Name: Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 24 s
Description: Aprenda a perfilar microRNAs regulados por estrogênio em células de câncer de mama usando microarranjos microfluídicos. Este método permite estudar mecanismos moleculares do câncer de mama.

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Somos gratos ao Dr. Xiaolian Gao, da Universidade de Houston, para prestação de consultoria para a plataforma de microarray LC Ciências miRNA, a Dr. Karin Edvardsson, Instituto Karolinska, na Suécia, e Dr. Eylem Aydogdu, da Universidade de Houston, por compartilhar seus conhecimentos miRNA . A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R01CA172437. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Este trabalho também foi apoiado por subsídios do Fundo Emerging Technology Texas, no âmbito do Acordo não. 300-9-1958.

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Os autores não têm nada a revelar.

Determinar o mecanismo de regulação hormonal de miRNA em células de câncer de mama pode fornecer uma plataforma para a compreensão desta doença e pode fornecer potencial tratamento para o cancro da mama. A cultura destas células para proporcionar a condição óptima para a acção da hormona é muito importante. Aqui, um protocolo que assegura que a hormona de interesse (estrogénio) foi excluída antes do tratamento e que uma dose óptima de E2 foi utilizado durante um tempo apropriado, durante o tratamento foi descrito. Outros efeitos do factor de crescimento hormonais e foram mantidas a um mínimo através da redução gradual dos níveis séricos e usando DCC-FBS, o qual é de FBS que foram arrancados da maior parte da sua hormona, citoquinas, e factores de crescimento. Fenol mídia livre de vermelho foi ainda utilizado para minimizar outros efeitos não-hormonais, dado que o fenol vermelho foi reportado como tendo actividade estrogénica e afectar certas funções em linhas celulares de 20,21. O tempo de exposição das células à hormona é de grande importância. Para regulação associados com estrogénio de genes, tem sido mostrado previamente que 24 hrexposure produzir uma resposta significativa de genes alvos directos nas células do cancro da mama 1,18. Desde miRNAs são transcritos pela RNA polimerase II, como mRNAs, é concebível que este é um ponto de tempo adequado para detectar regulação direta também de miRNAs. É ainda a ser determinado, se e como estes miRNAs afetar a expressão dessas metas ER conhecidos em células de câncer de mama. miARN perfil de expressão pode ser um desafio devido ao pequeno tamanho relativo da miARN, o facto de a sequência madura miARN pode ser encontrado também na pri-miARN e o pré-miARN, e por causa da heterogeneidade no seu teor de GC 22. Várias técnicas de perfilamento e químicas têm sido empregadas para superar esta dificuldade. Entre estes são diferentes abordagens de microarray e análise de qPCR (figura 2). Apesar de microarray é amplamente aceito por todo genoma analysis, pode proporcionar falsos negativos e existem diferenças entre as plataformas disponíveis, que variam a partir da química para a tecnologia de impressão 23. Além disso, o processo de normalização apresenta um desafio ao analisar os relativamente poucos genes miRNA, que são contados em milhares comparação com as dezenas de milhares de cópias de RNAm. qPCR, por outro lado, é mais sensível, e é melhor aplicada quando menos genes devem ser considerados. No entanto, quando realizado em grandes placas de 384 poços, com apenas uma réplica técnica por placa, várias placas necessitam de ser analisados ​​para cada amostra o que torna a análise dispendiosa. Além disso, em nossas mãos, muitos resultados mais negativos falsos foram obtidos por meio da análise DLP-LDA em comparação com o microarray. Dado que a sequência de miARN madura está presente no pri-miARN e as sequências pré-miRNA, é de interesse para diferenciar entre estas transcrições que utilizam técnicas de PCR de 24. Sondas de DLP estão disponíveis também para pré-miRNAs, e spprimers ecific também pode ser projetado para excluir diferente maduro ou precursor variantes usando corante Cyanine tecnologia qPCR. qPCR é um padrão de ouro para a validação da expressão diferencial de perfil resultados. A eficácia da qPCR, no entanto, depende de vários parâmetros, incluindo a extracção de ARN, a integridade do RNA (qualidade), a síntese de cDNA, o desenho de primers, método de detecção (química), e o gene de referência para a normalização dos dados 1,22,25. As opções para o desenho de primers para análise de miRNA é muito limitado, uma vez que o comprimento da seqüência de curto miRNA não dá muito espaço para desenho de primers alternativa, e apenas uma cartilha pode ser abrigado neste curto espaço de seqüência. Por isso, a necessidade de manipulações alternativos, como ilustrado na Figura 2. Repetições técnicas são importantes para validar a robustez do método de amplificação e do processo empregado. Réplicas biológicas são necessárias para uma representação do variatio biológica geraln, incluindo a resposta variável ao ligando de tratamento, e para mostrar que os efeitos observados em uma célula são reprodutíveis. Com base em nossa experiência, as variações na expressão de miRNA entre culturas celulares podem ocorrer. Normalmente, estas diferenças são menores do que cerca de 1,3 vezes, e a média de valores e correspondente SD identifica a variação natural e tecnológico. Esta variação pode resultar de vários factores, incluindo, a densidade celular e o facto de as funções celulares podem mudar de passagem para passagem. Para identificar estatisticamente significativas expressões resultantes do tratamento ligante, um significado amplamente aceito é quando o valor de p for menor que 0,05. Aqui, o teste t de um estudante nas repetições biológicas e técnicas que utilizam a distribuição de duas caudas e de duas amostragens parâmetros de variância desiguais têm sido utilizados. Existem outros parâmetros t-teste, ea escolha depende da configuração experimental 26. Um protocolo detalhado para avaliar regulamentos hormonais de maduro miRNA em células de câncer de mama foi fornecido. Tecnologias importantes e química em perfis e validar essas expressões miRNA foram claramente explicados. A tecnologia escolhida para estudos de miRNA em células de câncer de mama em última análise, depende do que exatamente está sendo investigado.

