidrocortisona é conhecido para melhorar a estanqueidade de células endoteliais cerebrais e é utilizado em modelos de BBB especialmente de rato 57 e do rato 58,59 células endoteliais. A medi condicionadohum é coletado do compartimento inferior da célula / astrócitos sistema de co-cultura endotelial após 3 dias e congelado para uso posterior. O uso de meio de co-cultura condicionado reduziu o tempo de diferenciação de células endoteliais de 3 dias, com a permeabilidade paracelular óptima durante mais 2 dias e também melhorou a reprodutibilidade entre as culturas. Em geral, o protocolo que descreva produz um TEER reprodutível mais de 300 ohm · cm 2 e um coeficiente de permeabilidade paracelular média Pe (LY) de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, semelhante ao dos melhores modelos baseados em células primárias de BBB 22, 12. O protocolo que descrevemos na presente manuscrito com a modulação proposta de digestão enzimática de microvasos pode ser estendido para as células endoteliais a partir da medula espinal de rato e a partir de 60 ratos cérebro. Caracterização Molecular e Funcional Aléma indução TJ, astrócitos também contribuir para a expressão de transportadores de efluxo tais como a P-gp em células endoteliais do cérebro 61. Nós, de facto mostrar a expressão do transportador de efluxo de P-gp na modelo certificação e que demonstram a polaridade da bomba de efluxo de P-gp localização utilizando abordagens bioquímicas e de actividade de P-gp, utilizando um ensaio funcional. GLT-1 expressão foi detectada na fracção de membrana basal de microvasos, mas não foi detectada em RBEC cultivadas. Nossa hipótese é que GLT-1 foi regulada para baixo em nossa cultura RBEC em comparação com as condições in vivo e, conseqüentemente, não detectável por western blot. O excesso de glutamato é neurotóxica e in vivo, da GLT-1 é responsável por glutamato efluxo do compartimento basal (parênquima) para o compartimento apical (a circulação sanguínea). Em culturas de astrócitos, GLT-1 expressão permanece muito baixo e é induzido pela adição de glutamato no meio de 62,63. Também confIRM a expressão de transportadores de influxo na membrana apical tal como LRP1, LDLR e TfR. Funcionalidade de TfR e LDLR foi demonstrado com a ligação e transporte experimentos de Tf-Cy3 e DiLDL do luminal para o lado abluminal da monocamada como previamente mostrado com um bovino em modelo BBB vitro 64. Curiosamente, tem sido demonstrado que a exigência de lípidos de astrócitos aumenta a expressão de LDLR em células endoteliais dos capilares do cérebro 65,66 confirmar ainda mais a diafonia entre fisiológico astrócitos e as células endoteliais do cérebro, incluindo in vitro. Escolhemos para exemplificar o transporte com as tinturas fluorescentes tais como Cy3 e DII considerando que a análise de fluorescência está disponível na maioria dos laboratórios, e pode ser útil para validar em modelos in vitro de BBB. Contudo, a quantificação da fluorescência é muito menos sensível do que a radioactividade e requer um aumento do número de experiências para obter dados importantes.Idealmente, Tf e LDL são geralmente radioativo (iodo 125) para tais experimentos obrigatório / absorção e transporte. Também mostramos que a monocamada de células endoteliais diferenciadas obtidas com o protocolo proposto responde à inflamação induzida por TNF-α, como revelado pela libertação CCL2 abertura e certificação. CCL2 (MCP-1) e o seu receptor CCR2 estão envolvidos em patologias do SNC tais como esclerose múltipla, encefalomielite auto-imune experimental (EAE), 67, 68 trauma do SNC e são conhecidos como mediadores da migração de leucócitos para o sistema nervoso central sob condições neuroinflamatórias 69,70. Com o protocolo testado, não se pode concluir em uma secreção polarizada de CCL2 porque abertura certificação permite que a concentração CCL2 equilibrar entre os dois (basal) compartimentos superiores (apical) e inferiores. Consequentemente, nós subestimar claramente a quantidade de CCL2 produzido pela RBEC no compartimento apical de 24 hr (Figura 5A). Visão Geral e Limitações do BBB modelos in vitro: Eu n Vivo contra In Vitro e Rodent contra Comparações Humanos Muitas drogas promissoras do SNC que se mostrou eficaz no BBB passagem in vitro falhou em ensaios clínicos, devido à falta de previsibilidade de em modelos in vitro de BBB muitas vezes baseadas em células isoladas de outras espécies que não humano. Ao melhor de nosso conhecimento, os modelos in vitro de BBB são provavelmente mais preditivo quando se trata de estudar os aspectos mecanicistas de redes de proteínas, transdução de sinal, transportadores e receptores. Cada mecanismo, caminho ou alvo a ser estudada in vitro deve ser caracterizada pela sua regulação por estímulos ambientais complementares (outros tipos de células, produtos químicos, proteínas) e combinados para estudos in situ com as mesmas espécies animaisE, quando possível, com microvasos e células endoteliais isoladas de seres humanos, com as restrições e cautela evocado abaixo. In vitro modelos de BBB tem que ser vistos como sistemas autônomos, isolados de regulação do corpo, mas ainda dotado de grandes in vivo propriedades e um potencial para a regulação por estímulos ambientais. N &quot;ideal&quot; modelo in vitro de certificação tem sido proposto ainda 71,72,73 porque as monocamadas de células endoteliais não têm um número de componentes importantes da unidade vascular neuro-glia (NGVU) e são isolados a partir de sangue e de regulação do corpo. A falta de pericitos 74,16 ou 17,18 neurónios ou os diferentes constituintes da matriz extracelular utilizados para o revestimento de plástico ou o meio de cultura e soro utilizado para o crescimento das células em mais comum e mais fácil &quot;efectuadas&quot; in vitro modelos de BBB baseado em endotelial células diferenciadas com astrócitos pode modular a