O estrogênio é um hormônio que é importante durante o desenvolvimento da glândula mamária. O estrogênio também desempenha um papel importante no desenvolvimento, manutenção, risco e tratamento do câncer de mama 1. O estrogênio exerce sua função através da ligação a ERs, que são fatores de transcrição e regulam genes-alvo específicos. Das duas variantes do receptor, ERa é essencial para a proliferação dependente de estrogénio das células do cancro da mama. A maioria dos cânceres de mama são ERa positivo e depende de estrogênio para o crescimento. Isso fez com que a sinalização estrogênio e ERa um alvo para o tratamento in-receptor de hormônio de câncer de mama positivo. Compreender o mecanismo subjacente de ERa é importante para melhorar os resultados do tratamento, superar a resistência ao tratamento, e entender como o câncer de mama se desenvolve. miRNAs desempenham papéis críticos em funções celulares devido ao seu grande impacto na regulação gênica pós-transcricional. miRNAs são 19-24 nucleotídeos curto, de cadeia única, Não codificante RNAs que são primeiro transcritos pela RNA polimerase II em transcrições primárias miRNA (pri-miRNA). Eles são processados ​​no núcleo por Drosha em precursoras-miRNAs curtas de gancho (pré-miRNA) e em seguida processada por Dicer e separadas em cadeias individuais para formar miRNAs maduras no citoplasma. O single-stranded miRNAs maduros são transferidos para as proteínas Argonaute para formar complexo RISC. Em seguida, os miRNAs pode hibridar com as regiões 3 &#39;não traduzidas (3&#39;-UTR) de um ARNm alvo, levando a regulação pós-transcricional, bloqueando a tradução ou a degradação do mRNA-alvo 2. Devido ao importante papel que estrogênio e miRNAs desempenham na progressão do tumor, identificando miRNAs associados sinalização normal ou interrompido o estrogênio é importante para melhorar a nossa compreensão do desenvolvimento e melhorar o tratamento do câncer de mama. Embora haja uma boa compreensão de como ERa regula genes codificadores de proteínas, a extensãoe detalhes de não-codificante regulamentos RNA continua a ser minuciosamente investigadas. Os estudos iniciais com o objetivo de elucidar ERa regulação do miRNA em linhas de células de câncer de mama tiveram resultados conflitantes, mesmo quando a mesma linhagem de células foi analisado 3-6. Isto pode ser um resultado de tratamentos diferentes, variações biológicas, a utilização de técnicas diferentes, e ao facto de o pequeno tamanho destes pequenos RNAs torná-los difíceis de analisar. Aqui, um protocolo que controla as variações do método e artefactos é descrito. Para identificar quais miRNAs são regulados pelo estrogênio, o perfil de um modelo de câncer de mama bem definida de atividade ERa é um primeiro passo. Várias linhas de células foram geradas a partir de tumores da mama humanos ERa-positiva, que são dependentes de estrogénio parecido com a maioria dos cancros da mama clínicos. As propriedades moleculares de duas destas linhas de células, T47D e MCF7, incluindo a expressão de ERa e seu alvo a jusante,o receptor da hormona progesterona (PR), a falta de expressão do receptor da membrana de HER2, juntamente com a expressão de genes de diferenciação de resposta ao estrogénio e luminais-epitelial, torná-los adequados como modelos para o subtipo luminal dos tumores mamários 7-10. 17β-estradiol (E2) é a forma predominante de estrogénio, e as concentrações e os pontos de tempo para a activação da transcrição óptima de ERa foram caracterizados em vários estudos. Neste protocolo 10 nM tratamento E2 por 24 horas é usado e T47D e MCF7 como modelos para a atividade ERa em células de câncer de mama 1. Além disso, os regulamentos miRNA tempo-dependentes podem ser especificamente analisados ​​em um intervalo de tempo de por exemplo 1-72 horas. Em segundo lugar, analisando miRNA tem desafios diferentes, em parte devido aos seus tamanhos curtos. miRNAs não são bem retidos na preparação de ARN total, quando guanidina thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitações RNA regulares são realizados, ou quando rpurificações coluna Andard são utilizados. Precauções especiais devem ser tomadas para manter ou enriquecer para a menor fração de RNAs. Aumentando o volume de isopropanol, baixando a temperatura antes da centrifugação (-80 ° C), e omitindo a lavagem com etanol a 70%, a retenção destes pequenos RNAs pode ser aumentada durante a precipitação. Ou, as colunas e os tampões específicos para uma preparação de ARN total contendo miARN de alta qualidade e robusto pode ser utilizado. Também para a própria análise, seus tamanhos curtos criar desafios. Para a seleção de miRNA de todo o genoma, há três miRNA comuns técnicas para escolher de perfil: microarrays, qPCR, e sequenciamento de última geração. Cada técnica pode ser realizada utilizando várias plataformas diferentes, e são necessárias diferentes preparações de amostra, cada uma com diferentes riscos da introdução de artefactos. Em miRNA microarray, um slide é manchado ou sintetizado com milhares de oligonucleotídeos. Estes oligonucleótidos são usados ​​como sondas, e cada um de a sondas é desenhado para hibridar com uma sequência de miARN particular. A preparação de amostras para microarrays, como realizado neste estudo, o primeiro enriquece para miRNAs e depois introduz Cy5 e Cy3 rotulagem para os miRNAs. Microarray dá a oportunidade para observar os níveis de expressão relativa de um grande número de genes em simultâneo, é rápido e adequado para o rastreio de grande número de amostras, mas só pode analisar as sequências presentes no micro-arranjo e por exemplo não detectar alterações na desconhecido ou mutado miRNAs. Análise Microarray como realizado neste protocolo também requer quantidades relativamente grandes, cerca de 5 mg, de RNA total por amostra para análise. Baixa densidade qPCR miARN perfis requer menos material (700 ng / amostra e replicar), e permite a detecção e quantificação de miRNAs. Níveis de transcrição podem ser determinados, e a quantidade pode ser um valor absoluto ou um valor relativo. análise qPCR primeiro requer a conversão de miRNA em cDNA, aqui usando um loopprimer para cada miRNA específicas que garantam a análise de apenas amadurecer miRNA. Isto gera um modelo já que pode ser amplificado utilizando um iniciador de sentido directo específicos de miARN e um iniciador inverso universal complementar para a sequência loop, e podem abrigar a inserção de uma sonda dupla etiquetado para especificidade. qPCR pode ser utilizado num formato de baixa densidade em que centenas de miRNAs pode ser detectado em paralelo utilizando uma ou várias placas de 384 poços com os pares de iniciadores individuais em cada poço 11. Sequenciação da próxima geração, por outro lado, é a única destas técnicas que permite para a descoberta de novos, miRNAs mutadas ou modificadas, como todos os ARN de uma amostra pode ser sequenciado 11. Esta técnica, contudo, requer várias etapas para enriquecer pequenos RNAs e produzem uma pequena biblioteca de ARN utilizando várias etapas de ligaduras ligantes e purificações com riscos subsequentes melhoradas de modular os níveis de expressão relativa entre amostras. Também requer bioinformati significativasanálise cs. Dadas as diversas técnicas de miARN perfis, a técnica mais apropriada depende das aplicações. Microarrays são mais adequados quando o material é relativamente abundante e os juros é definir expressão diferencial de miRNAs já conhecidos. Baixa densidade matrizes qPCR são os mais adequados quando uma quantidade limitada de amostra está disponível e uma maior sensibilidade destes pequenos RNAs de baixa expressa é necessário. A sequenciação é mais apropriado quando é necessária a análise de miRNAs desconhecidas, mutantes ou isoformas diferentes de um miARN. No estudo dos miRNAs regulados por estrogénios em câncer de mama, duas células de linhas de modelo são usadas, T47D e MCF7, onde grandes quantidades de RNA estão prontamente disponíveis. Cada linha celular foi analisada em culturas de células replicadas, utilizando diferentes passagens, cada uma em repetições técnicas de tratamento. Isto permite a detecção robusta de reprodutível, miRNAs ERa regulamentados. Relativos níveis de expressão de miRNA foram comparados usando tanto microarray miRNA eSondas marcadas duplas - matrizes de baixa densidade (DLP-LDA) e validou os resultados com qPCR específico usando tanto corante Cyanine e químicas de DLP. regulamentos miRNA foram, então, analisados ​​em séries temporais para definir sua regulamentação exata ao longo do tempo, o que pode ajudar a diferenciar variações aleatórias ou circadianos dos regulamentos induzida pelo estrógeno, e indicar efeitos primários de efeitos secundários. Comparações Bioinformatical com estudos de ligação da cromatina de ERa pode auxiliar ainda mais na diferenciação do ensino primário contra efeitos secundários. O ensaio resultou em uma avaliação fiável dos regulamentos miRNA onde poderia ser estabelecido que, após tratamento E2 24 hr transcrições codificadores de proteínas foram prontamente regulada mas miRNAs maduros não foram afetadas 1. No entanto, é possível que os miRNAs são regulados pelo posteriores pontos temporais, como demonstrado na análise de séries temporais de miRNAs selecionados 1. Os detalhes precisam ser mais explorados eo protocolo apresentado aqui fornece uma Robust maneira de estudar regulação hormonal de miRNAs maduros em linhas celulares de cancro da mama.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol sem vermelho DMEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Água Ultrapura</td><td>EMD Milipore</td><td>Equipamento</td><td></td>específico</tr><tr><td>DCC-FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablet</td><td>Medicago, Produtos Químicos Precisos</td><td>Preciso (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td><td></td></tr><tr><td>17&beta;- estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4409</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-600ML</td><td></td></tr><tr><td>T47D ou linhas de células MCF7</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>T47D (ATCC HTB-133) e MCF7 (ATCC HTB-22)</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BD353136 (tampa ventilada)</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica</td><td>VWR International LLC</td><td>53300. Para câmara de contagem de células Countess de 5mL (53300-421)</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess Placas</td> de 100 mm <td>da Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR International LLC</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tiocianato-fenol de guanidínio (TRizol)</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células de borracha&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>82050-470</td><td></td></tr><tr><td>Método de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNase I&nbsp; livre de Rnase (degradação de DNA)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNase (água livre de nuclease)</td><td>Espectrofotômetro Thermoscientific</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit de ensaio</td><td>Agilent</td><td>5067-1512</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2938C e para software (G2946)</td><td></td></tr><tr><td>Todos os primers (exceto primers TaqMan)</td><td>Tecnologias de DNA integradas</td><td>Específico por pedido para cada gene/miRNA</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de primeira fita, DTT, dNTPs, sobrescrito III (kit de síntese de cDNA sobrescrito III)&nbsp;</td><td>Placa</td><td>de</td> reação de 96 poços MicroAmp Fast da Life Technologies 18080085 <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Óptico Rápido Cobre Life</td><td>Technologies</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>2x SYBR green PCR master mix (corante de cianina)</td> <td>Sistema</td> de PCR em Tempo Real <td>Rápido Life Technologies 4385612</td><td></td></tr><tr><td>7500 e software</td><td>Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Tecnologia de Biochip Microfluídico Paraflo</td><td>LCSciences</td><td>MRA-1001 e AS-2001 (para análise de resultados)</td><td></td></tr> <tr><td>DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/conjunto de pool humano)</td> <td>Life Technologies</td><td>4400928</td><td></td></tr><tr><td>Dual Labeled Probes (TaqMan) kit de miRNA RT&nbsp;</td>Sistema <td>de PCR GeneAmp 4366596</td><td></td> <td>da Life Technologies</td></tr><tr><td>9700 termociclador</td><td>Life Technologies</td><td>4310899</td><td></td></tr><tr><td>Sondas Duplas Marcadas (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Sistema de PCR em Tempo Real Rápido</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td></td></tr><tr><td>softwares gerenciadores de SDS e RQ</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>4444202</tr><tr><td>Kit de Síntese de cDNA de primeira fita e qRT-PCR de miRNA NCode</td><td>Life Technologies</td><td>MIRC-50</td><td></td></tr><tr><td>10x DPL (TaqMan) RT primers</td><td></td><td>Life Technologies Específico para cada miRNA</td><td></td></tr><tr><td>20x DPL (TaqMan) primer de ensaio em tempo real&nbsp;</td><td>Tecnologias</td><td>de Vida Específicas para cada miRNA</td><td></td></tr></tbody></table>

profiling de micrornas estrogênio regulados em células do cancro da mama

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

O estrogênio desempenha um papel vital no desenvolvimento da glândula mamária e progressão do câncer de mama. Ele medeia a sua função pela ligação e ativação dos receptores de estrogênio (ERS), ERa e RpE. ERa é freqüentemente regulada no câncer de mama e impulsiona a proliferação de células de câncer de mama. Os ERs funcionar como fatores de transcrição e regulam a expressão do gene. Considerando que o Regulamento do ERa de genes codificadores de proteínas está bem estabelecida, sua regulamentação não codificante de microRNA (miRNA) é menos explorado. miRNAs desempenham um papel importante na regulação pós-transcricional de genes, inibindo a sua tradução ou a degradação de ARNm sua. miRNAs pode funcionar como oncogenes ou supressores de tumor e também são promissores biomarcadores. Entre os ensaios miRNA disponíveis, microarray e em tempo real PCR quantitativo (qPCR) têm sido amplamente utilizados para detectar e quantificar os níveis de miRNA. Para identificar os miRNAs regulamentados pela sinalização estrogênio no câncer de mama, thexpressão eir em linhagens de células de câncer de mama ERa-positivas foram comparados antes e depois de estrogênio-ativação usando tanto os microarrays μParaflo-microfluídicos e Dual-sondas marcadas baixas matrizes densidade. Os resultados foram validados usando ensaios qPCR específicas, aplicando-se tanto Cyanine corante à base e Dual rotulada química baseada em Sondas. Além disso, um ensaio de ponto de tempo foi usado para identificar os regulamentos ao longo do tempo. Vantagens da abordagem ensaio miRNA utilizado neste estudo é que ele permite uma triagem rápida de regulamentos maduro miRNA em inúmeras amostras, mesmo com quantidades de amostras limitadas. O layout, incluindo as condições específicas para a cultura de células e tratamento com estrógeno, repetições biológicos e técnicos, e de triagem em larga escala seguido de confirmações em profundidade usando técnicas distintas, garante uma detecção robusta de regulamentos miRNA e elimina falsos positivos e outros artefatos. No entanto, os miRNAs mutantes ou desconhecidos, ou regulamentos no leve transcrito primário e precursorl, não irá ser detectado. O método aqui apresentado representa uma investigação aprofundada da regulamentação miRNA mediada por estrogênio.