expressão da proteína in comparação com a situação in vivo 75. Estes modelos podem expressar muitos transportadores exibidas in vivo, mas não todos. Em alguns casos, os parâmetros de transporte foram verificadas pela primeira vez em microvasos isolados (mais próximas da situação in vivo em), e, em seguida, estudado em sistemas de cultura de células 76,61. Investigação em biologia molecular permitiu a caracterização da expressão do gene e proteína em microvasos isolados e passagem endoteliais culturas baixas de células da mesma espécie e entre espécies diferentes, na maioria das vezes a partir de pequenos animais, como roedores (ratos e ratos) ou de vaca e porco em comparação com os seres humanos 77,78,75,15. Comparação entre transcriptomic in vivo e em células endoteliais microvasculares cerebrais in vitro mostraram numerosos transcritos de genes que foram diferencialmente expressos e mais frequentemente significativamente regulada negativamente in vitro. Transcrições que codificam transportadores de influxo como TfR e proteins implicados no tráfico de vesículas são principalmente downregulated em células endoteliais cultivadas cérebro, sugerindo uma diminuição geral na endocitose e transporte vesicular em tais células. Manipulação Cultura em termos de pureza (tratamento puromycin) e tratamento com hidrocortisona pode ajudar a restaurar a &quot;in vivo-como&quot; perfil mais a expressão do gene 77. Estudos transcriptomic também revelou diferenças importantes entre as espécies que complicam ainda mais previsões sobre a absorção da droga em humanos com base em roedores em modelos in vitro de BBB 75. Modelos in vitro de BBB que envolvem co-cultura de células endoteliais humanas e astrócitos foram descritas 15. Embora relevante, estes modelos são mais difíceis de implementar em uma base regular como eles exigem acesso regulado ao tecido humano post-mortem e há heterogeneidade na qualidade / propriedades das células endoteliais do cérebro humano, dependendo da idade, doenças, e possivelmente médica tratamentt de doadores. Os esforços têm de ser feitos para desenvolver novos sistemas in vitro que reproduzem melhor a fisiológicas, anatómicas e as características funcionais do in vivo a certificação. Co-culturas envolvendo três tipos de células são altamente restritiva e parecem difíceis de implementar de forma rotineira. Até à data, os modelos in vitro de BBB mais complexos são os modelos in vitro (DIV dinâmicas-BBB), que incluem organização navio semelhante com astrócitos e incluem um fluxo de meio que simula o fluxo sanguíneo 75,79,80,81,82, 83,84,85. Quando as células endoteliais cerebrais são expostos a um fluxo, a tensão de cisalhamento gerada mechanotransducers activa na superfície da célula, que modulam a expressão dos diferentes genes envolvidos na fisiologia da célula endotelial tais como a divisão celular, diferenciação, migração e apoptose 80. In vivo, a tensão de cisalhamento gerado pelo fluxo de sangue é responsável pela paragem da mitose com o contato de células, o que permite o estabelecimento de ummonocamada de células endoteliais nos vasos sanguíneos 80. Análise genômica e proteômica de células normais microvascular cérebro humano endoteliais mostraram o impacto da tensão de cisalhamento em BBB fisiologia endotelial 84. A tensão de cisalhamento é responsável para a sobrevivência da célula, um maior grau de adesão de células endoteliais, indução da bomba de efluxo e melhor polarização dos transportadores 75, a regulação do metabolismo da glicose 75,86, oxidação mediada por enzimas CYP450 75 e a regulação da permeabilidade paracelular através do aumento da expressão de genes que codificam para os elementos de junção intercelular, como ocludina e ZO-1 e, consequentemente, 87,75,80 alta TEER cerca de 1500 - 2000 ohm · cm 2, a mais próxima conhecida in vivo parâmetros 79,80 Na indústria de biotecnologia e farmacêutica, a triagem de rotina de drogas ou até mesmo alto throughput screening (HTS) e os esforços para reduzir a experimentação animal, levoupara o desenvolvimento de linhas de células diferentes a serem utilizadas em substituição da cultura primária de células endoteliais cerebrais, que permanecem mais difícil de definir-se de forma rotineira. Na maioria dos casos, as culturas primárias de células endoteliais cerebrais foram transduzidas com um gene de imortalização (SV40 ou vírus do polioma grande antigénio T ou E1A do adenovírus), ou por transfecção de DNA de plasmídeo ou por uma infecção utilizando vectores retrovirais 88,89,75. Várias linhas de células endoteliais de origem cerebral foram desenvolvidos, tais como o RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs rBCEC4 ou linhas de células de rato 88,75, a linha de células de rato b.End3 90,75, o PBMEC/C1 - 2 porcino linha celular de 87,75, e a linha celular humana hCMEC/D3 89,75. Outros modelos baseiam-se em células de origem não-cerebral, tais como o rim canino Madin-Darby (MDCK) ou linhas de células Caco2 12,75. Entre as diferentes linhas de células endoteliais cerebrais humanos, o hCMEC/D3 tem sido amplamente citard e melhorada como um modelo de certificação desde a sua criação, em 2005, 91,92. Como culturas primárias, as linhas de células possuem vantagens e limitações. Eles são mais fáceis de lidar do que culturas primárias, têm um tempo de vida prolongado, estão bem caracterizados e de permitir a reprodutibilidade entre experimentos de grande escala. No entanto, as linhas celulares podem perder as funções específicas do tecido, perder regulação ambiental e adquirir um fenótipo molecular bastante diferente de células in vivo 75, 89. Em particular, monocamadas gerados a partir de linhas de células presente aperto reduzido, baixa Teer e variação Perfil do show de transportador 75,89. Assim, experimentos com animais e estudos em células primárias são muitas vezes preferido, apesar de sua complexidade.