Uma visão geral do método é apresentado na Figura 1 e uma comparação entre as várias preparações de amostras e modificações de ácidos nucleicos necessárias para cada técnica é visualizado na Figura 2. A condição eo ambiente das células antes do tratamento com hormônio é importante para determinar os efeitos reais do hormônio 16. Alguns meio e soro contêm factores de crescimento que possam afectar os resultados, então as células são privadas de soro para garantir que todos os efeitos hormonais foram reduzidas a um mínimo. Assim, aquando do tratamento com E2, existe mais certeza de que os efeitos observados são E2-associado. Um fator importante é a confluência das células, o que influencia contato e comportamentos, como sinalização e proliferação de células célula-célula. As células foram deixadas a 80% confluentes (Figura 3A) e bem ligada para permitir o crescimento e evitar a perda de células durante a subsequente lavagem e meios de change. As condições durante a extracção de ARN e de armazenamento são importantes para a qualidade do ARN e a análise subsequente. Sabe-se também que o número de células, o método de extracção, e o teor de GC da miARN pode afectar o rendimento e qualidade dos dois mRNAs e miRNAs 17. Assim, é necessário realizar a extracção de ARN em condições livres de RNase e para verificar a qualidade do ARN antes de continuar com as experiências. Após a extracção, a quantificação do ARN fornece informação sobre a concentração de RNA total (contendo ambos os ARNm e miRNAs), que permite a observação de rendimento. Ele também fornece uma representação gráfica dos resultados, como visto na Figura 3B, e isto permite a observação da pureza da amostra (normalmente indicado por um pico, painel superior). Pobre rendimento de RNA não produziria nenhum absorção específica a 260 nm (Figura 3B, painel inferior). Para determinar se o ARN é de alta qualidade, o ARNintegridade foi medido. Um número de integridade do RNA (NIR) de entre 9-10 garante que o ARN não é degradado e é de qualidade óptima. Além disso, a representação gráfica da ARN deve ser observada, e o 18S e 28S rRNA deve ter picos, como mostrado na Figura 4 (painel do meio). Comparação com a escada de mão (Figura 4, painel superior) identifica o tamanho dos picos. Um RNA degradado teria picos menos claras e de uma quantidade relativamente reduzida de 18S e 28S rRNA (Figura 4, painel inferior). A fração de pequenos RNAs pode ainda ser assegurada usando o Agilent RNA pequeno Kit. Recomenda-se para validar resposta de estrogénio após o tratamento, de acordo com as condições experimentais especificadas, antes de se proceder ao rastreio miARN. Um qPCR pode ser realizada em um gene alvo conhecido como ER pS2 SPINK4 ou 18, utilizando um molde de ADNc. Estes genes são normalmente regulados positivamente dentro de 1-24 horas após o tratamento com E2. Uma vez que a qualidade do RNA e a resposta de estrogéniofoi avaliada, outra experiência pode ser conduzida. Microarray ainda é uma técnica amplamente utilizada para o rastreio em larga escala para a expressão em células de miARN. Por exemplo, o microarray miRNA uma vez utilizada continha 894 miRNAs maduros e 50 controles sondas únicas no quadrigêmeos 1. As hibridações foram realizadas em duplicados com permuta de corantes procedimento. Os resultados de microarray miRNA são geralmente representados graficamente por mapas de calor. Figura 5A mostra um mapa de calor, que representa os dados a partir de uma comparação de microarray miARN entre o veículo e E2 amostras tratadas. O vermelho indica que a miARN é regulada na amostra tratada com E2 (expressão superior), enquanto o verde indica a regulação negativa da miARN (menor expressão). A selecção miARN geralmente depende da sua importância na expressão, e geralmente um valor de p menor que 0,05 é considerado significativo. Os miRNAs que são indicados para serem diferencialmente expressos devem ser mais validada wom qPCR, para distingui-los dos falsos positivos. A matriz DLP-LDA, por outro lado, utiliza um método baseado em qPCR para triagem de miRNAs regulamentados em um formato de 384 poços. Normalmente, duas placas de 384 poços (placas) são fornecidos, piscinas A e B. Grupo A contém normalmente mais bem caracterizada e mais altamente expresso miRNAs de piscina B. O nível relativo de cada miARN são determinados por qPCR, onde um miARN é analisada por bem (Figura 5B). A Ct-valor mais alto indica menor expressão de miRNA. Muito parecido com o microarray miRNA, os resultados alcançados a partir da DLP-LDA precisam ser mais validado para garantir a precisão. Validações pode ser realizada utilizando qPCR. Aqui, dois métodos de detecção de qPCR são descritos para evitar tendência do método e para permitir a confirmação e investigação de regulamentos miRNA completa. O Cyanine à base de corantes detecção química funciona diferente do que DLP que o profiling DLP-LDA é baseada em, e é apropriado para confirmarfins ation. Ele pode ser menos específico que detecta todos os ADN de cadeia dupla amplificados, mas a homogeneidade da amostra pode ser avaliado através da realização de uma análise de fusão curva Figura 6A. (Painel à esquerda) mostra a análise de fusão da curva de um miARN, e um pico uniforme claramente definida pode ser visto. Vários picos seria observado se o primer é quantidades não específicas ou significativas de cartilha-dímero é formado (Figura 6A, painel direito). Ensaios de DLP miRNA, por outro lado, é mais específica que a amplificação de apenas o alvo é detectado miARN. Parcelas de amplificação de cada um dos alvos miARN pode ser observada, como exemplificado na Figura 6B. A opção de controle para a ocorrência de vários produtos de amplificação utilizando a análise da curva de fusão é, no entanto, não está disponível com esta química e corante Cianina qPCR é menos dispendioso. Tintura Cyanine e DLP qPCR ensaios podem, por vezes, gerado resultados ligeiramente diferentes. Para ambos os ensaios de qPCR, a comparação para um refecia do gene são necessários para determinar a expressão relativa de genes entre duas amostras. O gene de referência, também referido como gene de manutenção, deveria ser um gene cuja expressão não é alterado e que é expressa em níveis semelhantes aos do gene de interesse. Um exemplo de um gene de referência apropriado nestas linhas celulares de cancro da mama é ARHGDIA, um PIB de Rho-dissociação Inibidor que funciona reacções das proteínas Rho taxas de GDP / GTP. Como pode ser observado na Figura 6C (parte superior), o nível de ARNm de ARHGDIA não é alterada entre o veículo e as amostras tratadas com ligando. O ARNr 18S também pode ser usado, embora a sua expressão requer uma alta diluição 1:500 em separado da unidade de cDNA e, portanto, é menos adequada. Para a análise de miRNA, ainda há um debate sobre um gene de referência bem definida. Até agora, o U6 snRNA é um gene de referência que é amplamente aceito para análise de miRNA. U6 snRNA é o, não codificante RNA nuclear pequeno ~ 110 nucleotídeos de comprimento que funciona no nuclear spl pré-mRNAgelo 19. Como pode ser observado na Figura 6C (baixo), os níveis de expressão U6 são praticamente os mesmos em todas as amostras apresentadas, permitindo cálculos dos níveis variáveis ​​de miRNA. Uma representação gráfica de um resultado miARN qPCR para uma comparação entre o veículo e as células tratadas com E2, que foram normalizadas para o U6 referência pode ser observado na Figura 6D. Isto ilustra um miARN que foram detectados como não reguladas após o tratamento 24 horas E2, mas que abriga os sítios de ligação da cromatina de ER perto da sua localização genómica, e análise de séries identificou a regulação significativa 72 horas após o tratamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> Figura 1. Uma visão geral da abordagem empregada para a detecção de regulação hormonal de miRNA em células de câncer de mama. </strong&gt; processo começa com a cultura de células e de tratamento, seguido de larga escala para identificar perfis de miARN miRNAs possivelmente expressos diferencialmente, e termina com validações de qRT-PCR de resultados de matriz. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> Figura 2. A comparação das várias preparações de amostras e manipulação de ácidos nucleicos para cada técnica de detecção de miARN. (A) microarray miARN usando o método de tecnologia μParaflo inclui enriquecimento, poli-A de rejeito e rotulagem ligadura. (B) a preparação da amostra a tecnologia DLP e método de detecção inclui um cDNA de síntese iniciador anelada que se estende após o passo de desnaturação e proporciona um fragmento mais longo que alberga o preparação de amostras primer e sonda seqüência reversa. (C) a tecnologia dye Cyaninee método de detecção inclui um poli-cauda, ​​e síntese de cDNA com uma iniciadores oligo-dT, incluindo uma sequência 5 &#39;universal. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> Figura 3. Cultura celular e extração de RNA. (A) Células cultivadas para ilustrar 80% de confluência antes do tratamento necessário com ligando. (B) representação gráfica da concentração de RNA e pureza após a extracção. Cada pico representa um exemplo de um processo de extracção e bem sucedida origina ARN puro (painel superior). A RNA extraído mal não mostra pico de absorção clara a 260 nm (painel inferior). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> Figura 4. &amp; #160; RNA controle de qualidade Os resultados da análise de integridade de RNA mostrando a representação gráfica para a escada (em cima), um RNA de boa qualidade (meio) e uma amostra de RNA degradado (baixo).. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> Figura 5. Uma ilustração de miRNA resultados de perfil. (A) A representação mapa de calor de miRNA resultados de microarranjos para miRNAs diferencialmente expressos. miR-A, B, C são regulados positivamente no tratado com amostra de E2, tal como indicado no vermelho, enquanto que o miR-D, E, F, G são reprimidos na amostra tratada com E2, tal como indicado no verde. (B) Amplificação de parcelas para cada miRNA a partir dos resultados DLP-LDA. miARN detectados são amplificadas tal como indicado pelo aumento do valor Rn. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. análise qPCR de regulamentos miRNA. (A) análise de fusão curva para um miRNA analisados ​​usando detecção corante Cyanine, mostrando homogeneidade de todas as amostras testadas (esquerda) e amplificação de vários fragmentos (direita). (B) parcelas de amplificação para cada amostra para um miRNA. Esta pode ser tanto de corante Cianina DLP ou métodos de detecção. (C) representação em gráfico de barras de genes de referência adequados para análise de ARNm ARHGDIA (topo) e para a análise de miARN ARNnp de U6 (inferior), não apresentando expressão diferencial significativa entre as amostras (D). resultados miRNA qPCR para ilustrar a comparação dos níveis de expressão relativa de miR-135 ao longo de um curso de tempo. Figura 6D é reproduzido a partir Katchy et al. 1 com permissão de Elsevier. Os valores são geralmente a média de exper separadoiments (duplicatas biológicos) ± SD. Teste t de Student, é utilizado para demonstrar significado: * p &lt;0,05.