Muitos medicamentos desenvolvidos para tratar do Sistema Nervoso Central (SNC) são incapazes de atingir o parênquima cerebral em concentrações terapeuticamente relevantes. A certificação protege o tecido nervoso do cérebro a partir da flutuação da composição do plasma, a partir de agentes patogénicos, e mantém a homeostase do parênquima do cérebro, restringindo o fluxo de não-específico de iões, péptidos, proteínas e até mesmo células para dentro e para fora do cérebro 1. Características de BBB são induzidos e mantidos pela proximidade íntima e cross-talk entre as células endoteliais microvasos cérebro classe especializada e elementos vizinhos da unidade de neuro-glia-vascular (NGVU), tais como os neurônios, células da glia (astrócitos, mais precisamente o final de pés), e pericitos ensheathed na membrana basal, que consiste principalmente de colágeno tipo IV, fibronectina, laminina e proteoglicanos 2,3. Pericitos cobrem aproximadamente 22 - 32% do endotélio ao nível capilar e desempenham um importantepapel na regulação da proliferação endotelial, angiogênese e processos inflamatórios. As células endoteliais formam uma folha contínua que cobre a superfície interna dos vasos capilares. Eles são ligados entre si por TJs, que formam uma estrutura de correia como a região apical, e que contribuem para a célula de polarização. Os astrócitos regulam as propriedades de BBB e são fontes de factores regulatórios importantes, tais como TGF-β, GDNF, bFGF, e IL-6. Os astrócitos deficientes em GFAP com funcionalidade incompleta não são capazes de regular de BBB propriedades 4. Os neurónios não são directamente envolvidas estruturalmente na formação da certificação, mas também regulam aspectos importantes da expressão da proteína e BBB funções 5. Para estudar ainda mais a estrutura, fisiologia e patologia do BBB, modelos in vitro da certificação foram desenvolvidos como ferramentas de pesquisa. As células endoteliais do cérebro foram extraídos a partir de várias espécies para implementar em modelos in vitro de BBB baseadocom baixos passagem principais culturas provenientes de bovinos, suínos 6,7 8,9, 10,11,12 rato, rato 13 e também humano 14,15. Estes modelos são conhecidos para imitar in vivo certificação, especialmente quando co-cultivadas com células gliais de rato ou murina e / ou pericitos, 16,12 e / ou progenitoras derivadas de células de astrócitos neurais 17 e / ou 18 de neurónios. Os modelos &quot;em laboratório&quot; são muitas vezes produzidos a partir de roedores porque eles permitem in vitro / in vivo, ensaios e comparações e / ou o estudo de células endoteliais cerebrais produzidos a partir de modelos transgénicos 19. Recentemente desenvolvido em modelos in vitro de BBB também foram projetados para ajudar a prever a captação cerebral de potenciais SNC drogas candidatos antes de ensaios in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelos in vitro de BBB são normalmente utilizados para comparar o transporte de drogas com: i) conhecido penetração no SNC ou com low permeabilidade através da certificação e sem efeitos centrais, e ii) a aparente Pe de os mesmos medicamentos medidos em modelos animais da mesma espécie. As drogas que facilmente passam a certificação são principalmente lipofílico e atravessar as membranas das células endoteliais do cérebro por mediada por lípidos difusão livre (cafeína, carbamazepina, etc.) As drogas transportadas negativamente, tais como a digoxina, verapamil ou ciclosporina A são activamente extrudido por endoteliais cerebrais transportadores de efluxo tais como a P-gp. No entanto, muitas das moléculas terapêuticas recentemente desenvolvidos são produtos biofarmacêuticos, tais como proteínas recombinantes, siRNAs ou anticorpos monoclonais. A maioria deles não atravesse a certificação devido a: i) a ausência de transportadores específicos, e ii) a camada apertada de células endoteliais, que impedem que as moléculas de alto peso molecular de sofrer passagem paracelular. Com esses limites, as estratégias de &quot;Cavalo de Tróia&quot; foram implementadas usando vetores (anticorpos, peptídeos) contra os receptores conhecidos no BBB, envolveu in mediada pelo receptor de transporte ou transcitose (RMT), tais como o receptor de transferrina (Tf) (TfR), o receptor de insulina (RI), ou os membros do receptor de LDL (LDLR) relacionados com a família de receptores (LDLR, LRP1). Tais receptores têm sido encontrados em isolados capilares cerebrais e na certificação in vivo 24,25. Perfis de transcrição para estes receptores, em particular os da família LDLR, foram analisados ​​e comparados entre as células endoteliais do cérebro e células endoteliais do cérebro em co-cultura com astrócitos ou nos capilares cerebrais logo após sua extração do cérebro 26. Pardridge 24 abriu o campo com o anticorpo OX-26 contra o receptor de transferrina (TfR), seguido de anticorpos contra o receptor de insulina e o receptor do factor de crescimento semelhante à insulina 27,28. Com estes vectores de anticorpos baseada, ArmaGen Technologies desenvolveu um Trojan molecular plataforma cavalo tecnologia certificação para entregar drogas, incluindo proteínas, através da certificação 29. Oliteratura é rica em dados que mostram expressão LRP1 nas células endoteliais do cérebro e do seu papel como um poderoso receptor endocítico / limpador. A análise Western blot sugerido que LRP1 é expresso em fracções enriquecidas em capilares de cérebro de rato e em células endoteliais capilares do cérebro 30. Empresas como a Angiochem alvo LRP1 com vetores de peptídeos derivados de aprotinina que promovem o influxo de drogas eficiente em todo o BBB 31. No entanto, LRP1 também está envolvido no transporte ativo de Aâ e seu efluxo / autorização do parênquima cerebral de sangue 32. Estes dados implicam LRP1 num transporte bidireccional através da certificação de acordo com os seus ligandos. biOasis desenvolve a tecnologia transcendem usando um melanotransferrina proteína para o transporte de produtos biológicos, tais como enzimas lisossomais e anticorpos através da certificação 33 enquanto VECT-horus desenvolve vectores de peptídeos que têm como alvo o LDLR 34. Há dados que sugerem que a PRL e LDLR pode ser utilizado para o transporte de diferent moléculas, tais como enzimas lisossomais 35,36 ou complexos de nanopartículas em todo o BBB 37. O campo de interesse é a entrega da droga para o sistema nervoso central utilizando moléculas de vector e vetorizadas droga-candidatos para o tratamento de doenças do SNC. Em particular, a entrega da droga através da certificação tem de ser considerada no contexto de neuroinflammation, um processo que pode variar na sua extensão, mas que provavelmente é comum a todas as lesões e doenças do SNC, incluindo a encefalite, a esclerose múltipla, a doença de Alzheimer, etc Neuroinflammation está associada com a certificação inflamação e potencialmente com alterações na fisiologia certificação e considerando que a permeabilidade paracelular e transporte intracelular pode ser amplificado em condições patológicas 38,39,40,41,42,43. Por exemplo, o TNF-α, TWEAK, e outras citocinas modular a inflamação, e as experiências com modelos in vitro de BBB demonstraram que podem alterar as propriedades de paracelulares the em monocamada de células endoteliais 38,39,40 e que o TNF-α também conduz a um aumento do transporte transcelular de LDL 41, holotransferrina 42 e 43 da lactoferrina. Nosso objetivo foi desenvolver e caracterizar um otimizado e altamente reprodutível singênico rato modelo BBB usando co-culturas de células endoteliais cerebrais primários e astrócitos. Foram utilizados ratos Wistar cinco semanas de idade e neonatais para a produção de células endoteliais do cérebro e na produção de astrócitos, respectivamente. Um desafio foi estabelecer um protocolo que permite a produção de &quot;semanal reprodutíveis&quot; modelos de BBB. Para alcançar este objetivo, a cada passo do protocolo de produção foi realizada em dias fixos da semana, a partir da produção de microvasos cérebro na quarta-feira da primeira semana. As dissecções foram feitas quase todas as semanas, durante os últimos 3 anos. Para melhorar ainda mais a reprodutibilidade das culturas, um sistema de garantia de qualidade foi estabelecido. Todos Reagents e produtos químicos foram referenciados em um banco de dados (data de entrada, estoque, prazo de validade, etc.) O modelo foi caracterizado a seguir um certo número de critérios, tais como a organização das células endoteliais e pureza, TEER, LY permeabilidade, resposta à exposição a agentes pró-inflamatórios, a expressão qualitativa e quantitativa das proteínas TJ, a funcionalidade de transportadores de efluxo tais como a P-gp, e receptores envolvido na transcitose através da monocamada de células endoteliais, tais como o TfR ou o LDLR.