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

O objetivo geral deste procedimento é definir os microRNAs que os receptores de estrogênio podem regular. Isso é realizado primeiramente preparando as células para uma resposta máxima ao estrogênio, cultivando-as até uma confluência ideal e exaurindo a atividade estrogênica. O segundo passo é induzir a atividade transcricional dos receptores de estrogênio mediante tratamento com estradiol durante o número necessário de pontos temporais.Controles apropriados são incluídos para comparações. Em seguida, o RNA, incluindo a população de micro-RNA, é extraído e convertido em DNAc conhecido por ser regulado pelo estrogênio. Os genes-alvo são então medidos utilizando qPCR para confirmar que o protocolo de tratamento foi bem-sucedido.O passo final é determinar o padrão de expressão de microRNA em todo o genoma utilizando tecnologias de triagem em larga escala. Por fim, realiza-se uma análise confirmatória utilizando QPCR. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer de mama, como se e como o estrogênio afeta a expressão de microRNA.Embora este método possa fornecer informações sobre o câncer de mama, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros tipos de câncer ou tipos celulares que expressem o receptor de estrogênio alfa ou bitter. As células MC sete utilizadas neste estudo são preparadas cinco dias antes do tratamento em uma cabine de segurança estéril. Remova o meio do frasco T 75 utilizando uma pipeta de Pasteur estéril conectada a um vácuo.Lave suavemente as células aderidas duas vezes com PBS e desprenda as células usando tripsina. Conte as células utilizando um contador de células de acordo com o protocolo do fabricante. Rotule seis placas de 100 mililitros e adicione 10 mililitros de meio a cada placa.Plaque cerca de 2 milhões de células por placa e distribua as células agitando suavemente a placa. Incube as células por 24 a 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ até que as células estejam aproximadamente 80% confluentes. Dois a quatro dias depois, retire as células do incubador a 37 graus Celsius e observe ao microscópio para garantir que estejam aproximadamente 80% confluentes.A confluência celular é um fator importante porque influencia o contato célula a célula e comportamentos como sinalização célula a célula e proliferação. Lave as células duas vezes com PBS e, em seguida, adicione o meio apropriado com 5% de FBS que foi filtrado para remover compostos estrogênicos. Incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 no dia seguinte, utilizando FBS tratado com carvão ativado Dexter ou D-C-C-F-B-S.Lave as células duas vezes com PBS e adicione o meio apropriado de 0,5% D-C-C-F-B-S, incubando as células por mais 48 horas no dia do tratamento. Prepare os reagentes para o tratamento celular em um tubo cônico de 50 mililitros. Primeiro, adicione 30 mililitros do meio apropriado de 0,5% D-C-C-F-B-S, seguido por três microlitros de uma solução estoque de ligante E dois a 0,1 milimolar, e lave as células duas vezes com PBS.Certifique-se de remover o máximo possível do PBS. Misture suavemente o conteúdo de cada tubo e adicione 10 mililitros às células em cada placa. Deve haver um ligante por placa.Incube as células a 37 graus Celsius e 5% CO2 por um período escolhido entre zero e 72 horas. Substitua o meio conforme necessário após a conclusão do tratamento pelo período desejado. Remova as placas do incubador e leve-as para uma câmara de segurança. Como este procedimento utiliza uma solução tóxica de tiocianato de guanidínio e fenol, use equipamento de proteção individual apropriado, lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione um a dois mililitros de solução de tiocianato de guanidínio e fenol às células em cada placa. Certifique-se de que o volume das células não ultrapasse 10% do volume da solução de tiocianato de guanidínio e fenol e de que a placa esteja completamente coberta pela solução.Deixe as células em repouso por um minuto. Em seguida, use um espátula de borracha para desprender as células e transferi-las para um microcentrífugo. As células em tubo podem ser armazenadas nesta solução a menos 80 graus Celsius por semanas.A extração de RNA de alta qualidade é muito importante para o sucesso deste procedimento. Portanto, os passos seguintes devem ser realizados em condições livres de RNase. Para extrair o RNA total de cada tratamento, vortexe uma mistura celular por um minuto e centrifugue rapidamente.Adicione 200 microlitros de clorofórmio por um mililitro de solução de tiocianato de guanidina fenol. Agite em vórtex por 15 segundos e incube por dois a três minutos à temperatura ambiente, centrifugue a 11.000 RPM e quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.Adicione 1,5 volume de etanol a 100% e misture por pipetagem. Transfira a solução para uma coluna de centrifugação e purifique o RNA por meio de purificação com coluna de centrifugação para microRNA, seguida de degradação do DNA com DNase 1, conforme protocolo do fabricante. Posteriormente, o RNA é eluído em 60 microlitros de água livre de RNAses, utilize um a dois microlitros do RNA para quantificação e análise de qualidade, e armazene o restante do RNA a menos 80 graus Celsius.Após confirmar que o tratamento das células resultou na regulação de alvos conhecidos responsivos ao estrogênio, como perfis de microRNA de mRNA, realiza-se o perfilhamento de microRNA utilizando tanto o microfluídico de fluxo micropotência, microarranjos e sondas duplamente marcadas, quanto os arranjos de baixa densidade ou D-L-P-L-D-A para realizar o perfilhamento de microRNA usando D-L-P-L-D-A. Retire as placas D-L-P-L-D-A da geladeira e deixe-as em repouso à temperatura ambiente enquanto realiza a reação de transcrição reversa para gerar CDNA a partir das amostras de RNA. Quando as placas D-L-P-L-D-A atingirem a temperatura ambiente, carregue 100 microlitros de CDNA misturado com as sondas duplamente marcadas e o mix mestre de PCR em cada uma das oito portas de preenchimento de uma placa.Centrifugue as placas do arranjo. Abra brevemente o sistema Q-R-T-P-C-R e verifique se o bloco é para uma placa de 384 poços. Configure a corrida.Utilizando o software SDS, selecione a quantificação relativa. Selecione o número do poço e o tipo de matriz e insira descrições das amostras para definir os poços. Execute a matriz utilizando as condições padrão de ciclagem térmica.Quando a execução terminar, salve os resultados, exporte-os para o Microsoft Excel e guarde-os para análises posteriores. Um método para confirmar as