<table><tbody><tr><td>BSA fração V baixa endotoxina</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X)</td> <td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>DMEM glicose alta</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>&deg; Frascos T75 de 1 ano</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>tampão HEPES (1 M)</td> <td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg; C / 1 ano</td></tr><tr><td>de colágeno tipo IV camundongo (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg; C / 1 mês</td></tr><tr><td>Fibronectina humain plasma (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356008-20 &deg; C / 1 mês</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas, reta (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura, reta (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Fórceps, largura da ponta 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Fórceps, largura da ponta curva 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Colagenases / mistura de dispase (2 x 5 mg)</td> <td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>&deg; C / 3 meses</td></tr><tr><td>DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg; C / 1 ano</td></tr><tr><td>Gentamicina (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg; C / 1 ano</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro bovino de plasma pobre em plaquetas (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg; C / 1 ano</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro; g)</td> <td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>&deg; C / 6 meses</td></tr><tr><td>Heparina Na sal de mucosa suína Grau I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg; C / 1 ano</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg; C / 6 meses</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &graus; C / 1 ano</td></tr><tr><td>Inserção de célula suspensa de polietileno para placas de 12 poços</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porosidade: 1 &micro; m Superfície: 1,1 cm2</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg; C / 1 ano</td></tr><tr><td>de camundongo anti-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Coelho anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Desmina</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Vimentina</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clone V9, (58 &micro; g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Occludine&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 anticorpos secundários conjugados</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, sal de dilítio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>TNF-alfa humano</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>&deg; </td></tr><tr><td>C Rato MCP-1 ELISA Kit</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg; C / -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Camundongo anti-P-glicoproteína</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - fixação PFA 4% 1/200 (western blot)</td></tr><tr><td>Coelho anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1.000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloridrato de Verapamil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Receptor monoclonal de macroglobulina anti-a2 (CD91, LRP1) contra a cadeia b do aminoácido 4291-4344 dentro de uma repetição EGF</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &micro; g/ml)</td><td>1/5 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-LDLR</td><td>R& D systems</td><td>AF2255 (200 &micro; g/ml)</td><td>1/50 - fixação PFA 4%</td></tr><tr><td>Transferrina de rato-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg; O</td></tr></tbody></table>

criação de um<em&gt; in vitro</em&gt; modelo de rato barreira hemato-encefálica (bbb): a focus on bbb impermeabilidade e transportes receptor mediada

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

A barreira hemato-encefálica (BHE) regula especificamente fluxo molecular e celular, entre o sangue e o tecido nervoso. O nosso objectivo foi desenvolver e caracterizar um singeneico de rato altamente reprodutível modelo in vitro da certificação utilizando co-culturas de células endoteliais primárias de cérebro de rato (RBEC) e astrócitos para estudar os receptores envolvidos na transcitose através da monocamada de células endoteliais. Os astrócitos foram isoladas por dissecção mecânica a seguir à digestão de tripsina e foram congeladas para a co-cultura posterior. RBEC foram isoladas a partir de córtices de ratos com 5 semanas de idade. Os cérebros foram limpos de meninges e substância branca, e dissociado mecanicamente após digestão enzimática. Depois disso, o tecido homogeneizado foi centrifugado em albumina de soro de bovino para separar fragmentos de vasos a partir de tecido nervoso. Os fragmentos dos vasos foram submetidos a uma segunda digestão enzimática de células endoteliais livres da sua matriz extracelular. As restantes células contaminantes, tais como pericitos foram fUTRAS eliminado por plaqueamento dos fragmentos dos microvasos em meio contendo puromicina. Eles foram então passadas para filtros de co-cultura com os astrócitos cultivados no fundo dos poços. RBEC expressa altos níveis de junção apertado proteínas (TJ), como occludin, claudin-5 e ZO-1, com uma localização típico nas bordas da célula. A resistência eléctrica transendotelial (TEER) das monocamadas endoteliais cerebrais, o que indica a tensão de TJs atingiu 300 ohm · cm 2, em média. Os coeficientes de permeabilidade endotelial (PE) para lucifer amarelo (LY) foi altamente reprodutível com uma média de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Células endoteliais do cérebro organizados em monocamadas expressou o transportador de efluxo glicoproteína-P (P-gp), mostrou um transporte polarizado de rodamina 123, um ligante para a P-gp, e mostrou transporte específico de transferrina-Cy3 e DiILDL através da monocamada de células endoteliais. Em conclusão, nós fornecemos um protocolo para a criação de um in vitroBBB modelo que é altamente reprodutível devido aos métodos de garantia de qualidade, e que é adequado para a pesquisa sobre os transportadores e receptores de BBB.