regulações do micro RNA é por meio da análise de cianeto D-Q-P-C-R. O primeiro passo é projetar os iniciadores para a sequência do micro RNA maduro, cujo iniciador direto pode ser obtido no merebased.org.Converta todas as UES para ts a seguir, prepare o CD NA colocando um micrograma de RNA total em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Inclua um controle negativo com água em vez de RNA total. Siga as instruções para a cauda de poli A e para a primeira fita de CD nna.Síntese de micro RNA a partir de uma síntese de cDNA de primeira fita de micro RNA e protocolo Q-R-T-P-C-R. Dilua o CD NA resultante de um para 10 com água purificada e armazene a menos 20 graus Celsius. Obtenha 1 placa de reação de 96 poços.Prepare a mistura mestra A-Q-P-C-R. Para cada poço da micro R-N-A-Q-P-C-R mestra, adicione dois picomols de cada iniciador específico sentido direto e do iniciador universal. Cinco microlitros da mistura mestra 2X-Q-P-C-R e água purificada.Aliquote a mistura em cada poço. Finalmente, adicione 16 nanogramas de poli a CD NA para cada amostra e inclua controles negativos. O volume final da reação deve ser de 10 microlitros por poço. Certifique-se de que haja poços triplicados para cada amostra, para cada micro RNA, para réplicas técnicas, bem como para os controles negativos.Além disso, inclua um ou vários genes de referência, normalmente U six s nrp, RNA e/ou um micro-RNA que não seja alterado no software do sistema Q-R-T-P-C-R. Atribua o marcador e o alvo. Insira o volume da reação. Selecione o método do ciclo limiar comparativo e defina as poças das amostras.Execute as placas usando as configurações padrão da corrida. Certifique-se de que uma análise de curva de dissociação seja realizada para todas as corridas com corante ciano ao final do procedimento. Salve os resultados e exporte todos os dados, incluindo os valores de CT, para o Microsoft Excel.A extração eficiente de RNA de alta qualidade das amostras é um fator importante para o sucesso deste estudo. Após a extração, as concentrações de RNA são medidas com um espectrofotômetro, conforme mostrado neste resultado representativo. Cada pico ilustrado no painel superior representa uma amostra e um processo de extração bem-sucedido que resulta em RNA puro.Em contraste, um RNA mal extraído, ilustrado no painel inferior, não mostra um pico de absorção claro em 260 nanômetros. Para o controle de qualidade do RNA, a integridade do RNA foi medida e os resultados foram comparados com uma escada de RNA. Os RNAs 18 S e 28 S devem apresentar picos em uma amostra de RNA de boa qualidade, como mostrado aqui.Uma amostra de RNA degradada apresentaria picos menos definidos e uma quantidade relativa reduzida de rRNA 18S e 28S, como mostrado aqui. A análise da população de micro-NA pode ser realizada separadamente. Os resultados da matriz de microarranjo de micro-RNA a partir de uma comparação entre amostras tratadas com veículo e com E2 são representados graficamente por este mapa de calor.Mere a, mere B e mere C são regulados para cima nas amostras tratadas com E dois, conforme indicado em vermelho, enquanto mere D, mere e, mere F e mere G são regulados para baixo na amostra tratada com E dois, conforme indicado em verde. A seleção do microRNA depende de sua significância e expressão. Um valor P inferior a 0,05 geralmente é considerado significativo e deve ser selecionado para validação adicional com QPCR.As matrizes de baixa densidade com sondas duplamente marcadas utilizam o método baseado em A-Q-P-C-R para triagem de microRNAs regulados. Em um formato de 384 poços, os gráficos de amplificação de microRNA a partir dos resultados do D-L-P-L-D-A são mostrados aqui. A amplificação de microRNAs expressos é indicada pelo aumento dos valores de RN.As validações podem ser realizadas utilizando dois métodos de detecção por QPCR para evitar viés metodológico e permitir uma confirmação e investigação completas das regulações de micro RNAs. O primeiro método utiliza a detecção com corante cianeto para analisar a curva de dissociação de um micro RNA como controle da especificidade da amplificação. A amplificação do fragmento pretendido resultará em um pico uniforme bem definido, conforme mostrado no painel esquerdo.Vários picos seriam observados se o iniciador for inespecífico ou se forem formadas quantidades específicas de dímero de iniciador, conforme ilustrado no painel direito. Se isso ocorrer, os dados não podem ser utilizados para análise de expressão. O segundo método, sondas duplamente marcadas, a análise de QPCR é mais específica, pois apenas a amplificação do microRNA alvo é detectada nos gráficos de amplificação de cada alvo.O microRNA pode ser observado como mostrado aqui para ambos os ensaios de QPCR. É necessária uma comparação com um gene de referência para determinar a expressão relativa de genes entre duas amostras. Um exemplo de um gene de referência adequado nessas linhagens celulares de câncer de mama é A-R-H-G-D-I-A-A RO GDP dissociation inhibitor.Como observado nesta figura, o nível de mRNA de A-R-H-G-D-I-A não é alterado entre as amostras tratadas com veículo e com ligante. Um gene de referência amplamente aceito para análise de microRNA é o U six snrp, RNA. O RNA nuclear pequeno não codificante, com aproximadamente 110 nucleotídeos de comprimento, que atua no pré-m.Uma splicing observado nesta figura mostra que os níveis de expressão de U seis são aproximadamente os mesmos entre as amostras apresentadas, permitindo assim o cálculo dos níveis variáveis de micro RNA. Esta figura final mostra uma representação gráfica dos resultados de Q-PCR de micro RNA de células tratadas com veículo e com E dois, comparando os níveis relativos de expressão de um micro RNA específico, miR-135a, ao longo de um período de tempo. Esse micro RNA foi detectado como não regulado até 24 horas após o tratamento com E dois, mas uma regulação significativa foi detectada 72 horas após o tratamento, seguindo este procedimento.Outros métodos, como a imunoprecipitação da cromatina do receptor N SDR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se o microRNA é diretamente regulado pelo receptor por meio da ligação a regiões cis-reguladoras da cromatina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar de forma robusta a regulação mediada pelo estrogênio dos microRNAs. É muito importante realizar os diversos controles e a replicação das etapas conforme descrito neste protocolo, a fim de assegurar que você detecte regulações reais e não variações biológicas ou técnicas.

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