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo in vitro altamente reprodutível da barreira hematoencefálica de rato. Isso é realizado removendo os nervos ópticos, o cerebelo e as meninges sob um microscópio estereoscópico, separando então os dois hemisférios cerebrais e dissecando-os para obter um fragmento limpo de córtex. O segundo passo consiste em isolar os microvasos do córtex por meio de tratamento enzimático e centrifugação dependente de densidade.Em seguida, os microvasos são semeados e incubados com puromicina para purificar as células endoteliais de células contaminantes, como parasitas. Culturas puras de células endoteliais cerebrais proliferam até as células atingirem 90% de confluência. O passo final é induzir a diferenciação das células endoteliais cerebrais de rato pelas células na câmara superior dos filtros de inserto e por meio do cultivo em co-cultura com astrócitos de rato previamente preparados e semeados.Por fim, a monocamada de células endoteliais cerebrais diferenciadas pode ser caracterizada pela expressão de proteínas específicas de junções apertadas e pelo índice de permeabilidade de um composto de referência através da monocamada de células endoteliais a partir do compartimento superior. Os modelos in vitro da BHE, como o apresentado aqui, são úteis para explorar a distribuição celular de moléculas-chave e para elucidar os mecanismos celulares e moleculares básicos do funcionamento da BHE. Em particular, tais modelos permitem a investigação de receptores da BHE e seu envolvimento no tráfego por endocitose e transcitose em nossas mãos.Os modelos in vitro da BHE são utilizados principalmente para investigar o direcionamento de receptores específicos com vetores peptídicos que desenvolvemos. Para facilitar a entrega de fármacos ao SNC através da BHE, utilizamos um processo denominado transcitose mediada por receptor, também conhecido como abordagem do cavalo de Tróia. A descrição visual é fundamental, pois indivíduos novos neste método exigirão habilidade de dissecação e um microscópio rápido e preciso o suficiente para garantir a sobrevivência tecidual durante o processo de produção celular.Outro ponto crítico é a interrupção precoce da região frágil e da área do salmão teleósteo para evitar a abertura da barreira durante os experimentos. Por fim, esta abordagem mostrará detalhes ao longo do protocolo que farão a diferença entre protocolos em vermelho e protocolos visualizados, demonstrando que o procedimento será realizado por mim e por meu colega. Inicie este procedimento revestindo dois frascos T75 com colágeno tipo IV e fibronectina a uma concentração de um micrograma por centímetro quadrado em água estéril para cultura, e deixe-os aderir no incubador a 37 graus Celsius até o semeadura dos microvasos.Dois dias depois, remova o cérebro do crânio de três ratos Vista com cinco semanas de idade e transfira os cérebros para uma placa de Petri contendo tampão de dissecção frio mantido em gelo. Disseque os cérebros sem o cerebelo e os nervos ópticos. Em seguida, corte cada cérebro ao meio para separar os dois hemisférios cerebrais sob o microscópio estereoscópico.Realize outro corte para remover o mesencéfalo e transfira os quatro cérebros para uma placa de Petri limpa sobre gelo com tampão de dissecção. Em seguida, transfira um prosencéfalo para uma nova placa de Petri contendo tampão de dissecção frio. Segure-o com uma pinça e remova cuidadosamente as meninges das bordas do prosencéfalo.Em seguida, vire o prosencéfalo e retire cuidadosamente as meninges sem rompê-las. Certifique-se de que o prosencéfalo esteja livre das meninges e corte a parte restante dos nervos ópticos. O objetivo deste passo é remover a camada de substância branca para obter uma camada cortical.Comece prendendo o prosencéfalo na borda e, em seguida, arraste cuidadosamente a pinça ao longo da superfície, tomando cuidado para não rasgar a superfície do córtex. Em seguida, certifique-se de que o cérebro esteja livre das meninges ao girá-lo para verificar se não há meninges residuais ou grandes vasos superficiais. A seguir, a partir da extração dos três cérebros de seus crânios, o tempo total para a dissecação não deve ultrapassar duas horas para preservação do tecido e sobrevivência celular.Transfira os córtices de três cérebros para seis mililitros de tampão de dissecção frio em um homogeneizador tipo Dounce de sete mililitros e, posteriormente, dissocie os córtices com 10 movimentos para cima e para baixo com o primeiro pistilo de maior folga, seguidos por 10 movimentos para cima e para baixo com o segundo pistilo de menor folga. Em seguida, transfira seis mililitros da suspensão para um novo tubo Falcon de 50 mililitros e lave o homogeneizador Dounce com 24 mililitros de tampão de dissecção frio, dividindo a suspensão em três tubos Falcon para obter o equivalente a um córtex por tubo. Posteriormente, centrifugue a 1000 Gs durante cinco minutos à temperatura ambiente.A observação do pellet mostra um gradiente de cor rosa, que representa a parte dos microvasos das cortes. Descarte agora o sobrenadante e homogeneíze o pellet de uma corte com um mililitro de solução enzimática contendo uma mistura de colagenases dyse, DNA tipo um e gentamicina. Coloque os tubos em um agitador durante 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, misture um mililitro do digestivo com 10 mililitros de BSA-HBSS 25% a 1X e, suavemente, vortexe os tubos; submete-se então à centrifugação dependente de densidade a 3.600 ×g por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação dependente de densidade, o pellet contém os microvasos e o disco superior contém a mielina, o parênquima cerebral e os microvasos residuais. Transfira cuidadosamente o disco superior e o sobrenadante para tubos cónicos de 50 mililitros limpos.Tenha cuidado para não aspirar o pellet de microvasos; vorte o tubo suavemente e repita a centrifugação dependente de densidade durante a segunda centrifugação. Mantenha o pellet resultante contendo os microvasos a quatro graus Celsius. Após a segunda centrifugação dependente de densidade, descarte cuidadosamente o disco superior e a mistura snat, e ressuspenda os pellets resultantes contendo os microvasos de ambas as centrifugações com um mililitro de HBSS frio um x.Em seguida, lave os microvasos com 20 mililitros de HBSS frio um x e centrifugue a 1000 Gs por cinco minutos. Descarte então o sobrenadante, tomando cuidado para não perder os microvasos. Homogeneíze o pellet dos microvasos provenientes de um córtex com um mililitro da mesma solução enzimática, após vortexar suavemente os tubos.Digira ainda mais os microvasos por uma hora a 37 graus Celsius em um agitador. Em seguida, misture os microvasos digeridos provenientes dos três córtices em um único tubo. Novamente, separe a mistura em dois tubos cónicos de 50 mililitros para obter os microvasos extraídos a partir do equivalente a um córtex e meio por tubo.Em seguida, centrifugue a 1000 Gs por cinco minutos. À temperatura ambiente, logo antes de semear os microvasos, retire dois frascos T 75 revestidos do incubador e aspire o excesso de revestimento. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de microvasos em um mililitro de ECM, completando cada tubo até 10 mililitros com ECM suplementado com quatro microgramas por mililitro.Adicione puromicina para iniciar o processo de purificação e plaque os microvasos no frasco. Em seguida, coloque os frascos no incubador a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ para permitir a adesão dos microvasos à matriz de colágeno-fibronectina e seguir com o processo de purificação. Vinte e quatro horas após o plaqueamento dos microvasos, lave os detritos celulares com ECM fresco e substitua o meio de cultura por ECM suplementado com quatro microgramas por mililitro de puromicina até o quinto dia, no incubador a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Vinte e quatro horas após o plaqueamento dos microvasos, as células endoteliais começam a migrar e se espalhar pela matriz de colágeno-fibronectina. No quinto dia, para finalizar o processo de purificação, lave os detritos celulares com ECM fresco e substitua o meio de cultura por ECM suplementado com dois microgramas por mililitro.Puramycin por mais três dias para proliferação. No oitavo dia, lave as células e adicione insulina, transferrina e selênio de sódio. Suplemente o meio de cultura até que os cultivos atinjam 90% de confluência no décimo dia.No oitavo dia, prepare os filtros de três placas de 12 poços revestindo-os com uma mistura de colágeno tipo IV e fibronectina, ambos a 0,5 microgramas por centímetro quadrado em água estéril para cultura. Comece adicionando 1,5 mililitro de água estéril para cultura no compartimento inferior.Em seguida, adicione 0,5 mililitros da mistura no compartimento superior. Deixe a matriz aderir a 37 graus Celsius até a semeadura das células endoteliais no mesmo dia, cinco dias antes do estabelecimento da co-cultura. Descongele os astrócitos de frascos criogênicos a 37 graus Celsius e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros com 10 mililitros de GCM centrifugado.A suspensão a 120 Gs durante oito minutos à temperatura ambiente. Em seguida, re-suspenda o pellet de astrócitos em GCM e plaque com uma densidade de 30.000 células por centímetro quadrado. Nas placas de 12 poços, coloque as placas de 12 poços no incubador a 37 graus Celsius, 5%CO2 no dia 10, logo antes da dissociação de RBEC com tripsina.Lave o filtro pré-codificado com meio DMM F12, preencha previamente as câmaras com ECM e recoloque-as no incubador até o revestimento com RBEC no mesmo dia. Lave as RBEC duas vezes com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicione quatro mililitros de solução de tripsina-EDTA aquecida por frasco T75 a 37 graus Celsius durante exatos 30 segundos e remova 3,5 mililitros da solução de tripsina-EDTA.Tendo o cuidado de manter sempre uma camada de tripsina EDTA cobrindo as células endoteliais. Em seguida, acompanhe a dessanexão das células por meio da observação ao microscópio. Quando a camada celular começar a se desprender da matriz, bata suavemente na borda do frasco T 75 até que todas as células estejam em suspensão. Adicione três mililitros de ECM a cada frasco T 75 e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Repita este passo duas vezes, lavando o meio para recuperar todas as células.Dissocie muito suavemente a suspensão celular pipetando para cima e para baixo quatro vezes com uma pipeta de 10 mililitros equipada com ponteira amarela. Conte as células na suspensão e plaque-as imediatamente nos filtros pré-codificados e pré-preenchidos em alta densidade no dia seguinte. Troque o meio do compartimento superior duas vezes para remover detritos celulares, evitando assim a disruptura da monocamada celular durante a troca de meio.Incline ligeiramente a placa e não aproxime a pipeta de aspiração, deixando sempre um pouco de meio acima da monocamada celular, de forma similar, para evitar a secagem da monocamada celular durante a troca do meio. Lave apenas seis insertos por vez. Vinte e quatro horas após a semeadura, a monocamada celular deve estar em confluência.Em seguida, no mesmo dia, um dia antes do estabelecimento do cultivo em co-cultura, substitua o meio de cultivo dos astrócitos por 1,5 mililitro de meio de diferenciação suplementado no dia 12, considerado o primeiro dia de diferenciação. Substitua o meio de cultivo dos filtros contendo as RBEC por meio de diferenciação. Posteriormente, transfira os filtros de RBEC para os poços contendo os astrócitos nessas condições.Modelos in vitro diferenciam e expressam proteínas relacionadas às junções em até três dias, e a diferenciação ideal dura mais três dias. Aqui, a monocamada celular foi imunomarcada com menton para revelar uma monocamada confluinte de células endoteliais cerebrais com morfologia não sobreposta e células típicas em forma de fuso com morfologia endotelial, bem como a expressão de proteínas de junções apertadas denominadas ZO-1 e ocludina. A integridade da monocamada no modelo de BBB em placa de 12 poços foi avaliada mediante a medição do transporte de amarelo de Lucifer.Os resultados são expressos em permeabilidade ou PE em 10 elevado a menos três centímetros por minuto, e a barreira é considerada permeável ou aberta quando o PE do LY for superior a 0,6 vezes 10 elevado a menos três centímetros por minuto. Nas últimas décadas, muitas publicações e revisões forneceram informações sobre modelos estáticos e dinâmicos in vitro da BHE de diferentes espécies. No entanto, tais modelos continuam difíceis de manipular e a reprodutibilidade da qualidade da barreira permanece um objetivo importante a alcançar.Após assistir a este vídeo, os cientistas devem ter uma boa compreensão de como produzir e caracterizar um modelo in vitro da BPP.

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Este vídeo descreve um ensaio de permeabilidade para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro usando moléculas de fluoresceína de sódio.

Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

Este vídeo demonstra um método para estudar a permeação através de um modelo de barreira hematoencefálica (BBB) in vitro usando astrócitos e células endoteliais em uma inserção de membrana, com ferritina carregada com FITC e FITC livre. A ferritina FITC se ligou aos receptores nas células endoteliais e atravessou a barreira da membrana para a câmara inferior, enquanto o FITC livre mostrou permeação restrita e permaneceu na câmara superior.

Estudando a permeação de FITC e FITC-ferritina através de um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

Um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica baseado em uma co-cultura de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato e astrócitos é descrito e validado. Este sistema mostrou-se uma ferramenta válida para estudar o efeito da nanoformulação na permeação transbarreira de moléculas fluorescentes.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

A manutenção da cobertura da barreira hematoencefálica é fundamental para a homeostase do sistema nervoso central. Este protocolo descreve técnicas in vitro para delinear os processos fundamentais e patológicos que modulam a cobertura da barreira hematoencefálica.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

Aprenda a criar um modelo in vitro reprodutível da barreira hemato-encefálica de rato usando co-cultura de células endoteliais e astrócitos. Este método permite estudar propriedades de barreira e mecanismos de transporte.

Criação de um In Vitro Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada (Vídeo) | JoVE Journal

Criação de um

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